Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Пруф-ридинг полимераза вопрос -- У меня 2-ой раз пропадает кусок из DNA --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.05.2020 01:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Пруф-ридинг полимераза вопрос

У меня уже 2-ой раз пропадает кусок из ДНК

Амплифицирую [Cas9], оптимизированный под арабидопсис, навешиваю на него побрякушки по концам , ну 100 пар оснований всего екстра , амплифицирую с плазмидной ДНК , из [ AddGene] [pDe-Cas9] . должно быть 4200, а на форезе 3700.. Пропадает солидный кусок ДНК.

Что за черт такой ?

Я это дело даже клонировал в плазмиду .. и все равно размер вставки явно не тот.
guest: petr
IP-штамп: frpzMrmKUuRMg
гость



 прочитанное сообщение 19.05.2020 20:35     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А в самой плазмиде вставка Cas9 какого размера? правильного?
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.05.2020 22:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

в самой-то должна быть правильная, рабочая плазмида же . .. И даже более того сегодня поставил с обычной ТАК-полимеразой и все получилось ..

Но тут еще одна загадка образовалась , вырезал из геля эти 4100 и порезал значит концы, почистил на силика-колонке .. проверяю на геле - что за черт - 6 000 размер ..

Смешал образец с маркерами и на одной дорожке прогнал .. таки 4100..

От ведь какие чудеса с этим [Cas9] происходят.

Но у меня правда [Gel-Red] прямо в буфере для нанесения , с ним такое бывает иногда .. он может менять мобильность ДНК.
guest: petr
IP-штамп: frpzMrmKUuRMg
гость



 прочитанное сообщение 20.05.2020 00:57     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Забавно, что размер увеличивался до 6000. А в случае когда он уменьшается, бывает что от перегруза сильного ДНКа бежит как будто она короче. Если разбавить, то бежит нормально.

ТАКом да Cas9 ПЦРить... Замучаешься потом клон без мутаций выбирать. Мне иногда и ExTaq такаровская ошибки лепит, аж зло берет, а с Таком я бы и не брался даже
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.05.2020 02:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Ну если пруфридинговая выбрасывает кусок гена, причем откуда-то изнутри, а концы и сайты на них правильные ,что делать? другого гена у меня нет ... придется надеяться что ошибки Така будут слабо влиять на результат.. ген большой , навряд ли там так уж много критических аминокислот.

У нас вон было дело альфа маннозидазу из плесени тоже все клонировали и клонировали и всяко разно лигировали .. и работала прекрасно пока я ее не отсиквенировал всю полностью ... а там аж 11 мутаций включая и еще дополнительный сайт гликозилирования .. И ничего , прекрасно пахала .

Мне оно за интерес же , а не для диссера или там публикации. просто прикольную конструкцию делаю а эта с [ Cas9] будет у меня заодно и контролем позитивным для другого экперимента.

Черт его знает что там происходит , странное что-то с этим геном творится.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.05.2020 09:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

А повторов или шпилек там нет? Они могут давать варианты отжига, сильно отличающиеся по подвижности от простой двунитевой структуры.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.05.2020 11:09     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Пруфридинг полимераз много, назовите какой, это важно. Во-вторых, какую программу ПЦР делали, а это еще важнее. Если ПЦРили по классике с 55-60 град. и 30 сек и более на отжиге - результат ожидаемый. Представляете как ведут себя ваши "мегапраймеры" (длиной 120-130 н.) при темп. отжига. Pfu, например, включает свою 3-5 экзонуклеазную активность одновременно полимеразной, благо для этого праймеры создают условия (в виде селф- и кроссдимеров).
Предлагаю:
1. Менять ваш пруфридинг на фьюжин пруфридинг - на порядок быстрее синтез.
2. Делать первый цикл как требует специфическая часть праймера с темп. отжига 55-60 град., а остальные циклы - с 70-75 на отжиге (синтезе) и все.
Плотник, ты меня разочаровал ©

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Asterix, dk
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.05.2020 12:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Ну я решил не вдаваться в эти технические хитрости , не корову же проигрываю.... Это побочный проектик , получится , ну прикольно будет , не получится так и хрен с ним.

простая Так-пол похоже все проблемы решила , ну надеюсь , посмотрю сегодня чего там налигировалось.. Ну кроме сдвига в мобильности .. но это я и ранее наблюдал иногда с [Gel-Red], он этим собственно и неудобен . А красить после фореза мне лень.

Собственно исходная система -то рабочая есть , там с [GoldenGate] клонирование , котороре переносит [gRNA] в плазмиду с [Cas9]. Я просто в другой вектор и под другой промотор переношу этот Кас9 ну и еще добавил ему сигналов всяких. и .. красивый такой паровозик с саморасщеплением получается , если получится.
Но если это все таки заработает как планировалось .. то мне будет приятно это видеть.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.05.2020 13:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Мдаа, из семи клонов только один со вставкой примерно ожидаемого размера .. И растет как-то плохо что ли...

Мистика какая-то с этим [Cas9 ] ... посмотрю хоть что там в этот клон заклонировалось ..

Не может такого быть что какя-то експрессия с криптик-промотора или сама последовательность ДНК как-то влияет на бактерии?

vektor obychnyj pUC , kletki Top10, himicheski kompetentnye
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.05.2020 00:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Ну картина проясняется похоже , смена полимеразы ничегошеньки не изменила в результате

кусок в почти 1кб отсуствует , причем именно из вставки , то есть из [Cas9]. Все дело похоже в матрице , там делеция .

Таки не подвело меня мое чутье .. подсунули нам с широкой дружеской улыбкой и задаром другой вектор, видимо нерабочий , а не тот с которым они реально работают.. Вот ведь коллеги то по-университету ... змеи какие бывают, но я и это раскусил , не впервой чай.

у нас тут подобные подлянки очень в ходу...

Но однако же 2 месяца понадобилось на все это , чтоб понять что это не случайный сдвиг .. Ну не могу же я все что мне дают пересиквенировать заново, надо же и доверять людям

Другой-то вектор они вроде нормальный дали , хотя кто занет , кто знает

А представье себе аспирант бы какой это делал вместо меня ? у него же чутья подобного нет, и выяснил бы через год, что странно как-то что ничего не работает. Ну и все.

Вообще нам везет на подобные дружеские шуточки , из Новой Зеландии тоже прислали вектор для трансформации плесени .. все опубликовано , но ничего не работает ..
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 12:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(-Ъ- @ 20.05.2020 12:09)
Ссылка на исходное сообщение  Пруфридинг полимераз много, назовите какой, это важно. Во-вторых, какую программу ПЦР делали, а это еще важнее. Если ПЦРили по классике с 55-60 град. и 30 сек и более на отжиге - результат ожидаемый. Представляете как ведут себя ваши "мегапраймеры" (длиной 120-130 н.) при темп. отжига. Pfu, например, включает свою 3-5 экзонуклеазную активность одновременно полимеразной, благо для этого праймеры создают условия (в виде селф- и кроссдимеров).
Предлагаю:
1. Менять ваш пруфридинг на фьюжин пруфридинг - на порядок быстрее синтез.
2. Делать первый цикл как требует специфическая часть праймера с темп. отжига 55-60 град., а остальные циклы - с 70-75 на отжиге (синтезе) и все.
Плотник, ты меня разочаровал ©



 "Пруфридинг полимераз много"©

знакыч beer.gif beer.gif beer.gif
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 13:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(genseq @ 20.05.2020 10:05)
Ссылка на исходное сообщение  А повторов или шпилек там нет? Они могут давать варианты отжига, сильно отличающиеся по подвижности от простой двунитевой структуры.

генсекыч посадить праймер на шпильку любимое занятие киндеров beer.gif
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 13:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(электрик василий5 @ 23.05.2020 14:04)
Ссылка на исходное сообщение  генсекыч посадить праймер на шпильку любимое занятие киндеров  beer.gif

https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure...1/Predict1.html
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.05.2020 15:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

похоже я нашел где собака .. ну как обычно аспиранты перепутали пробирки или не обратили внимание на разницу [Sp - Sa]... хотя может и неслучайно это все

как раз похоже на то, но странно что никто у них там на это внимание не обратил до сих пор ... видимо работает и ладно ... а то что там другой [Cas9] в векторе .. никто и не видит.

Или хотят таким образом узнать у меня .. а таки работает оно или нет ? им самим проверять лень или некогда .

..............
The orthologous CRISPR/Cas systems described here were able to mediate efficient editing in A. thaliana plants and could also be applied to induce targeted DSBs at any desired locus. Applications for which these orthologues will be useful include target genes in which SpCas9 PAM sequences are not present and approaches in which vector sizes are limited. Both orthologues described here are 1 kb smaller than the commonly used SpCas9 (3.4 kb for St1Cas9 and 3.2 kb for SaCas9 compared with 4.2 kb for SpCas9). The use of these orthologues in complex genetic approaches, such as simultaneous applications of different CRISPR/Cas‐associated or ‐fused enzyme activities, will be of special importance in the future.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  23.05.2020 15:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

An interesting question to consider is the extent of the off‐target effects of the St1 and SaCas9 orthologues. Both orthologues require longer PAMs than the SpCas9; six nucleotides (‘NNAGAA’ or ‘NNGGAA’) are required for St1Cas9, and five to six nucleotides (‘NNGGGT’ or ‘NNGAA’) are required for SaCas9, whereas only three nucleotides (‘NGG’) are required for SpCas9 target recognition, which should significantly reduce the frequency of off‐target cutting compared with SpCas9. The downside to this higher specificity is the resulting decrease in potential target sites. To exclude off‐target effects beforehand, one could also apply the paired nickase approach to the orthologous Cas9 proteins, as we were able to do in plants using the SpCas9 CRISPR/Cas system (Schiml et al ., 2014).
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  23.05.2020 15:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

T‐DNA constructs

The vectors used in this study were based on our previously described CRISPR/Cas system (Fauser et al ., 2014; Schiml et al ., 2014). These Gateway® compatible vectors contain either a destination cassette (pDe‐St1_Cas9, pDe‐Sa_Cas9) or an entry cassette (pEn‐St1_Chimera, pEn‐Sa_Chimera). Therefore, orthologous Cas9 ORFs from S. thermophilus and S. aureus were codon‐optimised for A. thaliana, synthesized by GeneArt® (Life Technologies Corporation, www.lifetechnologies.com) and flanked by Asc I recognition sites. These ORFs were transferred into the pDe‐Cas9‐D10A vector by exchanging the S. pyogenes Cas9 ORF with St1Cas9 or St1Cas9 using Asc I to create pDe‐St1_Cas9 and pDe‐Sa_Cas9, respectively. The destination vectors harbour a kanamycin resistance cassette (npt II) as previously described for pDe‐Cas9‐D10A (Fauser et al ., 2014).

The entry vectors were also assembled by GeneArt® and harboured species‐specific sgRNAs. Spacers can be introduced via Bbs I as previously described (Fauser et al ., 2014).

For analysis of β‐glucuronidase activity with SaCas9 constructs, the oligonucleotides JS 233 and JS 234 were used for oligo‐annealing and subsequent cloning into pEn‐Sa_Chimera (all oligonucleotides used in this study are listed in Table S1). Cross‐species constructs for β‐glucuronidase activity assays were assembled by pairing destination vectors of one species with entry vectors of another species, for example pDe‐Sa_Cas9 with pEn_Chimera or pDe_Cas9 with pEn‐Sa_Chimera vectors.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  23.05.2020 16:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

ATGTGCAGCG AATTCGGCGC GCCATGAAGA GGAACTACAT CCTCGGACTC
7741 G
ATATCGGAA TCACCTCTGT GGGATACGGA ATCATCGATT ACGAGACTAG GGATGTGATC
7801 GATGCTGGTG TGAGACTCTT CAAAGAGGCT AACGTTGAGA ACAACGAGGG AAGAAGGTCT
7861 AAGAGGGGAG CTAGAAGGCT CAAGAGAAGA AGAAGGCACA GAATCCAGAG GGTGAAGAAG
7921 CTCCTCTTCG ATTACAACCT CCTCACCGAT CACTCTGAGC TTTCTGGAAT CAACCCTTAC
7981 GAGGCAAGAG TGAAGGGACT CTCTCAGAAG TTGTCTGAGG AAGAGTTCTC TGCTGCTTTG
8041 CTCCACCTTG CTAAGAGAAG GGGTGTGCAT AACGTGAACG AGGTGGAAGA GGATACCGGA
8101 AACGAGCTTT CTACCAAAGA GCAGATCTCT AGGAACTCTA AGGCTCTCGA AGAGAAGTAC
8161 GTGGCAGAGC TTCAGCTTGA GAGACTCAAG AAAGATGGTG AGGTGAGGGG ATCTATCAAC
8221 AGGTTCAAGA CCTCTGATTA CGTGAAAGAA GCTAAGCAGC TCCTCAAGGT GCAGAAGGCT
8281 TACCATCAGC TCGATCAGTC TTTCATCGAT ACCTACATCG ATCTTCTCGA GACTAGAAGG
8341 ACCTACTACG AGGGACCTGG TGAAGGATCT CCATTCGGAT GGAAGGATAT CAAAGAATGG
8401 TACGAGATGC TCATGGGACA CTGCACTTAC TTCCCTGAAG AACTCAGATC TGTGAAGTAC
8461 GCTTACAACG CTGATCTCTA CAACGCTCTT AACGATCTCA ACAACCTCGT GATCACCAGG
8521 GATGAGAACG AGAAGCTTGA GTACTACGAG AAGTTCCAGA TCATCGAGAA CGTGTTCAAG
8581 CAAAAGAAGA AGCCTACCCT CAAGCAGATC GCTAAAGAGA TCCTTGTTAA CGAGGAAGAT
8641 ATCAAGGGAT ACAGGGTGAC CTCTACCGGA AAGCCTGAGT TCACTAACCT CAAGGTTTAC
8701 CACGATATTA AGGATATTAC CGCTAGAAAA GAGATTATTG AGAACGCTGA GCTTCTCGAT
8761 CAAATCGCTA AGATCCTTAC CATCTACCAG TCATCTGAGG ATATCCAAGA GGAATTGACC
8821 AACCTCAACT CAGAGCTTAC CCAAGAAGAG ATCGAGCAGA TCAGTAACTT GAAGGGTTAC
8881 ACCGGAACCC ACAACCTCTC ACTCAAGGCT ATCAACCTCA TCCTCGATGA GCTTTGGCAC
8941 ACCAACGATA ACCAGATCGC AATCTTCAAC AGACTCAAGC TCGTGCCTAA GAAAGTGGAT
9001 CTCTCTCAGC AGAAAGAGAT TCCTACCACC CTCGTGGATG ATTTCATCCT CTCACCTGTT
9061 GTGAAGAGAT CTTTCATCCA GTCTATCAAG GTGATCAACG CTATTATCAA GAAATACGGA
9121 CTCCCTAACG ATATCATCAT CGAGTTGGCT AGGGAAAAGA ACTCAAAGGA TGCTCAAAAG
9181 ATGATCAACG AGATGCAGAA GAGAAACAGG CAGACCAACG AGAGGATCGA AGAGATCATC
9241 AGGACCACCG GAAAAGAGAA CGCTAAGTAC CTCATTGAGA AGATCAAGCT CCACGATATG
9301 CAAGAGGGAA AGTGCCTCTA CTCTCTCGAG GCTATCCCTC TTGAGGATCT CCTTAACAAC
9361 CCTTTCAACT ACGAAGTGGA TCACATCATC CCTAGATCTG TGTCTTTCGA TAACTCTTTC
9421 AACAACAAGG TGCTCGTGAA GCAAGAGGAA AACTCTAAGA AGGGTAACAG GACCCCTTTC
9481 CAGTACCTCT CTTCATCTGA TTCTAAGATC TCATACGAGA CTTTCAAGAA GCACATCCTC
9541 AACCTCGCTA AGGGAAAGGG TAGGATCTCT AAGACAAAGA AAGAGTACCT TCTCGAGGAA
9601 AGGGATATCA ACAGATTCTC TGTTCAGAAG GATTTCATCA ACAGAAACCT TGTGGATACC
9661 AGGTACGCTA CCAGGGGTCT TATGAACCTT CTCAGGTCTT ACTTCAGGGT GAACAACCTT
9721 GATGTGAAGG TGAAGTCAAT CAACGGTGGA TTCACCTCAT TCCTTAGAAG AAAATGGAAG
9781 TTTAAGAAAG AGAGGAACAA GGGTTATAAG CACCACGCTG AGGATGCTCT CATTATCGCT
9841 AACGCAGATT TCATTTTCAA AGAGTGGAAG AAGTTGGATA AGGCTAAAAA GGTGATGGAA
9901 AACCAGATGT TCGAGGAAAA GCAGGCTGAG TCTATGCCTG AGATCGAGAC TGAGCAAGAG
9961 TACAAAGAAA TCTTCATCAC CCCTCACCAG ATCAAGCACA TCAAAGATTT CAAGGATTAC
10021 AAGTACTCTC ACAGAGTGGA TAAGAAGCCA AACAGAGAGC TTATCAACGA TACCCTCTAC
10081 TCAACCAGAA AGGATGATAA GGGAAACACC CTCATCGTGA ACAATCTCAA CGGACTCTAC
10141 GATAAGGATA ACGATAAGCT CAAGAAGCTC ATTAACAAGT CTCCAGAGAA GTTGCTCATG
10201 TACCACCACG ATCCTCAGAC CTACCAAAAG CTCAAGCTCA TCATGGAACA GTACGGTGAT
10261 GAGAAGAACC CTCTCTACAA GTATTACGAG GAAACCGGTA ACTACCTCAC CAAGTACTCA
10321 AAAAAGGATA ATGGACCTGT GATCAAGAAG ATTAAGTACT ACGGAAACAA GCTCAACGCA
10381 CACCTCGATA TCACCGATGA TTACCCTAAC AGTAGAAACA AGGTGGTGAA GCTTTCACTC
10441 AAGCCTTACA GGTTCGATGT GTACCTCGAT AACGGTGTGT ACAAGTTCGT GACCGTGAAG
10501 AACCTCGATG TTATCAAAAA AGAAAACTAC TATGAGGTTA ACTCTAAGTG CTACGAGGAA
10561 GCTAAGAAGT TGAAGAAGAT CTCTAACCAG GCAGAGTTCA TTGCTTCATT CTACAACAAC
10621 GATCTTATCA AGATTAACGG TGAGCTTTAC AGGGTTATCG GAGTGAACAA CGATTTGCTC
10681 AACAGGATCG AGGTGAACAT GATTGATATC ACCTACAGGG AATACCTCGA GAATATGAAC
10741 GATAAGAGGC CTCCTAGAAT CATCAAGACT ATCGCTTCTA AGACCCAGAG TATCAAGAAG
10801 TACTCTACCG ATATCCTCGG AAACCTCTAC GAGGTTAAGT CAAAGAAGCA CCCTCAGATC
10861 ATTAAGAAGG GATCAAGGGC TGATCCTAAG AAGAAGAGGA AGGTTTGA

Сообщение было отредактировано Asterix - 23.05.2020 18:10
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.05.2020 18:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Надо же как оно бывает ... вот студентам что надо преподавать-то. Это ж каким недоверием надо обладать чтоб это все заметить

Оказывается есть 3 [pDE-Cas] с разными нуклеазами и все синтетические и оптимизированные под растения, 4.1, 3.4 , 3.2 кб размером. У Аддгена есть в наличии только один вариант , самый распространеный. вот тот что 4.1. Сами они плазмиду эту не пересиквенировали , просто 3 коротких рида сделали что мол похоже что вектор [backbone ] именно тот что заявлен.

Но разница эта хитрая , на карбокси -конце у всех стоит одинаковый сигнал ядерной локалицации с спейсером, Именно к нему у меня праймер с дополнительным сайтом рестрикции. Хотя на самом конце есть неспаренны 2 нуклеотида , но самый последний комплементарный .. Что-то я таки вышел на одну аминокислоту за пределы этого сигнала , а она уже разная у всех .

На другом конце они довольно разные , но с 7-примерно аминокислоты одинаковые там идут сиквенсы на какое-то растояние , и мой другой супердлинный праймер как раз заканчивается там на 10 нуклеотидов полной гомологии между всеми тремя генами.

В такой ситуации ПЦР должна идти плохо , но вот как-то таки идет и с пруф-ридинговой и с обычной [Taq] Только размер продукта что-то не тот что ожидается.

Ну что ж , будем выяснять .. что у нас там , таки другой [Cas9] скорее всего из стафилокка золотистого , судя по размеру вставки.. или же таки делеция в 1кб в [Cas9] из Стафиллококка пиогенного...

Вполне могли авторы схитрить и послать в Аддген другую свою плазмиду .. там сложно что-то заметить так навскудку , огромная плазмида же. но зато те кто купились будут проверять их новую конструкцию на своем опыте .

В принципе меня оно устраивает , но однако ... лучше бы это все знать . Хотя я бы тогда наверное предпочел начать с проверенной версии [Cas9]. А вдруг они не работает или плохо работает? и что тогда ?

У китайцев есть подобная оптимизировання под арабидопсис версия обычного [Cas9], но они ее никому не дают. Я вот решил повторить ту китайскую конструкцию просто быстренько модифицировав то что в легком доступе есть , чисто для себя сделать ... и вот на тебе ... все не так просто оказалось.

Подвох пришел откуда и не ждали.
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 21:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

вамщето на форуме вопрос ПомогитеУменяПЦРнеРаботает задают Юные Лэди
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 22:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

два раза не статистика сделай 10 раз
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.05.2020 22:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Я тут под видом вопроса , рассказываю молодежи как оно вот бывает , опытом делюсь.

Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших коллег и шишки набивают.. Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет .. если сможет пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк .

Хотя это конечно добавит ему пару годиков на диссертационную работу. Но а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную.

Никому нельзя доверять в научной тусовке . Мне можно.
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 22:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(genseq @ 20.05.2020 10:05)
Ссылка на исходное сообщение  А повторов или шпилек там нет? Они могут давать варианты отжига, сильно отличающиеся по подвижности от простой двунитевой структуры.

а может праймеры не из той банки капнул eek.gif confused.gif
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 22:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(Asterix @ 23.05.2020 23:18)
Ссылка на исходное сообщение  Я тут под видом вопроса  , рассказываю  молодежи как оно вот бывает , опытом делюсь.

Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших  коллег  и шишки набивают..  Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор  на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет ..  если сможет  пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк .

Хотя это конечно добавит ему пару годиков  на диссертационную работу.  Но  а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную.

Никому нельзя доверять  в научной тусовке . Мне можно.


тоже мне пэнсионэр smile.gif
Участник оффлайн! электрик василий5




 прочитанное сообщение 23.05.2020 22:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(Asterix @ 23.05.2020 23:18)
Ссылка на исходное сообщение  Я тут под видом вопроса  , рассказываю  молодежи как оно вот бывает , опытом делюсь.

Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших  коллег  и шишки набивают..  Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор  на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет ..  если сможет  пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк .

Хотя это конечно добавит ему пару годиков  на диссертационную работу.  Но  а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную.

Никому нельзя доверять  в научной тусовке . Мне можно.


недавно ты говорил что ты в Бельгии на социале с 2008 eek.gif confused.gif
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.05.2020 23:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Я много что говорю , нельзя же всему верить... Это искусство такое , врать так чтоб было похоже на правду. И никогда не знаешь где я правду говорю , а где нет.

Неужели вы и взаравду думаете что человеку открыто пишушему в сети про биотерроризм платят социал , а не отправили уже давно бы куда подальше с государственных харчей .. ну В Россию например ... Там биотеррористы наверное нужнее чем в Бельгии. Ну если логически рассудить-то. Зачем Бельгии кормить русского биотеррориста?
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.05.2020 23:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(guest: petr @ 19.05.2020 21:35)
Ссылка на исходное сообщение  А в самой плазмиде вставка Цас9 какого размера? правильного?



вот дошел уже и то такой точки , там есть сайты [EcoRI] и [StuI] на концах этого [ Cas9] , причем онио везде есть во всех этих плазмидах.

В понедельник порежу.. гляну на то что в Плазмиде сидит. А вдруг там таки 4.1кб ... вот удивление то мое как вырастет. Совсем запутаюсь в результатах.
Участник оффлайн! FFP3




 прочитанное сообщение 25.05.2020 15:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(Asterix @ 23.05.2020 23:18)
Ссылка на исходное сообщение  Я тут под видом вопроса  , рассказываю  молодежи как оно вот бывает , опытом делюсь.

Иногда бывает тяжело смотреть как они , молодые , мучаются вот на таких подставах старших  коллег  и шишки набивают..  Хотя оно и полезно ... естесвенный олтбор  на настоящего ученого естесвоиспытателя таким образом идет ..  если сможет  пройти через такие подставы и научиться вовремя все заметить .. будет из него толк .

Хотя это конечно добавит ему пару годиков  на диссертационную работу.  Но  а как без этого ... можно сказать экзамент на зрелось научную.

Никому нельзя доверять  в научной тусовке . Мне можно.



"Я старый. Меня девушки не любят. — Обратитесь во Всемирную Лигу Сексуальных Реформ" ©
Участник оффлайн! FFP3




 прочитанное сообщение 25.05.2020 15:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

(Asterix @ 24.05.2020 00:05)
Ссылка на исходное сообщение  Я много что говорю , нельзя же всему верить...  Это искусство такое , врать так чтоб было похоже на правду. И никогда не знаешь  где я правду говорю , а где нет.

Неужели вы и взаравду думаете  что человеку открыто пишушему в сети про биотерроризм  платят  социал , а не отправили уже давно бы куда подальше с государственных харчей .. ну В Россию например ...  Там биотеррористы  наверное нужнее чем в Бельгии. Ну если логически рассудить-то.  Зачем Бельгии кормить  русского биотеррориста?



выложите свои публикации в PubMed с 2008
Участник оффлайн! FFP3




 прочитанное сообщение 25.05.2020 16:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

(Asterix @ 24.05.2020 00:05)
Ссылка на исходное сообщение  Я много что говорю , нельзя же всему верить...  Это искусство такое , врать так чтоб было похоже на правду. И никогда не знаешь  где я правду говорю , а где нет.

Неужели вы и взаравду думаете  что человеку открыто пишушему в сети про биотерроризм  платят  социал , а не отправили уже давно бы куда подальше с государственных харчей .. ну В Россию например ...  Там биотеррористы  наверное нужнее чем в Бельгии. Ну если логически рассудить-то.  Зачем Бельгии кормить  русского биотеррориста?

паслухай плотник а в белгии есть гидролизный спирт ?
Участник оффлайн! FFP3




 прочитанное сообщение 25.05.2020 16:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

(FFP3 @ 25.05.2020 17:48)
Ссылка на исходное сообщение  паслухай плотник а в белгии есть гидролизный спирт ?

Нет в мире совершенства! - вздохнул Лис
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.05.2020 21:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Таки в Плазмиде кусок с [Cas9] правильный оказался явно выше 4 кб идет после рестрикции.

То есть как и подсказывали выше .. все дело в ПЦР..

Ну в этот раз я решил последовать мудрому совету данному свыше , там наверху в одном из ответов .. Ну то есть первый цикл 54 а потом уже 68-98 остальные 25 циклов.

Посмотрим как пойдет.

Чем черт не шутит , вдруг сработает? Впрочем надо наверное будет еще раз делать .. похоже я из-за спешки с этими правилами по корона вирусу котопрые ограничивают пребывание сотрудников в лабе, буфера для ПЦР туда половину налил.. ну забыл, деменция у меня от корона вируса развивается . Оно все бы и ничего наверное , но ведь и концентрация магния тоже в два раза ниже ..

Завтра гляну что наПЦРилось.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 27.05.2020 13:02     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

(Asterix @ 26.05.2020 22:55)
Ссылка на исходное сообщение  
Ну в этот раз я решил последовать мудрому совету  данному  свыше , там наверху в одном из ответов .. Ну то есть первый цикл  54  а потом уже  68-98  остальные  25 циклов.

... 72-95 no.gif и минимальное время на элонгации. Это можно просчитать, но я до сих пор не знаю confused.gif какая у Вас пруфридинг полимераз. frown.gif
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.05.2020 22:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

да не помню , германская какая-то , дешево была , с [BioCat ] взял.. Шустро так работает . Обещали вообще златые горы и никаких проблем.

Сегодня посмотрел вроде ПЦР продукт вроде похож на правду, хотя все еще сомнения есть , ну поставил его резаться .. чего уж , не пропадать же ,

да 4 минуты я дал [extension] там 4200 максимум.. ей и пол-минуты на килобазу было бы достаточно. Продукт чистый , один. несмотря на ошибку с концентрацией буфера. Он в два раза разведен получился.

Впрочем я праймеров в этот раз добавил в 5 раз больше чем обычно, все 100пмол положил в 50 мкл.

Ну и поставил новые компетентные клетки растить Топ10, может в них тоже дело, прошлые я неправильно сделал , там в контроле с[ pUC19] еффективность что-то совсем плохая получилась, всего 2х10.7.. Обычно таки на порядок лучше.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.05.2020 22:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

Вот она , нашел свою полимерзочку.

https://www.biocat.com/bc/pdf/1706_Precisor.pdf
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.05.2020 12:02     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

(Asterix @ 27.05.2020 23:48)
Ссылка на исходное сообщение  Вот она , нашел свою полимерзочку.

https://www.biocat.com/bc/pdf/1706_Precisor.pdf

Там же черным по белому написано :
in high speed DNA synthesis (15s/kb for templates of up to 5kb and 30s/kb for templates longer than 5kb).
40-50 сек, не более 1 мин!!! Это фьюжен полимераза. Почем покупал?
Я пользуюсь NEB или Термофишер (Finenzyme бывший), всегда в восторге от них. umnik.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Asterix
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 12:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

Ну а в чем собственно проблема с увеличением времени на [extension]

Я всю жизнь делаю время с запасом .. Они там пишут про 15-30 сек на [1Kb] , но это в идеальных тестовых условиях ... а в реале там все что угодно может замедлять ее ..
Много раз просто именно удлинение времени по ставнению с рекомендованным и решало проблему , вот я и привык.

Этои же не первый раз я с ней клонирую длинные матрицы.. Целые плазмиды ей амплифицировал именно с избытком времени.

Отлично все шло. .. но тут какая-то аномалия вот .. причем на грани .. Вроде и близко к размеру , но таки может и меньше .. ну чуток ..
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 12:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

Да от балды купил , нагуглил вот , недорого же , я же собирался поначалу клонировать без сайтов рестрикции и без лигирования .. с перекрестами на концах.. новомодным методом..

По ходу дела намаялся и отказался от этой красоты , а полимераза вот осталась.

Клонирую по-старинке теперь , [hind/bamh/xba], медленно но надежно и главное что отлично работает .

А покупать специальный штамм для этого перекрест-клонирования за 600 евро как-то не захотелось.. Я же просто так в лабе работаю , в удовольствие .. От скорости моей работы ничего не зависит.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.05.2020 13:02     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

(Asterix @ 28.05.2020 13:12)
Ссылка на исходное сообщение  Ну а в чем собственно проблема  с увеличением времени на [extension]

Я ведь не теоретизирую. У меня тоже была примерная проблема с очень длинными праймерами с торчащими нематричными 5-концами и, правда, с Pfu полимеразой (время на ПЦР программе как у Taq, т.е. очень все растянуто, полимераза медленная). Пока не сделал на отжиге какие секунды, около 10, когда на эхтеншн были минуты, проблему не устранил.
Пруфридинг полимеразы не ограничиваются тем, что "тупят" концы, они видимо разгоняются дальше и успевают наломать дров укорачивая праймеры с 3-штрих конца.
Хочу еще добавить, важно не перебУхать фермент в реакцию (лучше меньше да лучше), ну и как рекомендуют - 98 град (сам не понимаю?).

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 28.05.2020 13:10
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 13:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

О , похоже нашел , там в плазмиде два [StuI] сайта , и один из них похоже метилирован и не режется , а другой ровно на 500 дальше вот это и дает мне разницу между ПЦР продуктом и соответвующим ему фрагментом плазмиды.. То есть размер ПЦР-продукта скорее всего тот самый что надо, а размер фрагмента чуток больше . 4.300/ 4.650

Вот ведь - век живи ...

Но то что у меня уже два раза клонировалось совсем другое какое-то ... там 3.3 примерно .. ну никак не 4.3, даже не близко
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 13:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

У нас еще и машинка старенькая Био-Рад Т100, на ладан дышит .. и пробирки не тонкостенные ... я все предпочитаю удлинять , а не укороачивать. Старые черви - они медленно ползают.



Ну и да , положил в реакцию побольше праймеров в 5 раз ... вот результат и попер-то. даже если она и грызет их .. на другое место они все равно не сядут. Там плазмида же матрица , чай не геномка.

Но идея с первым циклом на 54 градуса очень здравая конечно, это правильно.. Логично.

просто всегда работало и так, это вот с [CAS9] незадача приключилась.
Участник оффлайн! FFP3




 прочитанное сообщение 04.06.2020 01:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(Asterix @ 28.05.2020 13:12)
Ссылка на исходное сообщение  Ну а в чем собственно проблема  с увеличением времени на [extension]

Я всю жизнь делаю время с  запасом ..  Они там пишут  про  15-30 сек  на [1Kb]  , но это в идеальных тестовых условиях ... а в реале там все что угодно может замедлять  ее ..
Много раз просто именно удлинение времени  по ставнению с рекомендованным  и решало проблему ,  вот я и привык.

Этои же не первый раз я с ней клонирую  длинные матрицы.. Целые плазмиды  ей амплифицировал именно  с  избытком  времени.

Отлично все шло.  ..  но тут какая-то аномалия вот .. причем на грани ..  Вроде и близко к размеру , но таки может и меньше .. ну чуток ..


"Этои же не первый раз я с ней клонирую длинные матрицы"

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC44063/
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.06.2020 01:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

Проблема была с компетентными клетками .. очень похоже на то.. Я сделал ошибку в их приготовлении , а там не только эффективность но еще и другие осложнения
Участник оффлайн! FFP3




 прочитанное сообщение 04.06.2020 01:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

(Asterix @ 04.06.2020 02:10)
Ссылка на исходное сообщение  Проблема была с компетентными клетками ..  очень похоже на то.. Я сделал ошибку  в их приготовлении  ,  а там не только эффективность  но еще и другие осложнения


Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Пруф-ридинг полимераза вопрос -- У меня 2-ой раз пропадает кусок из DNA --
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 04.06.2020 02:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

Slippage - эффект. Вещь довольно частая.
http://www.genetica.uma.es/articulos/art271.pdf

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): -Ъ-, Asterix
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 04.06.2020 13:16     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

(Asterix @ 04.06.2020 02:10)
Ссылка на исходное сообщение  Проблема была с компетентными клетками ..  очень похоже на то.. Я сделал ошибку  в их приготовлении  ,  а там не только эффективность  но еще и другие осложнения

Дал осложнения на сердце и мозг. smile.gif
Ни хрена ты не разобрался, Плотник tongue.gif
Интересную статью выложил kb1, таки советую просмотреть.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.06.2020 13:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

Ну посмотрел ? хорошая статья, но мне-то что делать? магния поменьше класть а полимеразы побольше? И температуру повыше ?
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 04.06.2020 16:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

(Asterix @ 04.06.2020 14:34)
Ссылка на исходное сообщение  Ну посмотрел ? хорошая статья,  но мне-то  что делать? магния поменьше класть а полимеразы побольше?  И температуру повыше ?


Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M)
Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Asterix
Участник оффлайн! Шаолинь
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.06.2020 17:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

(kb1 @ 04.06.2020 17:59)
Ссылка на исходное сообщение  Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M)
Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью.



Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью.

eek.gif confused.gif eek.gif confused.gif
Участник оффлайн! Шаолинь
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.06.2020 17:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

(kb1 @ 04.06.2020 17:59)
Ссылка на исходное сообщение  Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M)
Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью.

Bacillus stearothermophilus DNA polymerase (Bst), do not slip.
это изотермалка а не ПЦР
Участник оффлайн! Шаолинь
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.06.2020 17:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

(kb1 @ 04.06.2020 17:59)
Ссылка на исходное сообщение  Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M)
Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью.

Страна Советов smile.gif

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 05:35
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft