Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Шаолинь Постоянный участник |
(kb1 @ 04.06.2020 17:59) Да. Время отжига праймеров - сократить, температуру - поднять и/или добавить: DMSO (до 3-5%) & Betaine (до 1-1.8 M) Другой вариант - использовать полимеразу с вытесняющей активностью. вамщненто смесь обычной клентаки плюс 10 % пруфрида |
Шаолинь Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Шаолинь @ 04.06.2020 18:39) Монах, хороший совет! Я бы даже 20 к 1 сделал. |
Шаолинь Постоянный участник |
(-Ъ- @ 04.06.2020 18:42) |
Шаолинь Постоянный участник |
(-Ъ- @ 04.06.2020 18:42) задницы не замечал хоть 10 к 1 хоть 20 к 1 |
kb1 Участник |
(Шаолинь @ 04.06.2020 18:20) Можно и ПЦР, но не с Bst |
kb1 Участник |
(Шаолинь @ 04.06.2020 18:39) Только Vent или DeepVent, если нужна вытесняющая активность |
Asterix Постоянный участник |
вместо 5.5 кб ПЦР-продукта вставка в плазмиде 2.5.. Раньше и 3.8 бывало ... Как же меня достал этот [Cas9], чего он такой привередливый-то? причем вопрос похоже уже не в ПЦР а в лигировании и трансформации.. Может там где собака зарыта ? Фрагменты-то я в лигирование смешиваю вполне известные , 4.2кб [Cas9] и 3.3кб сам вектор . Почему вставка сокращается в размере ? Почему она не хочет жить в стандартном векторе [ pUC57] ? Поставил сегопдня еще раз ПЦР , в этот раз после первого отжгига на 52 , идет 25циклов 72-98.. И время укоротил до 2.30мин на 4.2кб И в двугх вариантах , во втором добавил 6% [DMSO] , посмотрим как оно все запоет-запляшет ... Ну и наверное вектор придется заново резать и выделять .. мож там чего , никлеаза какя попала и концы мне обьедает. туды ее в качель. |
H3K27me2 Участник |
(Asterix @ 04.06.2020 23:03) Ну вообщем сегодня прогнал гель .. опять ничего не получилось вместо 5.5 кб ПЦР-продукта вставка в плазмиде 2.5.. Раньше и 3.8 бывало ... Как же меня достал этот [Cas9], чего он такой привередливый-то? причем вопрос похоже уже не в ПЦР а в лигировании и трансформации.. Может там где собака зарыта ? Фрагменты-то я в лигирование смешиваю вполне известные , 4.2кб [Cas9] и 3.3кб сам вектор . Почему вставка сокращается в размере ? Почему она не хочет жить в стандартном векторе [ pUC57] ? Поставил сегопдня еще раз ПЦР , в этот раз после первого отжгига на 52 , идет 25циклов 72-98.. И время укоротил до 2.30мин на 4.2кб И в двугх вариантах , во втором добавил 6% [DMSO] , посмотрим как оно все запоет-запляшет ... Ну и наверное вектор придется заново резать и выделять .. мож там чего , никлеаза какя попала и концы мне обьедает. туды ее в качель. прогнать фрагмент на RNAfold |
H3K27me2 Участник |
|
Asterix Постоянный участник |
Вообщем оно работает, но все еще не так как хотелось бы чтоб оно выглядело .. А фальсифицировать я слишком хорошо умею чтоб это профессиональное умение еще и для собственного удовольствия упражнять... Мне настоящие результаты важны, а не гламурные публикации. Чай, не китаец я. Сегодня оказлось что вектор не того размера ... Но зато как отлично прошла ПЦР с длинными праймерами по совету свыше ... реально красиво .. И много. И размер на этот раз хороший ,большой .. ну будем лигировать , вецтор тоже переделал .. надеюсь что в этот раз правильную полоиску вырезал из геля ... а вдруг получится? Сообщение было отредактировано Asterix - 08.06.2020 22:32 |
FFP3 |
(Asterix @ 08.06.2020 23:31) Вот что я всегда люблю в своем научном хобби - так это предсказуемую невоспроизводимость результаов ... или скорее даже невоспроизводимую предсказуемость... Тьфу ты черт .. Вообщем оно работает, но все еще не так как хотелось бы чтоб оно выглядело .. А фальсифицировать я слишком хорошо умею чтоб это профессиональное умение еще и для собственного удовольствия упражнять... Мне настоящие результаты важны, а не гламурные публикации. Чай, не китаец я. Сегодня оказлось что вектор не того размера ... Но зато как отлично прошла ПЦР с длинными праймерами по совету свыше ... реально красиво .. И много. И размер на этот раз хороший ,большой .. ну будем лигировать , вецтор тоже переделал .. надеюсь что в этот раз правильную полоиску вырезал из геля ... а вдруг получится? тебеж предлагали если не умеешь закажи на стороне |
FFP3 |
(Asterix @ 08.06.2020 23:31) Вот что я всегда люблю в своем научном хобби - так это предсказуемую невоспроизводимость результаов ... или скорее даже невоспроизводимую предсказуемость... Тьфу ты черт .. Вообщем оно работает, но все еще не так как хотелось бы чтоб оно выглядело .. А фальсифицировать я слишком хорошо умею чтоб это профессиональное умение еще и для собственного удовольствия упражнять... Мне настоящие результаты важны, а не гламурные публикации. Чай, не китаец я. Сегодня оказлось что вектор не того размера ... Но зато как отлично прошла ПЦР с длинными праймерами по совету свыше ... реально красиво .. И много. И размер на этот раз хороший ,большой .. ну будем лигировать , вецтор тоже переделал .. надеюсь что в этот раз правильную полоиску вырезал из геля ... а вдруг получится? длинные праймеры тут |
Asterix Постоянный участник |
Мне деньги платят независимо от моих достижений в молбиологии. Просто прикольно же . |
FFP3 |
(Asterix @ 09.06.2020 23:59) Поставил лигирование сегодня . посмотрим что на этот раз получится ... мне ведь не результат важен . а сам процесс научной работы. Мне деньги платят независимо от моих достижений в молбиологии. Просто прикольно же . RTFM |
Asterix Постоянный участник |
я уже думаю на токсичность право.. видимо с криптопромотора экспрессия немного запускается но это дикость какая-то. Чего это ему быть токсичным? там у меня нет же никакой [gRNA] Единственно что я добавил на Н-конец сигнал ядерной локализации .. то есть очень позитивно-заряженный пептид из [SV40]. может там перед ним несколько стоп-кодонов выставить во всех рамках, Хотя оно может и изнутри гена стартовать. Ну или лигаза дохлая , но с чего бы ей дохнуть? вполне себе термо-фишеровская , свежая. Или действительно нуклеаза какaя где-то гадит. Может пробирки у меня грязные , не все же нуклеазы автоклав берет. |
FFP3 |
|
Asterix Постоянный участник |
Или у вас есть добрый волшебник на примете который бесплатно для меня все сделает? |
FFP3 |
(Asterix @ 13.06.2020 01:06) А кто платить будет? я сам бесплатно работаю... Или у вас есть добрый волшебник на примете который бесплатно для меня все сделает? извини нищим по субботам ничего личного |
FFP3 |
(Asterix @ 13.06.2020 01:06) А кто платить будет? я сам бесплатно работаю... Или у вас есть добрый волшебник на примете который бесплатно для меня все сделает? |
FFP3 |
(Asterix @ 13.06.2020 01:06) А кто платить будет? я сам бесплатно работаю... Или у вас есть добрый волшебник на примете который бесплатно для меня все сделает? |
FFP3 |
(Asterix @ 13.06.2020 01:06) А кто платить будет? я сам бесплатно работаю... Или у вас есть добрый волшебник на примете который бесплатно для меня все сделает? к Абрамовичу |
FFP3 |
(Asterix @ 13.06.2020 01:06) А кто платить будет? я сам бесплатно работаю... Или у вас есть добрый волшебник на примете который бесплатно для меня все сделает? |
annybank2018 Australia |
|
Asterix Постоянный участник |
Но по-правде говоря желание погромить их оффис никуда не пропало ... у меня есть с ними еще старые счеты. Ну ладно , посмотрим , постравил я пробную реакцию ... если не получится ... то точно надо идти погромить таки ... Чисто для ментального благополучия моего. А то ни хрена ничего не работает ... |
Asterix Постоянный участник |
Какие есть в мире копии у них? Ну так чтоб по 50 евро хотя бы. Но с тем же качеством, а то может и лучше. И кстати какой там рабочий буфер? |
Asterix Постоянный участник |
[References 1.Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58, 913. 2.Bernard, P. and Couturier, M. (1992) J. Mol. Biol.226, 735. 3.Miki, T., Park, J.A., Nagao, K., Murayama, N., and Horiuchi, T. (1992) J. Mol. Biol. 225, 39. ] General Recommendations and Guidelines • pEXP7-tet is provided for use as a positive control in the BP reaction, and is an ~1.4 kb linear fragment containing attB sites flanking the tetracycline resistance gene and its promoter. • For attB-containing expression clones, we recommend using plasmid DNA purified with the S.N.A.P.ô MiniPrep Kit (Cat. No. K1900-01). Mini-prep (alkaline lysis) DNA preparations are adequate for GatewayÆ reactions; however, in general, such DNA cannot be quantitated by UV absorbance due to contaminating RNA and nucleotides. Estimate concentrations by gel electrophoresis in comparison with standard DNA, i.e., DNA Mass Ladder (Cat. Nos. 10068-013 or 10496-016). • You may use attB-PCR products in the BP reaction without purification. To achieve a higher percentage of desired clones, use PEG/MgCl2 precipitation (see below) to remove primer-dimers or small DNA molecules (< 300 bp). • To maximize cloning efficiency, 30% PEG 8000/30 mM MgCl2 Solution is provided to purify PCR products away from other DNA < 300 bp in size, including primer-dimers. Simply dilute the PCR reaction 4-fold with TE [10 mM Tris-HCl (pH 7.5-8), 1 mM EDTA], then add 1/2 volume of 30% PEG 8000/30 mM MgCl2 Solution (final concentrations of 10% PEG, 10 mM MgCl2). Vortex to mix thoroughly and centrifuge 15 minutes at full speed in a microcentrifuge. Carefully remove supernatant and suspend the clear pellet in TE to >10 ng/μl. Important: Use the recommended proportion of PEG/MgCl2(4) to ensure that the correct sized products are removed. • For BP reactions, the most efficient substrates are linearattB products (PCR products or expression clones) and supercoiled attP-containing donor vectors. Supercoiled or relaxed attB substrates may be used, but will react less efficiently than linear attB substrates. • To increase the number of colonies containing the desired entry clone, increase the incubation time from the recommended 1 hour to 4-6 hours (typically 2-3 fold more colonies) or overnight (typically 5-10 fold more colonies). Longer incubations are recommended for genes ≥ 5 kb to increase the yield of colonies. • We recommend using 40-100 fmol of PCR product per 20 μl reaction (where a 1 kb PCR product is ~0.65 ng/fmol). Increasing the amount of PCR product generally yields more colonies; however, do not exceed ~500 ng of PCR product per 20 μl reaction. |
Asterix Постоянный участник |
Похоже что надо просто попробовать побольше клонов отскринировать... Возможно что полноразмерный [Cas9] просто подвергается негативной селекции и поэтому я вижу одни обрывки гена после лигирования v pUC57.. Но они разные по-размеру ... вот максимально было 3.3кб из искомых 4.2. Будем рыть , ну и обществу на заметку. Не все тут так очевидно. Я попробую таки напрямую ПЦР-продукт клонировать сразу в огромную плазмиду для агробактерии, в ней он навряд ли будет експрессироваться в бактерии. Хотя кто знает . The CRISPR-Cas9 system has been used extensively in eukaryotic and prokaryotic systems for various applications. In case of the latter, a couple of previous studies had shown Cas9 protein expression associated toxicity. We studied the same in five microbes, viz Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Mycobacterium smegmatis, Xanthomonas campestris and Deinococcus radiodurans. Transformation efficiency of plasmids carrying genes coding for Cas9 or dCas9 was used to gauge toxicity associated with Cas9 protein expression. Results showed differential levels of Cas9 toxicity among the bacteria and lower transformation efficiency for cas9/dcas9 bearing plasmids compared to controls in general. This indicated lethal effect of Cas9/dCas9 expression. While E. coli and S. typhimurium seemed to tolerate Cas9/dCas9 fairly well, in GC rich microbes, M. smegmatis, X. campestris and D. radiodurans, Cas9/dCas9 associated toxicity was acute. |
Asterix Постоянный участник |
Уже исключил лигазу из вопроса, она отлично работает. Другое клонируется, а [CAS9] не хочет. Что бы это могло быть? Оригинальныю вектор [pDE-Cas9] с геном [CAS9] синтетическим оптимизированным под растения под убиквитиновым промотором из петрушки он для [GoldenGate], с ним вроде проблем нет... рекомбинация с донор-вектором идет , ГФП там во составе этой донорной вставки светится в [E.coli], плазмида большая выделяется , агробактерии трансформируются , уже и тест-трансформацию поставил на табаке и петунье. Но мне надо переделать систему под свою идею украденную у китайцев.. и всего-то и надо просто переклонировать этот ген в другой вектор под другой промотор и в моей фюжен версии чтоб поолучился. Прям сам удивляюсь ... Чертовщина какая-то. Сообщение было отредактировано Asterix - 27.06.2020 14:37 |
внук5 |
(Asterix @ 27.06.2020 15:35) Моя эпопея с [Cas9] продолжается . ПЦР продукт вроде как правильный , на концах [ HindIII/BamHI], из геля полоска почищена после рестрикции, уже в другой вектор попробовал клонировать типа [pCAMBIA] вектор , он у меня финальный результат ... та же фигня что и с [pUC57] ... клонов нет и те несколько что вырастают таки все неправильные .. Уже исключил лигазу из вопроса, она отлично работает. Другое клонируется, а [CAS9] не хочет. Что бы это могло быть? Оригинальныю вектор [pDE-Cas9] с геном [CAS9] синтетическим оптимизированным под растения под убиквитиновым промотором из петрушки он для [GoldenGate], с ним вроде проблем нет... рекомбинация с донор-вектором идет , ГФП там во составе этой донорной вставки светится в [E.coli], плазмида большая выделяется , агробактерии трансформируются , уже и тест-трансформацию поставил на табаке и петунье. Но мне надо переделать систему под свою идею украденную у китайцев.. и всего-то и надо просто переклонировать этот ген в другой вектор под другой промотор и в моей фюжен версии чтоб поолучился. Прям сам удивляюсь ... Чертовщина какая-то. плотник тди в жопу заебал |
внук5 |
(Asterix @ 27.06.2020 15:35) Моя эпопея с [Cas9] продолжается . ПЦР продукт вроде как правильный , на концах [ HindIII/BamHI], из геля полоска почищена после рестрикции, уже в другой вектор попробовал клонировать типа [pCAMBIA] вектор , он у меня финальный результат ... та же фигня что и с [pUC57] ... клонов нет и те несколько что вырастают таки все неправильные .. Уже исключил лигазу из вопроса, она отлично работает. Другое клонируется, а [CAS9] не хочет. Что бы это могло быть? Оригинальныю вектор [pDE-Cas9] с геном [CAS9] синтетическим оптимизированным под растения под убиквитиновым промотором из петрушки он для [GoldenGate], с ним вроде проблем нет... рекомбинация с донор-вектором идет , ГФП там во составе этой донорной вставки светится в [E.coli], плазмида большая выделяется , агробактерии трансформируются , уже и тест-трансформацию поставил на табаке и петунье. Но мне надо переделать систему под свою идею украденную у китайцев.. и всего-то и надо просто переклонировать этот ген в другой вектор под другой промотор и в моей фюжен версии чтоб поолучился. Прям сам удивляюсь ... Чертовщина какая-то. пелотник у тебяж картина Ван Гого в Генте |
внук5 |
(Asterix @ 19.05.2020 02:55) Пруф-ридинг полимераза вопрос У меня уже 2-ой раз пропадает кусок из ДНК Амплифицирую [Cas9], оптимизированный под арабидопсис, навешиваю на него побрякушки по концам , ну 100 пар оснований всего екстра , амплифицирую с плазмидной ДНК , из [ AddGene] [pDe-Cas9] . должно быть 4200, а на форезе 3700.. Пропадает солидный кусок ДНК. Что за черт такой ? Я это дело даже клонировал в плазмиду .. и все равно размер вставки явно не тот. плотник ну что выгнали |
внук5 |
(внук5 @ 27.06.2020 23:10) |
внук5 |
(Asterix @ 19.05.2020 02:55) Пруф-ридинг полимераза вопрос У меня уже 2-ой раз пропадает кусок из ДНК Амплифицирую [Cas9], оптимизированный под арабидопсис, навешиваю на него побрякушки по концам , ну 100 пар оснований всего екстра , амплифицирую с плазмидной ДНК , из [ AddGene] [pDe-Cas9] . должно быть 4200, а на форезе 3700.. Пропадает солидный кусок ДНК. Что за черт такой ? Я это дело даже клонировал в плазмиду .. и все равно размер вставки явно не тот. |
внук5 |
(Asterix @ 27.06.2020 15:35) Моя эпопея с [Cas9] продолжается . ПЦР продукт вроде как правильный , на концах [ HindIII/BamHI], из геля полоска почищена после рестрикции, уже в другой вектор попробовал клонировать типа [pCAMBIA] вектор , он у меня финальный результат ... та же фигня что и с [pUC57] ... клонов нет и те несколько что вырастают таки все неправильные .. Уже исключил лигазу из вопроса, она отлично работает. Другое клонируется, а [CAS9] не хочет. Что бы это могло быть? Оригинальныю вектор [pDE-Cas9] с геном [CAS9] синтетическим оптимизированным под растения под убиквитиновым промотором из петрушки он для [GoldenGate], с ним вроде проблем нет... рекомбинация с донор-вектором идет , ГФП там во составе этой донорной вставки светится в [E.coli], плазмида большая выделяется , агробактерии трансформируются , уже и тест-трансформацию поставил на табаке и петунье. Но мне надо переделать систему под свою идею украденную у китайцев.. и всего-то и надо просто переклонировать этот ген в другой вектор под другой промотор и в моей фюжен версии чтоб поолучился. Прям сам удивляюсь ... Чертовщина какая-то. |
genseq Постоянный участник |
(Asterix @ 17.06.2020 10:48) Хммм, таки да , похоже какя-то генотоксичность есть у [Cas9].. довольно много заметок об таких феноменах у бактерий. Вообще-то, это эндонуклеаза. И в том, что она своей активностью гробит клетку нет ничего удивительного. В результате клонируются только её мутантные неактивные формы. А наиболее частый тип мутации при ПЦР - это делеция. Я на подобный фокус как-то нарвался при клонировании протективного антигена B.anthracis. Получались только клоны с выпадением фенилаланина на конце бета-шпильки, отвечающей за "бурение" клеточной мембраны. Сообщение было отредактировано genseq - 28.06.2020 07:32
|
Asterix Постоянный участник |
Единственно я добавил на Н-конец сигнал ядерной локализации от вируса [SV40].. в оригинале этого нет , там есть такой сигнал на другом конце. Но он у меня будет закрыт фрагментом из пикорна-вируса , поэтому и решил добавить еще один на другой конец. Мол кашу маслом ... Неужели эти два прямых повтора в начале и в конце гена так еффективно портят мою кашу с маслом? , хотя впрочем и не идентичных , но похожие конечно . там сложно уж совсем разные сделать ДНК |
alexandrd |
|
Asterix Постоянный участник |
|
Asterix Постоянный участник |
И, наконец, третья группа ученых, возглавляемая специалистом в области репродуктивной биологии Шухратом Миталиповым (Shoukhrat Mitalipov) из Орегонского университета здоровья и науки в Портленде, изучала эмбрионы, полученные с использованием сперматозоидов-носителей мутации, которая вызывает заболевание сердца. Ученые из этой команды тоже, судя по всему, убедились в том, что редактирование генома затрагивает большие области хромосомы, содержащие измененный ген. Во всех своих исследованиях ученые использовали эмбрионы только для научных целей, а не для индуцирования беременности. Ведущие авторы этих трех научных исследований, результаты которых отражены в препринтах, отказались подробно обсуждать свою работу с отделом новостей журнала "Nature" до тех пор, пока их статьи не будут опубликованы в рецензируемых журналах. |
Asterix Постоянный участник |
В растения его мне надо встраивать, именно в геном , чтоб прикольных ГМО мутантов делать, главным образом для декоративных растений. Можно и так делать как есть , но мне интереснее в другую конструкцию этот [CAS9] вставить и именно в ней экспрессировать, под другим промотором . У меня будет бинарная система такая .. Когда я все контролирую и легко и просто вижу что там происходит. В живом растении. Но он не хочет .. я уже начинаю догадки строить что же там не так-то.. Никогда таких проблем с клонированием не видел.. Хотя вот лизоцим странно так получился , очень хрупкие клетки , очень видно при выделении из них плазмиды. Тои есть таки течет мой вектор и експрессирует немного в бактериях тоже .. то есть получается что некая очень небольшая експрессия этого [CAS9] убивает позитивные клоны. |
Asterix Постоянный участник |
- Попробую и так, но это сомнительно ... я думаю надо в вектор несколько стопкодонов поставить перед началом вставки. Чтоб уж точно ничего там не экспрессировалось с криптопромотора какого-то. Если тогда получится буду уже 100% знать в чем дело. Хотя ген большой 4.2кб, может там изнутри что кусок какой експрессируется случайно , но это совсем маловероятно, оригинальный вектор с [CAS9] никаких проблем не создает , хотя некое изменение в виде и консистенции колоний все таки заметно. Они какие-то другие , не такие как обычно. явно дело в экспрессии фоновой этого гена. В оригинальном векторе там интрон в промоторе стоит и прямо перед первым АТГ и вырезается и там куча АТГ в нем не в рамке которые. так что экспресия нефункциональная идет если идет. Попробую на следующей неделе просто ПЦР-продукт по тупым концам заклонировать в другой вектор , там где в середину токсичноиго гена клонирование идет и только позитивные клоны могут расти. Может онии есть но просто редкие , а мне лень больше 12 реакций ставить на колониях. Всегда было достаточно и 7 колоний чтоб позитив найти. я же по двум разным липким концам клонирую всегда .. Ну чтоб не заморачиваться. |
Asterix Постоянный участник |
Это именно он , сам ген чудит. Вот ведь назадача какая... Почему он только в оригинальном векторе [ pDE-Cas9] и в той самой конфигурации с интроном внутри промотора существоивать может ? Отчего он не хочет модифицироваться и клонироваться в другие конструкции? Ну и должен сказать что я сделал контроль; которого никто не делает и зафигачил этот вектор с [ CAS9] но без специфической [gRNA] в табак. Клоны уже начали появляться .. но на них страшно смотреть... они весьма потрепанные какие-то что ли ... морфология сильно отличается от обычной. .. А ведь многие наверное думают что это у них специфические эффекты такие оттого что они туда красиво задизайненный на бесплатном сайте [Chop-Chip] олиг вставили и все такое .. ну и да сиквенируют ПЦР-продукт и видят что ген поменялся в нужном месте, и делают вывод что фенотип от этого генного изменения и изменился ... а контроля то и нет.. Сделайте просто [CAS9] с посторонней какой [sgRNA] и сравните с вашей ...может и эффект увидите но он один и тот же . Что в контроле что в опыте . |
электрик василий5 |
(Asterix @ 20.07.2020 23:56) Ну что господа , доигрались , и в [pJET] клонироваться отказался мой [CAS9], 7 клонов проверил - пустота. Контроли все в норме . Это именно он , сам ген чудит. Вот ведь назадача какая... Почему он только в оригинальном векторе [ pDE-Cas9] и в той самой конфигурации с интроном внутри промотора существоивать может ? Отчего он не хочет модифицироваться и клонироваться в другие конструкции? Ну и должен сказать что я сделал контроль; которого никто не делает и зафигачил этот вектор с [ CAS9] но без специфической [gRNA] в табак. Клоны уже начали появляться .. но на них страшно смотреть... они весьма потрепанные какие-то что ли ... морфология сильно отличается от обычной. .. А ведь многие наверное думают что это у них специфические эффекты такие оттого что они туда красиво задизайненный на бесплатном сайте [Chop-Chip] олиг вставили и все такое .. ну и да сиквенируют ПЦР-продукт и видят что ген поменялся в нужном месте, и делают вывод что фенотип от этого генного изменения и изменился ... а контроля то и нет.. Сделайте просто [CAS9] с посторонней какой [sgRNA] и сравните с вашей ...может и эффект увидите но он один и тот же . Что в контроле что в опыте . |
электрик василий5 |
(Asterix @ 19.05.2020 02:55) Пруф-ридинг полимераза вопрос У меня уже 2-ой раз пропадает кусок из ДНК Амплифицирую [Cas9], оптимизированный под арабидопсис, навешиваю на него побрякушки по концам , ну 100 пар оснований всего екстра , амплифицирую с плазмидной ДНК , из [ AddGene] [pDe-Cas9] . должно быть 4200, а на форезе 3700.. Пропадает солидный кусок ДНК. Что за черт такой ? Я это дело даже клонировал в плазмиду .. и все равно размер вставки явно не тот. пить надо менше |
электрик василий5 |
(Asterix @ 20.07.2020 23:56) Ну что господа , доигрались , и в [pJET] клонироваться отказался мой [CAS9], 7 клонов проверил - пустота. Контроли все в норме . Это именно он , сам ген чудит. Вот ведь назадача какая... Почему он только в оригинальном векторе [ pDE-Cas9] и в той самой конфигурации с интроном внутри промотора существоивать может ? Отчего он не хочет модифицироваться и клонироваться в другие конструкции? Ну и должен сказать что я сделал контроль; которого никто не делает и зафигачил этот вектор с [ CAS9] но без специфической [gRNA] в табак. Клоны уже начали появляться .. но на них страшно смотреть... они весьма потрепанные какие-то что ли ... морфология сильно отличается от обычной. .. А ведь многие наверное думают что это у них специфические эффекты такие оттого что они туда красиво задизайненный на бесплатном сайте [Chop-Chip] олиг вставили и все такое .. ну и да сиквенируют ПЦР-продукт и видят что ген поменялся в нужном месте, и делают вывод что фенотип от этого генного изменения и изменился ... а контроля то и нет.. Сделайте просто [CAS9] с посторонней какой [sgRNA] и сравните с вашей ...может и эффект увидите но он один и тот же . Что в контроле что в опыте . тебеж придлагали закажи проффи ато сам да сам |
Asterix Постоянный участник |
|
P.P.Gariaev Участник |
Ссылка на исходное сообщение Петровичь , я же тебя не кусаю же , помогал же вот проект написать с ГФП ... найди себе толкового аспиранта пусть работает , дело делает. А финансирование можно получить из практическлого примернения твоей инновационной технологии Берем коноплю хорошего забористого сорта типа Белая Вдова например и переносим при помощи мШЭИ несколько генов из нее в другое растение , ну такое которое не является подозрительным для полиции. Ну например в табак. И растим этот новый сорт , лазерный ГМО табачок, на даче , сущим и оптом продаем .. Любителям. Табак в теплице можно круглый год растить , по 4 урожая снимать. Под такую программу ту запросто найдешь себе аспиранта ... надо просто красиво все ему рассказать-показать и перспективы обрисовать у этой технологии. Потом ведь можно то же самое и с помидорчиками и с огурчиками и с картофелем ... Тебе просто как неограненому алмазу нужен профессиональный огранщик, для презентаций. Станешь бриллиантом. -------------------------- ПГ: Астерикс, можете и кусать меня, поскольку делаете это профессионально. А это полезно. И я не цепляюсь за Вас, но пытаюсь обсудить некие идеи. По тем же соображениям. Надеюсь, эта Ваша тема защищена от бессмысленной резни vb... Идею я высказал в мол. и клет биологии в ответ на Ваши непонятные потери кусков ДНК в ПЦР. Мне они кажутся понятными... Итак: Мы получили первично безматричные ПЦР-овеществленные гены поджелудочной железы (ПЖЖ) из мШЭИ спектра клеток ПЖЖ. При этом в ряде случаев в ПЦР были получены целевые реальные гены, сочетающийся с размытыми фрагментами (шмерами), что говорит о нечётком отжиге праймеров. Как это имело место в случае с генами HNF6 и HLXB9. Иногда, как в случае с генами HLXB9 и NEUROD1, шмер имел вид дополнительных бэндов – продуктов с уменьшенной молекулярной массой по сравнению с целевым продуктом. Напомню, что мы уже опубликовали данные о материализации фрагмента ДНК плазмиды из ее мШЭИ спектра в ПЦР. Ссылку неоднократно давал. Нечеткость отжига праймеров в таком варианте биосинтеза генов в ПЦР из их мШЭИ спектров вообще-то ставит вопрос – а на чём идет отжиг? Ведь вещественные матрицы генов изначально в нашей ПЦР системе не существуют… . Вместо вещественных матриц генов - физическое спинтронное поле в составе электромагнитного вторичного лазерного (ЛГН-303) ИЗЛУЧЕНИЯ, то есть это Квантовые Эквиваленты Генов (КЭГ). То есть мы получили первично безматричные, но ПЦР-овеществленные, гены поджелудочной железы (ПЖЖ) из мШЭИ спектров клеток ПЖЖ человека. При этом в ряде случаев в ПЦР были получены целевые реальные гены, сочетающийся с размытыми фрагментами (шмерами), что говорит о нечётком отжиге праймеров. Это имело место в случае с генами HNF6 и HLXB9. С генами HLXB9 и NEUROD1 их шмеры имели вид дополнительных бэндов – продуктов с УМЕНЬШЕННОЙ молекулярной массой по сравнению с целевым продуктами. Напомню, что мы уже опубликовали данные о материализации фрагмента ДНК плазмиды из ее мШЭИ спектра в ПЦР. Ссылку неоднократно давал. Нечеткость отжига праймеров в таком варианте биосинтеза генов в ПЦР из их мШЭИ спектров вообще-то ставит вопрос – а на чём идет отжиг? Ведь вещественных матриц генов ДО НАЧАЛА РАБОТЫ ПЦР ЕЩЕ НЕТ…. И следовательно, праймерам некуда садиться. Но это вопрос к физикам-теоретикам. Например, М.Питканен оперирует понятиями Темной ДНК применительно к фактам фантомов (квантовых эквивалентов) ДНК, которые могут проявляться в естественных условиях и приборно фиксироваться DNA Decipher Journal j July 2020 j Volume 10 j Issue 1 j pp. 07-13 7 M.Pitkanen, New Results about Dark DNA Inspired by the Model for Remote DNA Replication Понимаю эмоции мол. биологов, которые могли сталкиваться с этими феноменами, как это, возможно, произошло с Asterix-ом. При ПЦР манипуляциях вполне возможны незапланированные и непонимаемые феномены участия фоновых фантомных ДНК, искажающих ожидаемые «нормальные» результаты. Тут можно только посочувствовать. Но лучше попытаться разобраться, отслеживая такие «аномалии» при работе с ПЦР. А их, наверно, много. Но "аномалии" не показывают или игнорируют . А зря. Добавлю еще и то, что дополнительно к этим фокусам получили (in prepare) то, что ПЦР продукт может воспроизводимо флуктуировать по выходу, вплоть до полного исчезновения. Об этом кратко говорил в моей почему-то закрытой теме. Закрывай-не закрывай, а феномен-то все настойчивее стучит по мозгам. Понимаю эмоции мол. биологов, которые могли сталкиваться с этими феноменами, как это, вероятно, произошло с Asterix-ом. При ПЦР манипуляциях вполне возможны незапланированные феномены участия фоновых фантомных ДНК, искажающих ожидаемые «нормальные» результаты. Тут можно только посочувствовать. Но лучше попытаться разобраться, отслеживая такие «аномалии» при работе с ПЦР. А их, наверно, много. Но это не показывают или игнорируют . А зря. Добавлю еще и то, что дополнительно к этим фокусам получили (in prepare) то, что ПЦР продукт может воспроизводимо флуктуировать по выходу, вплоть до полного исчезновения. Но это уже другая история. Сейчас нам осталось секвенировать материализованные гены и сравнить их последовательности с уже известными. Собственно, мы это уже делали, но повторяем в расширенном варианте для публикации в рейтинговом журнале. Протокол экспериментов отработан Спектры мШЭИ генов ПЖЖ имеются. Праймеры мы синтезировали, но лучше сделать свои. Все это могу выслать имэйлом или дать в моем сайте. Но при этом публикация будет невозможной. Железно необходимо независимое воспроизведение нашей работы. И параллельные публикации. Возьметесь за независимую работу? Тут предлагал уже с более простой работой, с плазмидой. Но мямлят.. Сообщение было отредактировано P.P.Gariaev - 02.08.2020 21:41 |
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
1. На molbiol.ru еще возможно обсуждение вопросов практической мокрой работы? 2. Пидарас Гаряев все еще активен? |
P.P.Gariaev Участник |
(Tuco Ramires @ 06.08.2020 01:14) Зашел и обомлел, ажно до слез умиления. Две вещи потрясли меня. 1. На molbiol.ru еще возможно обсуждение вопросов практической мокрой работы? 2. Пидарас Гаряев все еще активен? Очередной беспредел ничтожества, долго молчавшего. Пшол вон. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |