Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* ПЦР -- контаминация --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 26.05.2020 23:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Прямо SOS! Проблема с контаминацией, кто нибудь готов помочь? У нас небольшая ПЦР-лаборатория при городской больнице, мы практики, поэтому нужны реальные практические советы.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.05.2020 23:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Да кто вам поможет .. купите специальный спрэй для уничтожения ДНК и обрабатывайте им все. Их полно есть в продаже .

Ну и проверьте сотрудников , поставте туда потайную видеокамеру, может они во время постановки реакции разговаривают .. а микрокапельки слюны из рта так и летят вокруг. Вот вам и контаминация человеческим аэрозолем.

Я помнится студенткам нашим устал обьяснять такие элементарные вещи .. Они реально не понимали что при разговоре летит слюна ... даже еслиу ее и незаметно глазом.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Vista
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 26.05.2020 23:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Выделяет одинокий сотрудник в противочумном костюме
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 26.05.2020 23:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

1) не могу разобраться, можно ли обрабатывать ламинар хлорсодержащими средствами, кто что говорит. ЧАСы нам запретили.
2) как правильно сделать смывы на ампликоны в зоне выделения. Правда ли, что ампликоны вымываются при отмывках?
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 26.05.2020 23:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

А, ещё где можно посмотреть эти спреи?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.05.2020 05:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

1) самый распространенный случай ампликоны попали в реактивы.
Лечится заменой всего набора реактивов на новый. А так же разаликвочиванием всех стоков при поступлении новой партии реактивов. Соответственно при появлении ложно положительных результатов вскрывается новый набор(или новый набор аликвот) проверяется, если ложно положительные результаты воспроизводятся. Значит загрязнены не реактивы.
2)загрязнение автоматических пипеток(дозаторы, сэмплеры). Лечится либо заменой комплекта дозаторов на новый, либо разборкой и очисткой(автоклавированием) дозаторов.
3) Загрязнение поверхностей на рабочих местах. Особенно это касается клавиатуры приборов и компьютеров. Но и других поверхностей тоже.

Правила простые: Никогда после ПЦР не открывать пробирки в зоне ,где выделяется НК и тем более там, где идёт подготовка проб для ПЦР. Если у вас количественный ПЦР, то ПЦР пробы вообще никогда не открываются, а утилизируются в закрытом виде. Для выделения, пробоподготовки и фореза, должны быть отдельные наборы автоматических пипеток и отдельная спец одежда. У вас должно быть три рабочих зоны 1-выделение 2-пробы ПЦР 3-анализ проб . Движение проб возможно только в порядке 123 помойка. Всякие перемещения в обратном порядке категорически запрещаются. Контрольно положительная проба всегда обрабатывается последней.

Смыв на анализ делается тампоном с автоклавированной водой.

Мой любимый НК-разрушающий раствор это 0.3% раствор перекиси водорода в 10-50мМ соляной кислоте. Этот раствор очень коррозивен по отношению к металлам. Раствор не хранится , а готовится свежим перед обработкой.

Так же помогает прожигание ультра фиолетом. Чистка стальных плунжеров автоматических пипеток той же кислотой, но без перекиси с последующей протиркой спиртом и прожиганием УФ. Сарториусовские(биохитовские) пипетки содержат фильтры, фильтры не моются, а меняются на новые. Так же многие автоматические пипетки предполагают автоклавирование - это так сказать последний вариант, т.к. эта операция ухудшает здоровье пипетки.

Ламинар можно протирать растворами с активным хлором, но кислота или кислота+перекись лучше. И не забывать про УФ.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): -Ъ-, dk
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 27.05.2020 11:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Использование носиков с фильтрами - профилактика контаминации, передающейся через дозаторы.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Vista
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 27.05.2020 12:54     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Vista @ 27.05.2020 00:12)
Ссылка на исходное сообщение  Прямо SOS! Проблема с контаминацией, кто  нибудь готов помочь? У нас небольшая ПЦР-лаборатория при городской больнице, мы практики, поэтому нужны реальные практические советы.

Вы практически не дали никакой инфо, кроме противочумного костюма, чтобы РЕАЛЬНО помочь Вам.
Неплохо бы сначала узнать профиль этой небольшой лаборатории при больнице - что обнаруживаете, образцы для анализа, выделение НК, реалтайм или форез и в конце-концов от кого изделие, название и т.д....
Подозреваю, что это кросс-контаминация.
Но больше всего подозрений на сам кит слегка контаминированный "оттуда же" с производства... yes.gif
Это тот случай, когда с водой все чисто, а с выделенной из отрицательного образца НК часто поднимается сигнал.
Звоните производителю и меняйте кит.
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 10:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(-Ъ- @ 27.05.2020 13:54)
Ссылка на исходное сообщение  Вы практически не дали никакой инфо, кроме противочумного костюма, чтобы РЕАЛЬНО помочь Вам.
Неплохо бы сначала узнать профиль этой небольшой лаборатории при больнице - что обнаруживаете, образцы для анализа, выделение НК, реалтайм или форез и в конце-концов от кого изделие, название и т.д....
Подозреваю, что это кросс-контаминация.
Но больше всего подозрений на сам кит слегка контаминированный "оттуда же" с производства... yes.gif
Это тот случай, когда с водой все чисто, а с выделенной из отрицательного образца НК часто поднимается сигнал.
Звоните производителю и меняйте кит.

Прошу прощения, информацию не дала, вдруг никто не откликнется))) и так, работаем сейчас на выявление РНК коронавируса SARS COV2. Сотрудники: опыт только у меня, больше 10 лет. Остальные что называется с нуля. Сначала, наборами Вектор, сейчас ВекторБест. CFX -96, зоны, ламинары, наконечники с фильтрами всё есть. Разделение зон, спирт, УФ есть. В день 300 400 проб. Выделение на магнитный сорбент. Через день-два выраженная контаминация( сотрудница из выделялки орет благим матом, что делает всё правильно, что мы портачим. Амплификация в стрипах, закрытых спец.крышками
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 10:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Продолжение: Делали смывы с полным выделением, говорит, что если загрязнение ампликонами зоны выделения, то при отмывке они вымываются и мы их не детектируем. Так ли это? Как определить, какая контаминация? Ампликонами? НК? Или перекрестная? П.сы. Фасовка реактивов очень маленькая 12-15 исследований, вряд ли загрязнение реактивов. При повторе проходят отрицательными, вряд ли от производителя. Помогите, пожалуйста 😇
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 10:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

А, ещё) смеси для амплификации не готовим. В стрипах уже готовая леофилизированная сухая смесь от производителя. Только кап туда 50мкл выделенной РНК и всё )

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.05.2020 11:47     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Ну вот, другое дело. Теперь все понятно.
Про ампликоны и их "вымывание"( no.gif ) забудьте - у Вас же реал-тайм! Вы же пробирки после реакции не открываете и не размазываете по столам и рукам. В реал-тайм ПЦР контаминации ампликонами нет!
1. ПЦР смеси 100% готовые на производстве и вдруг - контаминация!!! Какой вывод?
Правильно! Контаминация на производстве, в этих долбанных и сертифицированных GMP условиях умудряются заразиться от положительных контролей (транскриптов, кДНК, ампликонов в конце концов, плазмид...).
И второе - контаминация на стадии пробоподготовки и наиболее вероятное, как я уже говорил в прошлый раз. Громоздкие методы выделения РНК, любые используемые сейчас в КД, даже роботизированные, очень часто приводят к кросс-контаминации. Вы же возитесь вручную с этими магнитными штативами, отсасыванием и д.т., а в самом конце одной пипеткой раскапываете выделенные РНК. Носики фильтром тоже не дают гарантии 100% барьера. Примерно как мед. маски - может защитить, а может - нет.
Внутри лаборатории Вы не преодолеете текущую контаминацию если даже в день после каждого цикла работ будете все мыть и пр.
Меняйте набор, а если все будет повторяться - переходите на другого производителя.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.05.2020 11:48     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(Vista @ 28.05.2020 11:53)
Ссылка на исходное сообщение  А, ещё) смеси для амплификации не готовим. В стрипах уже готовая леофилизированная сухая смесь от производителя. Только кап туда 50мкл выделенной РНК и всё )

Цветочки по ошибке... Пишется лио- smile.gif
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 11:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Поставьте для начала 10 контролей на все и вся . Просто в той же комнате , и без костюма противочумного выделите РНК из нескольких образцов.. Причем пусть 5 образцов сделает обычная сотрудница а еще раз те же самые образцы сделает другой челковек.

Возьмите их сами где-нибудь подальше от вашей больницы и лаборатории.. лучше всего в ближайшем лесу. Поймайте там пяток отдыхающих и попросите помочь науке и практике , сдать вам био-образец анонимно. По два тампона с носа.

Очень может быть что контаминация происходит там где эти образцы берут , в смысле в процедурном кабинете .. ну или кто там у вас первичное звено которое забор образцов делает, может они сами бессимптомные носители и у них кругом этот вирус.

Посмотрите сами как они делают забор проб в реальности , может идеи какие придут откуда контаминация.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 12:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

на производстве наборов есть стандартная система контроля качества , ГМП , так что иногда и на старуху бывает проруха , но так чтоб систематически у них было загрязнение на производстве - это навряд ли ..

Отдел контроля качества там как правило хорошо работает , если он есть конечно. Очевидное фуфло там не пропустят, это же будет выговор начальнику отдела. И финансовые потери ... всю партию отзывать и расходы возмещать на повторный анализ.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.05.2020 12:42     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(Vista @ 28.05.2020 11:53)
Ссылка на исходное сообщение  В стрипах уже готовая леофилизированная сухая смесь от производителя. Только кап туда 50мкл выделенной РНК и всё )

Да, забыл спросить.
А положительный контроль Вы же как-то вносите в эти полностью готовые смеси и наверняка той же пипеткой?
Неужели и смеси с положительным контролем тоже сухие?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 13:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Выделение на магнитный сорбент.

Сразу экстракт на сорбент или есть еще одна стадия с разделением фаз?
Только кап туда 50мкл выделенной РНК и всё )

Пардон! А ревертирование? Или тогда программа ПЦР должна включать предварительную стадию ревертирования на 37 градусах.
Делали смывы с полным выделением, говорит, что если загрязнение ампликонами зоны выделения, то при отмывке они вымываются и мы их не детектируем. Так ли это?

Зачем делать смывы с полным выделением? Берете сначала проверяете пипетки. Для этого просто раскапываете из проверяемой пипетки в пробирку с ПЦР набором (желательно в нескольких повторностях) автоклавированную воду из ампул для иньекций и проводите реакцию. Тоже с и со смывами. Стерильную или автоклавированную вату смочить той же водой протереть поверхность. Потом тампон экстрагировать опять водой и экстракт в реакцию.

Если у вас ревертирование идет в наборе, то убрав стадию ревертирования из программы , и начав сразу с 95 градусного прогрева. Вы сможете отличить РНК или ДНК является загрязнителем?

забудьте - у Вас же реал-тайм! Вы же пробирки после реакции не открываете и не размазываете по столам и рукам.


А хрен их знает, может именно так они и делают. smile.gif shuffle.gif weep.gif mad.gif

Неужели и смеси с положительным контролем тоже сухие?


А почему нет? Лиофилизованная ДНК матрица прекрасно хранится.

Сообщение было отредактировано MMM - 28.05.2020 13:44

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Vista
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.05.2020 14:58     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

МММ,
- нет там никаких предварительных разделений фаз. ГТЦ + сорбент и пошло поехало...
- ОТ-ПЦР в одной пробирке и в одном буфере. По другому в КДЛ нельзя. Отстаете!
- про проверку пипеток Вы правильно намекнули, но это такое..., короче ЭТО не предусмотрено в КДЛ.
- убрать ревертирование практически невозможно. Пока температура смеси от комнатной (несколько минут) до 95 доползает (еще минута) ревертаза уже насинтезирует кучу всего. no.gif
- РНК контрольная в лиофилизованной реакционной смеси - идеальный вариант. Я тоже бы так делал. smile.gif
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 15:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(-Ъ- @ 28.05.2020 12:48)
Ссылка на исходное сообщение  Цветочки по ошибке... Пишется лио-  smile.gif

Спасибо за поправку), так то я грамотная)))) писала на работе с мобильного
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 15:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(-Ъ- @ 28.05.2020 13:42)
Ссылка на исходное сообщение  Да, забыл спросить.
А положительный контроль Вы же как-то вносите в эти полностью готовые смеси и наверняка той же пипеткой?
Неужели и смеси с положительным контролем тоже сухие?

Да, конечно, этой же пипеткой. Контроль как пробы вносим, для cov он готовый жидкий
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.05.2020 16:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

А в чём у вас выражается контаминация?
Есть продукт в контроле выделения? В отрицательном контроле? В заведомо отрицательных пробах? На каком цикле появляется контаминация?
Просто из любопытства - положительным контролем служит плазмида или всё-таки РНК?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.05.2020 18:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(-Ъ- @ 28.05.2020 15:58)
Ссылка на исходное сообщение  
  - убрать ревертирование практически невозможно. Пока температура смеси от комнатной (несколько минут) до 95 доползает (еще минута) ревертаза уже насинтезирует кучу всего. no.gif 

дерьмо вопрос - просто капаем в стоящую на 95 градусах сухую пробирку воды и все ревертазе - кирдык.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Asterix
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 21:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(semi @ 28.05.2020 17:56)
Ссылка на исходное сообщение  А в чём у вас выражается контаминация?
Есть продукт в контроле выделения? В отрицательном контроле? В заведомо отрицательных пробах? На каком цикле появляется контаминация?
Просто из любопытства -  положительным контролем служит плазмида или всё-таки РНК?

Выражается в большом количестве положительных проб (более половины постановки), Ct
близкие к пороговым, небольшие амплитуды. Мы так то избалованы готовым программным обеспечением))), может чего не так назову, соррян) У нас результат +, минус, недействит.
Отрицат. контроль по разному проходит, в основном норм. Что содержит положительный, не знаю. В тестах на гепатит лиофилизат, на корону - жидкий
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 21:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(-Ъ- @ 28.05.2020 15:58)
Ссылка на исходное сообщение  МММ,
  - нет там никаких предварительных разделений фаз.  ГТЦ + сорбент и пошло поехало...
  - ОТ-ПЦР в одной пробирке и в одном буфере. По другому в КДЛ нельзя. Отстаете!
  - про проверку пипеток Вы правильно намекнули, но это такое..., короче ЭТО не предусмотрено в КДЛ.
  - убрать ревертирование практически невозможно. Пока температура смеси от комнатной (несколько минут) до 95 доползает (еще минута) ревертаза уже насинтезирует кучу всего. no.gif 
  - РНК контрольная в лиофилизованной реакционной смеси - идеальный вариант. Я тоже бы так делал. smile.gif

там все сразу в одной пробирке), никакого дополнительного ревертирования)
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 21:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Я тут еще с сайтом разобраться не могу, как отвечать на много цитат сразу?
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 28.05.2020 21:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

сейчас позвонила на работу, следующая постановка прошла хорошо! Разница в серии набора!!!
Неужели нашли?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 06:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(Vista @ 28.05.2020 22:50)
Ссылка на исходное сообщение  сейчас позвонила на работу, следующая постановка прошла хорошо! Разница в серии набора!!!
Неужели нашли?

То бишь производственный брак? Эхе-хе. А я вектор- бест'у доверял. weep.gif
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 06:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Вы им хотя бы инфу вышлите. Может этот лот и в других лабах есть. Пусть хоть вышлют информационное письмо, чтоб другие не трахались.

Контаминация - это когда в минус контролях всегда положительный ответ и во всех пробах положительный ответ! Когда у вас в рабочих пробах все больные, а минус контроли показывают четкий воспроизводимый минус - это фантастика или чрезвычайная везуха(вроде зеро на рулетке)

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): dk
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 29.05.2020 08:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

(MMM @ 29.05.2020 07:20)
Ссылка на исходное сообщение  Вы им хотя бы инфу вышлите. Может этот лот и в других лабах есть. Пусть хоть вышлют информационное письмо, чтоб другие не трахались.

Контаминация - это когда в минус контролях всегда положительный ответ и во всех пробах положительный ответ! Когда у вас в рабочих пробах все больные, а минус контроли показывают четкий воспроизводимый минус  - это фантастика или чрезвычайная везуха(вроде зеро на рулетке)

Так что же у нас? Бест же будет отпираться) их же менеджер нам помогает искать причину контаминации и возможность её ампликонами не отрицает. Позвоню конечно, но.... да и у нас, 2 дня норм, потом 2-3 постановки в мусор
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 29.05.2020 09:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

(MMM @ 29.05.2020 07:20)
Ссылка на исходное сообщение  Вы им хотя бы инфу вышлите. Может этот лот и в других лабах есть. Пусть хоть вышлют информационное письмо, чтоб другие не трахались.

Контаминация - это когда в минус контролях всегда положительный ответ и во всех пробах положительный ответ! Когда у вас в рабочих пробах все больные, а минус контроли показывают четкий воспроизводимый минус  - это фантастика или чрезвычайная везуха(вроде зеро на рулетке)

А если это кросс-контаминация, она же может быть не на всю плашку, а с какой-то пробы? Нас в ИЛС учили, если от начала до конца вести все пробы по номерам, например, с 1-ой по 10-ую, то можно понять с какой началась контаминация
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 09:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

(MMM @ 29.05.2020 04:08)
Ссылка на исходное сообщение  То бишь производственный брак? Эхе-хе. А я вектор- бест'у доверял. weep.gif

и на проруху бывает старуха. от косяков никто не застрахован, тем более в такой спешке.
но, справедливости ради, когда я раньше плотно работал с подобными конторами, бест был, наверное, самый адекватный в смысле приемки претензий, замены наборов и устранения причин. некоторые конторы, аффилированные с органами надзора вообще всех вертели и слали туда же.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 10:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

(Vista @ 29.05.2020 09:34)
Ссылка на исходное сообщение  Так что же у нас? Бест же будет отпираться) их же менеджер нам помогает искать причину контаминации и возможность её ампликонами не отрицает. Позвоню конечно, но.... да и у нас, 2 дня норм, потом 2-3 постановки в мусор

У вас +, как я понял, на грани. Т.е. если есть контаминация то мизерная. При смене лота фигня пропадает. Это может быть даже просто taq man подтухший лабильный разваливается по мере циклов нагрева и сигнал растет. Так что скорее всего косяк производителя. В принципе они у себя это могут проверить на своем сохраненном лоте.

Как можно растянуть контаминацию на несколько пробирок начиная с какой-то я представляю слабо. Это можно сделать только загрязнив пипетку или раствор общего реагента(но у вас нет общих реагентов) или при выделении через общий реагент(лизирующий буфер). А выделенные пробы как можно перекрестно растянуть - непонятно(ну только через пипетку).

Сообщение было отредактировано MMM - 29.05.2020 10:26
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 29.05.2020 11:10     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

Вариант с пипеткой, пожалуй, самый реальный. Но и "лечится" простым автоклавированием (если пипетко позволяет). А так здесь на целый манул по борьбе с контаминацией советов надавали - очень по делу. Но, сколько я сталкивался с "засёром" в своей практике - вариант один "животное уничтожается, помещение подвергается полной стерилизации". Обидно, затратно - но других вариантов нет.
Участник оффлайн! Vista




 прочитанное сообщение 29.05.2020 11:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

Всем огромное спасибо 😊 многое начинает проясняться. Если интересно, буду держать в курсе дела . Если ещё какие мысли появятся , пишите . Буду рада
Участник оффлайн! Panaev
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 13:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

(Vista @ 28.05.2020 22:17)
Ссылка на исходное сообщение  Выражается в большом количестве положительных проб (более половины постановки), Ct
близкие к пороговым, небольшие амплитуды. Мы так то избалованы готовым программным обеспечением))), может чего не так назову, соррян)  У нас результат +, минус, недействит.
Отрицат. контроль по разному проходит, в основном норм. Что содержит положительный, не знаю. В тестах на гепатит лиофилизат, на корону - жидкий

То есть отрицательный контроль проходит как отрицательный?
Просто неожиданно большое количество положительных результатов среди образцов?
Тогда это вряд ли проблема лаборатории.
1. Контаминация может быть на этапе отбора проб. Можно попытаться проследить корреляцию между источником образцов и результатами.
2. Наборы могут быть не очень специфичными. Бывает. Реагируют на какой-нибудь микроб, распространенный неравномерно в популяции. Вот у вас волнами и находит.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Vista
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 14:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

Да кстати , проще всего посмотреть на то что наамплифицировалось на агарозном форезе обычном , проверьте 10-20 проб своих.

Если у вас там в позитивах везде именно то что ожидается и идентично позитивному контролю , то скорее всего контаминация где-то таки на этапе пробоотбора.

А если у вас там другого размера ампликоны есть , отличные от позитивного контроля вашего .. то очевидно что проблема с китом ,

ну то есть дизайн сырой, недопроверенный на массовом скрининге мультицентровом.

Хорошо что вы обратили внимание на эту странность ... правильно сделали.. Осталось еще один форез и можно писать заметку в какое-нибудь Клинико-Диагностическое Дело.

Если у вас нет кухни для агарозного ДНК фореза , то просто отдайте пробирки после реакции в научную лабораторию ... там с удовольствием вам помогут , это несложно и ничего не стоит.
Участник оффлайн! Begemotik
Участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 14:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

(Panaev @ 29.05.2020 11:38)
Реагируют на какой-нибудь микроб, распространенный неравномерно в популяции. Вот у вас волнами и находит.
дельное, кстати замечание. Например, простуженным не рекомендуют выполнять постановки
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 29.05.2020 17:25     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

(MMM @ 28.05.2020 19:22)
Ссылка на исходное сообщение  дерьмо вопрос - просто капаем в стоящую на 95 градусах сухую пробирку воды и все ревертазе - кирдык.

Теоретик, как Вы себе представляете на реалтайм циклере на 95 гр. Ревертазу убиватьno.gif .
Vista,
Я ещё раз говорю, что Вектор бест производит, говоря по-русски, "одноступенчатый" ОТ-ПЦР и в лабах эти ферменты в глаза не видят. Там тупо делают, то что прописано и попробуй делай шаг в сторону - сразу расстрел в виде контаминации.
Частые контаминации с наборами в кдл - это не совершенные наборы!
1. На уровне отбора проб и прободготовки - много манипуляций, долго, трудоемко и, в итоге, кросс-контаминация! А стремиться надо к "direct RT-PCR" - это без выделения РНК.
2. На уровне ПЦР - никаких манипуляций с жидким К+. Иначе гарантированный разнос пипеткой. Открыл ПЦР пробирку и добавил РНК (лизат), а в К- и К+ - воды (растворителя) и все - на реакцию. По другому - только 100% роботизированный автомат как у Роша!
Вся ответственность на производителях китов, персонал лабораторий тут не причём.
О других производителях, молчу... weep.gif

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 29.05.2020 17:45

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Vista
Участник оффлайн! noushadamir

Dubai



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  29.05.2020 17:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

Avast Safezone Web Browser `
We already know about Avast and the powerful antivirus software that they make. This time, you will get to know a lot about the great features that come along with this Avast Safezone browser.

Это СПАМ!
Это сообщение — спам.
-Ъ-
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 29.05.2020 18:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

Возможно, у Вас контаминация Положительным Контролем (как правило это тот же ампликон). Используйте для внесения ПК отдельную пипетку, и вносите его в самом конце, когда рабочие образцы уже раскапаны.
В крайнем случае можете попробовать наборы других производителей. Их - масса. Есть и в лио- формате
Участник оффлайн! Begemotik
Участник



 прочитанное сообщение 30.05.2020 08:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

не хотел раньше лезть с вопросом, пока проблема не разрешится, но поскольку автор удовлетворен, небольшой оффтоп:
(-Ъ- @ 29.05.2020 15:25)
стремиться надо к "direct RT-PCR" - это без выделения РНК.

представим, что нет потока и необходимости перерабатывать 1000 проб за смену, а есть задача усилить чувствительность. В связи с этим: директ-от-пцр - это же, скорее, вынужденное решение? Я так понимаю оно убивает любые попытки довести чувстительность до максимума.
И, наверное, таким способом и соскобом с глотки вряд ли можно что-то поймать у бессимптомников? Или всё не так?
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 31.05.2020 12:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

Смотрю на инструкцию CDC и вижу, что у них положительный контроль - это in vitro транскрибированная РНК. И это правильно. Что служит положительным контролем в отечественных наборах? Меня терзают смутные сомнения, что это ампликон, заклонированный в плазмиду.
...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC)
For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ...
https://www.fda.gov/media/134922/download
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 31.05.2020 16:12     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

(Begemotik @ 30.05.2020 09:13)
Ссылка на исходное сообщение  не хотел раньше лезть с вопросом, пока проблема не разрешится, но поскольку автор удовлетворен, небольшой оффтоп:

представим, что нет потока и необходимости перерабатывать 1000 проб за смену, а есть задача усилить чувствительность. В связи с этим: директ-от-пцр - это же, скорее, вынужденное решение? Я так понимаю оно убивает любые попытки довести чувстительность до максимума.
И, наверное, таким способом и соскобом с глотки вряд ли можно что-то поймать у бессимптомников? Или всё не так?

Ессно, не так. Какой смысл делать директ ОТ-ПЦР, если реакция ингибирована. Наоборот, матрица без потерь и развала. Надо только "уметь ее готовить".
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 31.05.2020 16:31     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

(semi @ 31.05.2020 13:51)
Ссылка на исходное сообщение  Смотрю на инструкцию CDC  и вижу, что у них положительный контроль - это in vitro транскрибированная РНК. И это правильно. Что служит положительным контролем в отечественных наборах? Меня терзают смутные сомнения, что это ампликон, заклонированный в плазмиду.
...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC)
For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ...
https://www.fda.gov/media/134922/download

На самом деле изготовление транскрипта когда есть под рукой нужный ампликон с Т7 промотором совсем просто. Самое сложное - в каком виде подавать его в качестве (+) контроля в китах umnik.gif
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 31.05.2020 16:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

(-Ъ- @ 31.05.2020 17:31)
Ссылка на исходное сообщение  На самом деле изготовление транскрипта когда есть под рукой нужный ампликон с Т7 промотором совсем просто.  Самое сложное - в каком виде подавать его в качестве (+) контроля в китах umnik.gif

CDC поставляет РНК положительного контроля в лиофизованном виде. После разведения надо сделать аликвоты по 30 мкл, аликвоты заморозить на -70 oC. После размораживания аликвоту используют, её неиспользованные остатки выбрасывают.


...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC) Preparation:
1) Precautions: This reagent should be handled with caution in a dedicated nucleic acid handling
area to prevent possible contamination. Freeze-thaw cycles should be avoided. Maintain on ice
when thawed.
2) Resuspend dried reagent in each tube in 1 mL of nuclease-free water to achieve the proper
concentration. Make single use aliquots (approximately 30 μL) and store at ≤ -70oC.
3) Thaw a single aliquot of diluted positive control for each experiment and hold on ice until adding to plate. Discard any unused portion of the aliquot...
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 31.05.2020 20:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

(semi @ 31.05.2020 10:51)
Ссылка на исходное сообщение  Смотрю на инструкцию CDC  и вижу, что у них положительный контроль - это in vitro транскрибированная РНК. И это правильно. Что служит положительным контролем в отечественных наборах? Меня терзают смутные сомнения, что это ампликон, заклонированный в плазмиду.
...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC)
For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ...
https://www.fda.gov/media/134922/download

ну вы реально велосипед изобретаете.
это понятно любому, кто сталкивался с клинической диагностикой, даже не в качестве разработчика.
использование ампликонов в качестве положительного контроля неприемлимо даже при детекции днк, не то что рнк. и любой уважающий себя производитель не марается таким. хотя в условиях спешки все может быть, я уже ничему не удивляюсь.
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.06.2020 11:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

(vb @ 31.05.2020 21:48)
Ссылка на исходное сообщение  ....
это понятно любому, кто сталкивался с клинической диагностикой, даже не в качестве разработчика...

Не согласна с этим тезисом. Сталкивалась с множеством безграмотных.

Мне любопытна история про положительный контроль для теста на РНКовый вирус.

Судя по тому, что пишет уважаемая Виста про раствор для положительного контроля, в ее лаборатории работают с ДНК в качестве положительного контроля.

Про наборы Вектора пишут, что у них нет внутреннего РНКового контроля.
"...одним из недостатков «векторовского» набора является то, что в нем есть лишь реагенты для ПЦР, то есть третьей, заключительной операции анализа. А для выделения РНК и обратной транскрипции предлагается использовать наборы других производителей. В комплектации набора также отсутствует внутренний контрольный образец (ВКО) — молекула РНК, защищенная от действия нуклеаз, которую добавляют в образец и которая вместе с мишенью проходит все стадии анализа..."
https://pcr.news/stati/test-na-koronavirus-dlya-rossii-2/

Сообщение было отредактировано semi - 01.06.2020 11:10
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.06.2020 12:06     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

(semi @ 01.06.2020 12:06)
Ссылка на исходное сообщение  
Про наборы Вектора пишут, что у них нет внутреннего РНКового контроля.
"...одним из недостатков «векторовского» набора является то, что в нем есть лишь реагенты для ПЦР, то есть третьей, заключительной операции анализа. А для выделения РНК и обратной транскрипции предлагается использовать наборы других производителей. В комплектации набора также отсутствует внутренний контрольный образец (ВКО) — молекула РНК, защищенная от действия нуклеаз, которую добавляют в образец и которая вместе с мишенью проходит все стадии анализа..."
https://pcr.news/stati/test-na-koronavirus-dlya-rossii-2/

А что Вы хотели, когда был "дан приказ ему на запад" за кратчайшие сроки разработать, испытать и ,самое главное, зарегистрировать изделие это медицинское.
И еще наладить массовое производство. Пожалуйста, получите, что хотели.
Мне бы такие скорости. Кстати, Виста получает наборы не от Вектора, а от ВектораБеста, а это совсем другие киты, другой денежный поток и умелое мытье рук smile.gif .
Я еще раз говорю, что изготовить транскрипты не так сложно. За ночь их столько нарабатывается в реакции, аж смесь мутнеет. И к тому же во времена реал тайм ПЦР нет нужды делать их длинными в несколько сот нукл. как раньше это делали во времена ЭФ детекции. Но самое приятное эти коротенькие транскрипты, меньше 100 нукл. в присутствии ингибитора РНК-аз хранятся месяцами в холодильнике. На мой взгляд нет необходимости строить MS2 фаговую "армированную" конструкцию в качестве (+) контролей, внутренних контролей и т.
Участник оффлайн! semi
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.06.2020 12:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

(-Ъ- @ 01.06.2020 13:06)
Ссылка на исходное сообщение  ...Но самое приятное эти коротенькие транскрипты, меньше 100 нукл. в присутствии  ингибитора РНК-аз хранятся месяцами в холодильнике. ..

В простой морозилке? Или вообще при 4 оС?

Сообщение было отредактировано semi - 01.06.2020 12:14
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.06.2020 12:34     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

(semi @ 01.06.2020 13:13)
Ссылка на исходное сообщение  В простой морозилке? Или вообще при 4 оС?

При 2-8 град., в простом холоде. Да и с Ингибитором морозить уже как бы нельзя.
Так что не так страшны эти РНК-азы, как их малюют.

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 01.06.2020 12:45

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): semi

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 17:03
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft