Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Asterix Постоянный участник |
У меня уже 2-ой раз пропадает кусок из ДНК Амплифицирую [Cas9], оптимизированный под арабидопсис, навешиваю на него побрякушки по концам , ну 100 пар оснований всего екстра , амплифицирую с плазмидной ДНК , из [ AddGene] [pDe-Cas9] . должно быть 4200, а на форезе 3700.. Пропадает солидный кусок ДНК. Что за черт такой ? Я это дело даже клонировал в плазмиду .. и все равно размер вставки явно не тот. |
guest: petr IP-штамп: frpzMrmKUuRMg гость |
|
Asterix Постоянный участник |
Но тут еще одна загадка образовалась , вырезал из геля эти 4100 и порезал значит концы, почистил на силика-колонке .. проверяю на геле - что за черт - 6 000 размер .. Смешал образец с маркерами и на одной дорожке прогнал .. таки 4100.. От ведь какие чудеса с этим [Cas9] происходят. Но у меня правда [Gel-Red] прямо в буфере для нанесения , с ним такое бывает иногда .. он может менять мобильность ДНК. |
guest: petr IP-штамп: frpzMrmKUuRMg гость |
ТАКом да Cas9 ПЦРить... Замучаешься потом клон без мутаций выбирать. Мне иногда и ExTaq такаровская ошибки лепит, аж зло берет, а с Таком я бы и не брался даже |
Asterix Постоянный участник |
У нас вон было дело альфа маннозидазу из плесени тоже все клонировали и клонировали и всяко разно лигировали .. и работала прекрасно пока я ее не отсиквенировал всю полностью ... а там аж 11 мутаций включая и еще дополнительный сайт гликозилирования .. И ничего , прекрасно пахала . Мне оно за интерес же , а не для диссера или там публикации. просто прикольную конструкцию делаю а эта с [ Cas9] будет у меня заодно и контролем позитивным для другого экперимента. Черт его знает что там происходит , странное что-то с этим геном творится. |
genseq Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Предлагаю: 1. Менять ваш пруфридинг на фьюжин пруфридинг - на порядок быстрее синтез. 2. Делать первый цикл как требует специфическая часть праймера с темп. отжига 55-60 град., а остальные циклы - с 70-75 на отжиге (синтезе) и все. Плотник, ты меня разочаровал ©
|
Asterix Постоянный участник |
простая Так-пол похоже все проблемы решила , ну надеюсь , посмотрю сегодня чего там налигировалось.. Ну кроме сдвига в мобильности .. но это я и ранее наблюдал иногда с [Gel-Red], он этим собственно и неудобен . А красить после фореза мне лень. Собственно исходная система -то рабочая есть , там с [GoldenGate] клонирование , котороре переносит [gRNA] в плазмиду с [Cas9]. Я просто в другой вектор и под другой промотор переношу этот Кас9 ну и еще добавил ему сигналов всяких. и .. красивый такой паровозик с саморасщеплением получается , если получится. Но если это все таки заработает как планировалось .. то мне будет приятно это видеть. |
Asterix Постоянный участник |
Мистика какая-то с этим [Cas9 ] ... посмотрю хоть что там в этот клон заклонировалось .. Не может такого быть что какя-то експрессия с криптик-промотора или сама последовательность ДНК как-то влияет на бактерии? vektor obychnyj pUC , kletki Top10, himicheski kompetentnye |
Asterix Постоянный участник |
кусок в почти 1кб отсуствует , причем именно из вставки , то есть из [Cas9]. Все дело похоже в матрице , там делеция . Таки не подвело меня мое чутье .. подсунули нам с широкой дружеской улыбкой и задаром другой вектор, видимо нерабочий , а не тот с которым они реально работают.. Вот ведь коллеги то по-университету ... змеи какие бывают, но я и это раскусил , не впервой чай. у нас тут подобные подлянки очень в ходу... Но однако же 2 месяца понадобилось на все это , чтоб понять что это не случайный сдвиг .. Ну не могу же я все что мне дают пересиквенировать заново, надо же и доверять людям Другой-то вектор они вроде нормальный дали , хотя кто занет , кто знает А представье себе аспирант бы какой это делал вместо меня ? у него же чутья подобного нет, и выяснил бы через год, что странно как-то что ничего не работает. Ну и все. Вообще нам везет на подобные дружеские шуточки , из Новой Зеландии тоже прислали вектор для трансформации плесени .. все опубликовано , но ничего не работает .. |
электрик василий5 |
(-Ъ- @ 20.05.2020 12:09) Пруфридинг полимераз много, назовите какой, это важно. Во-вторых, какую программу ПЦР делали, а это еще важнее. Если ПЦРили по классике с 55-60 град. и 30 сек и более на отжиге - результат ожидаемый. Представляете как ведут себя ваши "мегапраймеры" (длиной 120-130 н.) при темп. отжига. Pfu, например, включает свою 3-5 экзонуклеазную активность одновременно полимеразной, благо для этого праймеры создают условия (в виде селф- и кроссдимеров). Предлагаю: 1. Менять ваш пруфридинг на фьюжин пруфридинг - на порядок быстрее синтез. 2. Делать первый цикл как требует специфическая часть праймера с темп. отжига 55-60 град., а остальные циклы - с 70-75 на отжиге (синтезе) и все. Плотник, ты меня разочаровал © "Пруфридинг полимераз много"© знакыч |
электрик василий5 |
(genseq @ 20.05.2020 10:05) А повторов или шпилек там нет? Они могут давать варианты отжига, сильно отличающиеся по подвижности от простой двунитевой структуры. генсекыч посадить праймер на шпильку любимое занятие киндеров |
электрик василий5 |
(электрик василий5 @ 23.05.2020 14:04) |
Asterix Постоянный участник |
как раз похоже на то, но странно что никто у них там на это внимание не обратил до сих пор ... видимо работает и ладно ... а то что там другой [Cas9] в векторе .. никто и не видит. Или хотят таким образом узнать у меня .. а таки работает оно или нет ? им самим проверять лень или некогда . .............. The orthologous CRISPR/Cas systems described here were able to mediate efficient editing in A. thaliana plants and could also be applied to induce targeted DSBs at any desired locus. Applications for which these orthologues will be useful include target genes in which SpCas9 PAM sequences are not present and approaches in which vector sizes are limited. Both orthologues described here are 1 kb smaller than the commonly used SpCas9 (3.4 kb for St1Cas9 and 3.2 kb for SaCas9 compared with 4.2 kb for SpCas9). The use of these orthologues in complex genetic approaches, such as simultaneous applications of different CRISPR/Cas‐associated or ‐fused enzyme activities, will be of special importance in the future. |
Asterix Постоянный участник |
|
Asterix Постоянный участник |
The vectors used in this study were based on our previously described CRISPR/Cas system (Fauser et al ., 2014; Schiml et al ., 2014). These Gateway® compatible vectors contain either a destination cassette (pDe‐St1_Cas9, pDe‐Sa_Cas9) or an entry cassette (pEn‐St1_Chimera, pEn‐Sa_Chimera). Therefore, orthologous Cas9 ORFs from S. thermophilus and S. aureus were codon‐optimised for A. thaliana, synthesized by GeneArt® (Life Technologies Corporation, www.lifetechnologies.com) and flanked by Asc I recognition sites. These ORFs were transferred into the pDe‐Cas9‐D10A vector by exchanging the S. pyogenes Cas9 ORF with St1Cas9 or St1Cas9 using Asc I to create pDe‐St1_Cas9 and pDe‐Sa_Cas9, respectively. The destination vectors harbour a kanamycin resistance cassette (npt II) as previously described for pDe‐Cas9‐D10A (Fauser et al ., 2014). The entry vectors were also assembled by GeneArt® and harboured species‐specific sgRNAs. Spacers can be introduced via Bbs I as previously described (Fauser et al ., 2014). For analysis of β‐glucuronidase activity with SaCas9 constructs, the oligonucleotides JS 233 and JS 234 were used for oligo‐annealing and subsequent cloning into pEn‐Sa_Chimera (all oligonucleotides used in this study are listed in Table S1). Cross‐species constructs for β‐glucuronidase activity assays were assembled by pairing destination vectors of one species with entry vectors of another species, for example pDe‐Sa_Cas9 with pEn_Chimera or pDe_Cas9 with pEn‐Sa_Chimera vectors. |
Asterix Постоянный участник |
7741 GATATCGGAA TCACCTCTGT GGGATACGGA ATCATCGATT ACGAGACTAG GGATGTGATC 7801 GATGCTGGTG TGAGACTCTT CAAAGAGGCT AACGTTGAGA ACAACGAGGG AAGAAGGTCT 7861 AAGAGGGGAG CTAGAAGGCT CAAGAGAAGA AGAAGGCACA GAATCCAGAG GGTGAAGAAG 7921 CTCCTCTTCG ATTACAACCT CCTCACCGAT CACTCTGAGC TTTCTGGAAT CAACCCTTAC 7981 GAGGCAAGAG TGAAGGGACT CTCTCAGAAG TTGTCTGAGG AAGAGTTCTC TGCTGCTTTG 8041 CTCCACCTTG CTAAGAGAAG GGGTGTGCAT AACGTGAACG AGGTGGAAGA GGATACCGGA 8101 AACGAGCTTT CTACCAAAGA GCAGATCTCT AGGAACTCTA AGGCTCTCGA AGAGAAGTAC 8161 GTGGCAGAGC TTCAGCTTGA GAGACTCAAG AAAGATGGTG AGGTGAGGGG ATCTATCAAC 8221 AGGTTCAAGA CCTCTGATTA CGTGAAAGAA GCTAAGCAGC TCCTCAAGGT GCAGAAGGCT 8281 TACCATCAGC TCGATCAGTC TTTCATCGAT ACCTACATCG ATCTTCTCGA GACTAGAAGG 8341 ACCTACTACG AGGGACCTGG TGAAGGATCT CCATTCGGAT GGAAGGATAT CAAAGAATGG 8401 TACGAGATGC TCATGGGACA CTGCACTTAC TTCCCTGAAG AACTCAGATC TGTGAAGTAC 8461 GCTTACAACG CTGATCTCTA CAACGCTCTT AACGATCTCA ACAACCTCGT GATCACCAGG 8521 GATGAGAACG AGAAGCTTGA GTACTACGAG AAGTTCCAGA TCATCGAGAA CGTGTTCAAG 8581 CAAAAGAAGA AGCCTACCCT CAAGCAGATC GCTAAAGAGA TCCTTGTTAA CGAGGAAGAT 8641 ATCAAGGGAT ACAGGGTGAC CTCTACCGGA AAGCCTGAGT TCACTAACCT CAAGGTTTAC 8701 CACGATATTA AGGATATTAC CGCTAGAAAA GAGATTATTG AGAACGCTGA GCTTCTCGAT 8761 CAAATCGCTA AGATCCTTAC CATCTACCAG TCATCTGAGG ATATCCAAGA GGAATTGACC 8821 AACCTCAACT CAGAGCTTAC CCAAGAAGAG ATCGAGCAGA TCAGTAACTT GAAGGGTTAC 8881 ACCGGAACCC ACAACCTCTC ACTCAAGGCT ATCAACCTCA TCCTCGATGA GCTTTGGCAC 8941 ACCAACGATA ACCAGATCGC AATCTTCAAC AGACTCAAGC TCGTGCCTAA GAAAGTGGAT 9001 CTCTCTCAGC AGAAAGAGAT TCCTACCACC CTCGTGGATG ATTTCATCCT CTCACCTGTT 9061 GTGAAGAGAT CTTTCATCCA GTCTATCAAG GTGATCAACG CTATTATCAA GAAATACGGA 9121 CTCCCTAACG ATATCATCAT CGAGTTGGCT AGGGAAAAGA ACTCAAAGGA TGCTCAAAAG 9181 ATGATCAACG AGATGCAGAA GAGAAACAGG CAGACCAACG AGAGGATCGA AGAGATCATC 9241 AGGACCACCG GAAAAGAGAA CGCTAAGTAC CTCATTGAGA AGATCAAGCT CCACGATATG 9301 CAAGAGGGAA AGTGCCTCTA CTCTCTCGAG GCTATCCCTC TTGAGGATCT CCTTAACAAC 9361 CCTTTCAACT ACGAAGTGGA TCACATCATC CCTAGATCTG TGTCTTTCGA TAACTCTTTC 9421 AACAACAAGG TGCTCGTGAA GCAAGAGGAA AACTCTAAGA AGGGTAACAG GACCCCTTTC 9481 CAGTACCTCT CTTCATCTGA TTCTAAGATC TCATACGAGA CTTTCAAGAA GCACATCCTC 9541 AACCTCGCTA AGGGAAAGGG TAGGATCTCT AAGACAAAGA AAGAGTACCT TCTCGAGGAA 9601 AGGGATATCA ACAGATTCTC TGTTCAGAAG GATTTCATCA ACAGAAACCT TGTGGATACC 9661 AGGTACGCTA CCAGGGGTCT TATGAACCTT CTCAGGTCTT ACTTCAGGGT GAACAACCTT 9721 GATGTGAAGG TGAAGTCAAT CAACGGTGGA TTCACCTCAT TCCTTAGAAG AAAATGGAAG 9781 TTTAAGAAAG AGAGGAACAA GGGTTATAAG CACCACGCTG AGGATGCTCT CATTATCGCT 9841 AACGCAGATT TCATTTTCAA AGAGTGGAAG AAGTTGGATA AGGCTAAAAA GGTGATGGAA 9901 AACCAGATGT TCGAGGAAAA GCAGGCTGAG TCTATGCCTG AGATCGAGAC TGAGCAAGAG 9961 TACAAAGAAA TCTTCATCAC CCCTCACCAG ATCAAGCACA TCAAAGATTT CAAGGATTAC 10021 AAGTACTCTC ACAGAGTGGA TAAGAAGCCA AACAGAGAGC TTATCAACGA TACCCTCTAC 10081 TCAACCAGAA AGGATGATAA GGGAAACACC CTCATCGTGA ACAATCTCAA CGGACTCTAC 10141 GATAAGGATA ACGATAAGCT CAAGAAGCTC ATTAACAAGT CTCCAGAGAA GTTGCTCATG 10201 TACCACCACG ATCCTCAGAC CTACCAAAAG CTCAAGCTCA TCATGGAACA GTACGGTGAT 10261 GAGAAGAACC CTCTCTACAA GTATTACGAG GAAACCGGTA ACTACCTCAC CAAGTACTCA 10321 AAAAAGGATA ATGGACCTGT GATCAAGAAG ATTAAGTACT ACGGAAACAA GCTCAACGCA 10381 CACCTCGATA TCACCGATGA TTACCCTAAC AGTAGAAACA AGGTGGTGAA GCTTTCACTC 10441 AAGCCTTACA GGTTCGATGT GTACCTCGAT AACGGTGTGT ACAAGTTCGT GACCGTGAAG 10501 AACCTCGATG TTATCAAAAA AGAAAACTAC TATGAGGTTA ACTCTAAGTG CTACGAGGAA 10561 GCTAAGAAGT TGAAGAAGAT CTCTAACCAG GCAGAGTTCA TTGCTTCATT CTACAACAAC 10621 GATCTTATCA AGATTAACGG TGAGCTTTAC AGGGTTATCG GAGTGAACAA CGATTTGCTC 10681 AACAGGATCG AGGTGAACAT GATTGATATC ACCTACAGGG AATACCTCGA GAATATGAAC 10741 GATAAGAGGC CTCCTAGAAT CATCAAGACT ATCGCTTCTA AGACCCAGAG TATCAAGAAG 10801 TACTCTACCG ATATCCTCGG AAACCTCTAC GAGGTTAAGT CAAAGAAGCA CCCTCAGATC 10861 ATTAAGAAGG GATCAAGGGC TGATCCTAAG AAGAAGAGGA AGGTTTGA Сообщение было отредактировано Asterix - 23.05.2020 18:10 |
Asterix Постоянный участник |
Оказывается есть 3 [pDE-Cas] с разными нуклеазами и все синтетические и оптимизированные под растения, 4.1, 3.4 , 3.2 кб размером. У Аддгена есть в наличии только один вариант , самый распространеный. вот тот что 4.1. Сами они плазмиду эту не пересиквенировали , просто 3 коротких рида сделали что мол похоже что вектор [backbone ] именно тот что заявлен. Но разница эта хитрая , на карбокси -конце у всех стоит одинаковый сигнал ядерной локалицации с спейсером, Именно к нему у меня праймер с дополнительным сайтом рестрикции. Хотя на самом конце есть неспаренны 2 нуклеотида , но самый последний комплементарный .. Что-то я таки вышел на одну аминокислоту за пределы этого сигнала , а она уже разная у всех . На другом конце они довольно разные , но с 7-примерно аминокислоты одинаковые там идут сиквенсы на какое-то растояние , и мой другой супердлинный праймер как раз заканчивается там на 10 нуклеотидов полной гомологии между всеми тремя генами. В такой ситуации ПЦР должна идти плохо , но вот как-то таки идет и с пруф-ридинговой и с обычной [Taq] Только размер продукта что-то не тот что ожидается. Ну что ж , будем выяснять .. что у нас там , таки другой [Cas9] скорее всего из стафилокка золотистого , судя по размеру вставки.. или же таки делеция в 1кб в [Cas9] из Стафиллококка пиогенного... Вполне могли авторы схитрить и послать в Аддген другую свою плазмиду .. там сложно что-то заметить так навскудку , огромная плазмида же. но зато те кто купились будут проверять их новую конструкцию на своем опыте . В принципе меня оно устраивает , но однако ... лучше бы это все знать . Хотя я бы тогда наверное предпочел начать с проверенной версии [Cas9]. А вдруг они не работает или плохо работает? и что тогда ? У китайцев есть подобная оптимизировання под арабидопсис версия обычного [Cas9], но они ее никому не дают. Я вот решил повторить ту китайскую конструкцию просто быстренько модифицировав то что в легком доступе есть , чисто для себя сделать ... и вот на тебе ... все не так просто оказалось. Подвох пришел откуда и не ждали. |
электрик василий5 |
|
электрик василий5 |
|
Asterix Постоянный участник |
Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших коллег и шишки набивают.. Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет .. если сможет пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк . Хотя это конечно добавит ему пару годиков на диссертационную работу. Но а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную. Никому нельзя доверять в научной тусовке . Мне можно. |
электрик василий5 |
(genseq @ 20.05.2020 10:05) А повторов или шпилек там нет? Они могут давать варианты отжига, сильно отличающиеся по подвижности от простой двунитевой структуры. а может праймеры не из той банки капнул |
электрик василий5 |
(Asterix @ 23.05.2020 23:18) Я тут под видом вопроса , рассказываю молодежи как оно вот бывает , опытом делюсь. Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших коллег и шишки набивают.. Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет .. если сможет пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк . Хотя это конечно добавит ему пару годиков на диссертационную работу. Но а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную. Никому нельзя доверять в научной тусовке . Мне можно. тоже мне пэнсионэр |
электрик василий5 |
(Asterix @ 23.05.2020 23:18) Я тут под видом вопроса , рассказываю молодежи как оно вот бывает , опытом делюсь. Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших коллег и шишки набивают.. Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет .. если сможет пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк . Хотя это конечно добавит ему пару годиков на диссертационную работу. Но а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную. Никому нельзя доверять в научной тусовке . Мне можно. недавно ты говорил что ты в Бельгии на социале с 2008 |
Asterix Постоянный участник |
Неужели вы и взаравду думаете что человеку открыто пишушему в сети про биотерроризм платят социал , а не отправили уже давно бы куда подальше с государственных харчей .. ну В Россию например ... Там биотеррористы наверное нужнее чем в Бельгии. Ну если логически рассудить-то. Зачем Бельгии кормить русского биотеррориста? |
Asterix Постоянный участник |
(guest: petr @ 19.05.2020 21:35) вот дошел уже и то такой точки , там есть сайты [EcoRI] и [StuI] на концах этого [ Cas9] , причем онио везде есть во всех этих плазмидах. В понедельник порежу.. гляну на то что в Плазмиде сидит. А вдруг там таки 4.1кб ... вот удивление то мое как вырастет. Совсем запутаюсь в результатах. |
FFP3 |
(Asterix @ 23.05.2020 23:18) Я тут под видом вопроса , рассказываю молодежи как оно вот бывает , опытом делюсь. Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших коллег и шишки набивают.. Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет .. если сможет пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк . Хотя это конечно добавит ему пару годиков на диссертационную работу. Но а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную. Никому нельзя доверять в научной тусовке . Мне можно. "Я старый. Меня девушки не любят. — Обратитесь во Всемирную Лигу Сексуальных Реформ" © |
FFP3 |
(Asterix @ 24.05.2020 00:05) Я много что говорю , нельзя же всему верить... Это искусство такое , врать так чтоб было похоже на правду. И никогда не знаешь где я правду говорю , а где нет. Неужели вы и взаравду думаете что человеку открыто пишушему в сети про биотерроризм платят социал , а не отправили уже давно бы куда подальше с государственных харчей .. ну В Россию например ... Там биотеррористы наверное нужнее чем в Бельгии. Ну если логически рассудить-то. Зачем Бельгии кормить русского биотеррориста? выложите свои публикации в PubMed с 2008 |
FFP3 |
(Asterix @ 24.05.2020 00:05) Я много что говорю , нельзя же всему верить... Это искусство такое , врать так чтоб было похоже на правду. И никогда не знаешь где я правду говорю , а где нет. Неужели вы и взаравду думаете что человеку открыто пишушему в сети про биотерроризм платят социал , а не отправили уже давно бы куда подальше с государственных харчей .. ну В Россию например ... Там биотеррористы наверное нужнее чем в Бельгии. Ну если логически рассудить-то. Зачем Бельгии кормить русского биотеррориста? паслухай плотник а в белгии есть гидролизный спирт ? |
FFP3 |
(FFP3 @ 25.05.2020 17:48) Нет в мире совершенства! - вздохнул Лис |
Asterix Постоянный участник |
То есть как и подсказывали выше .. все дело в ПЦР.. Ну в этот раз я решил последовать мудрому совету данному свыше , там наверху в одном из ответов .. Ну то есть первый цикл 54 а потом уже 68-98 остальные 25 циклов. Посмотрим как пойдет. Чем черт не шутит , вдруг сработает? Впрочем надо наверное будет еще раз делать .. похоже я из-за спешки с этими правилами по корона вирусу котопрые ограничивают пребывание сотрудников в лабе, буфера для ПЦР туда половину налил.. ну забыл, деменция у меня от корона вируса развивается . Оно все бы и ничего наверное , но ведь и концентрация магния тоже в два раза ниже .. Завтра гляну что наПЦРилось.
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Asterix @ 26.05.2020 22:55) Ну в этот раз я решил последовать мудрому совету данному свыше , там наверху в одном из ответов .. Ну то есть первый цикл 54 а потом уже 68-98 остальные 25 циклов. ... 72-95 и минимальное время на элонгации. Это можно просчитать, но я до сих пор не знаю какая у Вас пруфридинг полимераз. |
Asterix Постоянный участник |
Сегодня посмотрел вроде ПЦР продукт вроде похож на правду, хотя все еще сомнения есть , ну поставил его резаться .. чего уж , не пропадать же , да 4 минуты я дал [extension] там 4200 максимум.. ей и пол-минуты на килобазу было бы достаточно. Продукт чистый , один. несмотря на ошибку с концентрацией буфера. Он в два раза разведен получился. Впрочем я праймеров в этот раз добавил в 5 раз больше чем обычно, все 100пмол положил в 50 мкл. Ну и поставил новые компетентные клетки растить Топ10, может в них тоже дело, прошлые я неправильно сделал , там в контроле с[ pUC19] еффективность что-то совсем плохая получилась, всего 2х10.7.. Обычно таки на порядок лучше. |
Asterix Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Asterix @ 27.05.2020 23:48) Там же черным по белому написано : in high speed DNA synthesis (15s/kb for templates of up to 5kb and 30s/kb for templates longer than 5kb). 40-50 сек, не более 1 мин!!! Это фьюжен полимераза. Почем покупал? Я пользуюсь NEB или Термофишер (Finenzyme бывший), всегда в восторге от них.
|
Asterix Постоянный участник |
Я всю жизнь делаю время с запасом .. Они там пишут про 15-30 сек на [1Kb] , но это в идеальных тестовых условиях ... а в реале там все что угодно может замедлять ее .. Много раз просто именно удлинение времени по ставнению с рекомендованным и решало проблему , вот я и привык. Этои же не первый раз я с ней клонирую длинные матрицы.. Целые плазмиды ей амплифицировал именно с избытком времени. Отлично все шло. .. но тут какая-то аномалия вот .. причем на грани .. Вроде и близко к размеру , но таки может и меньше .. ну чуток .. |
Asterix Постоянный участник |
По ходу дела намаялся и отказался от этой красоты , а полимераза вот осталась. Клонирую по-старинке теперь , [hind/bamh/xba], медленно но надежно и главное что отлично работает . А покупать специальный штамм для этого перекрест-клонирования за 600 евро как-то не захотелось.. Я же просто так в лабе работаю , в удовольствие .. От скорости моей работы ничего не зависит. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Asterix @ 28.05.2020 13:12) Я ведь не теоретизирую. У меня тоже была примерная проблема с очень длинными праймерами с торчащими нематричными 5-концами и, правда, с Pfu полимеразой (время на ПЦР программе как у Taq, т.е. очень все растянуто, полимераза медленная). Пока не сделал на отжиге какие секунды, около 10, когда на эхтеншн были минуты, проблему не устранил. Пруфридинг полимеразы не ограничиваются тем, что "тупят" концы, они видимо разгоняются дальше и успевают наломать дров укорачивая праймеры с 3-штрих конца. Хочу еще добавить, важно не перебУхать фермент в реакцию (лучше меньше да лучше), ну и как рекомендуют - 98 град (сам не понимаю?). Сообщение было отредактировано -Ъ- - 28.05.2020 13:10 |
Asterix Постоянный участник |
Вот ведь - век живи ... Но то что у меня уже два раза клонировалось совсем другое какое-то ... там 3.3 примерно .. ну никак не 4.3, даже не близко |
Asterix Постоянный участник |
Ну и да , положил в реакцию побольше праймеров в 5 раз ... вот результат и попер-то. даже если она и грызет их .. на другое место они все равно не сядут. Там плазмида же матрица , чай не геномка. Но идея с первым циклом на 54 градуса очень здравая конечно, это правильно.. Логично. просто всегда работало и так, это вот с [CAS9] незадача приключилась. |
FFP3 |
(Asterix @ 28.05.2020 13:12) Ну а в чем собственно проблема с увеличением времени на [extension] Я всю жизнь делаю время с запасом .. Они там пишут про 15-30 сек на [1Kb] , но это в идеальных тестовых условиях ... а в реале там все что угодно может замедлять ее .. Много раз просто именно удлинение времени по ставнению с рекомендованным и решало проблему , вот я и привык. Этои же не первый раз я с ней клонирую длинные матрицы.. Целые плазмиды ей амплифицировал именно с избытком времени. Отлично все шло. .. но тут какая-то аномалия вот .. причем на грани .. Вроде и близко к размеру , но таки может и меньше .. ну чуток .. "Этои же не первый раз я с ней клонирую длинные матрицы" |
Asterix Постоянный участник |
|
FFP3 |
(Asterix @ 04.06.2020 02:10) Проблема была с компетентными клетками .. очень похоже на то.. Я сделал ошибку в их приготовлении , а там не только эффективность но еще и другие осложнения Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Пруф-ридинг полимераза вопрос -- У меня 2-ой раз пропадает кусок из DNA -- |
kb1 Участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Asterix @ 04.06.2020 02:10) Проблема была с компетентными клетками .. очень похоже на то.. Я сделал ошибку в их приготовлении , а там не только эффективность но еще и другие осложнения Дал осложнения на сердце и мозг. Ни хрена ты не разобрался, Плотник Интересную статью выложил kb1, таки советую просмотреть. |
Asterix Постоянный участник |
|
kb1 Участник |
(Asterix @ 04.06.2020 14:34) Ну посмотрел ? хорошая статья, но мне-то что делать? магния поменьше класть а полимеразы побольше? И температуру повыше ? Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M) Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью.
|
Шаолинь Постоянный участник |
(kb1 @ 04.06.2020 17:59) Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M) Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью. Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью. |
Шаолинь Постоянный участник |
(kb1 @ 04.06.2020 17:59) Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M) Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью. Bacillus stearothermophilus DNA polymerase (Bst), do not slip. это изотермалка а не ПЦР |
Шаолинь Постоянный участник |
(kb1 @ 04.06.2020 17:59) Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M) Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью. Страна Советов |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |