Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Vista |
|
Asterix Постоянный участник |
Ну и проверьте сотрудников , поставте туда потайную видеокамеру, может они во время постановки реакции разговаривают .. а микрокапельки слюны из рта так и летят вокруг. Вот вам и контаминация человеческим аэрозолем. Я помнится студенткам нашим устал обьяснять такие элементарные вещи .. Они реально не понимали что при разговоре летит слюна ... даже еслиу ее и незаметно глазом.
|
Vista |
|
Vista |
2) как правильно сделать смывы на ампликоны в зоне выделения. Правда ли, что ампликоны вымываются при отмывках? |
Vista |
|
MMM Постоянный участник |
Лечится заменой всего набора реактивов на новый. А так же разаликвочиванием всех стоков при поступлении новой партии реактивов. Соответственно при появлении ложно положительных результатов вскрывается новый набор(или новый набор аликвот) проверяется, если ложно положительные результаты воспроизводятся. Значит загрязнены не реактивы. 2)загрязнение автоматических пипеток(дозаторы, сэмплеры). Лечится либо заменой комплекта дозаторов на новый, либо разборкой и очисткой(автоклавированием) дозаторов. 3) Загрязнение поверхностей на рабочих местах. Особенно это касается клавиатуры приборов и компьютеров. Но и других поверхностей тоже. Правила простые: Никогда после ПЦР не открывать пробирки в зоне ,где выделяется НК и тем более там, где идёт подготовка проб для ПЦР. Если у вас количественный ПЦР, то ПЦР пробы вообще никогда не открываются, а утилизируются в закрытом виде. Для выделения, пробоподготовки и фореза, должны быть отдельные наборы автоматических пипеток и отдельная спец одежда. У вас должно быть три рабочих зоны 1-выделение 2-пробы ПЦР 3-анализ проб . Движение проб возможно только в порядке 123 помойка. Всякие перемещения в обратном порядке категорически запрещаются. Контрольно положительная проба всегда обрабатывается последней. Смыв на анализ делается тампоном с автоклавированной водой. Мой любимый НК-разрушающий раствор это 0.3% раствор перекиси водорода в 10-50мМ соляной кислоте. Этот раствор очень коррозивен по отношению к металлам. Раствор не хранится , а готовится свежим перед обработкой. Так же помогает прожигание ультра фиолетом. Чистка стальных плунжеров автоматических пипеток той же кислотой, но без перекиси с последующей протиркой спиртом и прожиганием УФ. Сарториусовские(биохитовские) пипетки содержат фильтры, фильтры не моются, а меняются на новые. Так же многие автоматические пипетки предполагают автоклавирование - это так сказать последний вариант, т.к. эта операция ухудшает здоровье пипетки. Ламинар можно протирать растворами с активным хлором, но кислота или кислота+перекись лучше. И не забывать про УФ.
|
semi Постоянный участник Москва |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Vista @ 27.05.2020 00:12) Прямо SOS! Проблема с контаминацией, кто нибудь готов помочь? У нас небольшая ПЦР-лаборатория при городской больнице, мы практики, поэтому нужны реальные практические советы. Вы практически не дали никакой инфо, кроме противочумного костюма, чтобы РЕАЛЬНО помочь Вам. Неплохо бы сначала узнать профиль этой небольшой лаборатории при больнице - что обнаруживаете, образцы для анализа, выделение НК, реалтайм или форез и в конце-концов от кого изделие, название и т.д.... Подозреваю, что это кросс-контаминация. Но больше всего подозрений на сам кит слегка контаминированный "оттуда же" с производства... Это тот случай, когда с водой все чисто, а с выделенной из отрицательного образца НК часто поднимается сигнал. Звоните производителю и меняйте кит. |
Vista |
(-Ъ- @ 27.05.2020 13:54) Вы практически не дали никакой инфо, кроме противочумного костюма, чтобы РЕАЛЬНО помочь Вам. Неплохо бы сначала узнать профиль этой небольшой лаборатории при больнице - что обнаруживаете, образцы для анализа, выделение НК, реалтайм или форез и в конце-концов от кого изделие, название и т.д.... Подозреваю, что это кросс-контаминация. Но больше всего подозрений на сам кит слегка контаминированный "оттуда же" с производства... Это тот случай, когда с водой все чисто, а с выделенной из отрицательного образца НК часто поднимается сигнал. Звоните производителю и меняйте кит. Прошу прощения, информацию не дала, вдруг никто не откликнется))) и так, работаем сейчас на выявление РНК коронавируса SARS COV2. Сотрудники: опыт только у меня, больше 10 лет. Остальные что называется с нуля. Сначала, наборами Вектор, сейчас ВекторБест. CFX -96, зоны, ламинары, наконечники с фильтрами всё есть. Разделение зон, спирт, УФ есть. В день 300 400 проб. Выделение на магнитный сорбент. Через день-два выраженная контаминация( сотрудница из выделялки орет благим матом, что делает всё правильно, что мы портачим. Амплификация в стрипах, закрытых спец.крышками |
Vista |
|
Vista |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Про ампликоны и их "вымывание"( ) забудьте - у Вас же реал-тайм! Вы же пробирки после реакции не открываете и не размазываете по столам и рукам. В реал-тайм ПЦР контаминации ампликонами нет! 1. ПЦР смеси 100% готовые на производстве и вдруг - контаминация!!! Какой вывод? Правильно! Контаминация на производстве, в этих долбанных и сертифицированных GMP условиях умудряются заразиться от положительных контролей (транскриптов, кДНК, ампликонов в конце концов, плазмид...). И второе - контаминация на стадии пробоподготовки и наиболее вероятное, как я уже говорил в прошлый раз. Громоздкие методы выделения РНК, любые используемые сейчас в КД, даже роботизированные, очень часто приводят к кросс-контаминации. Вы же возитесь вручную с этими магнитными штативами, отсасыванием и д.т., а в самом конце одной пипеткой раскапываете выделенные РНК. Носики фильтром тоже не дают гарантии 100% барьера. Примерно как мед. маски - может защитить, а может - нет. Внутри лаборатории Вы не преодолеете текущую контаминацию если даже в день после каждого цикла работ будете все мыть и пр. Меняйте набор, а если все будет повторяться - переходите на другого производителя. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Vista @ 28.05.2020 11:53) А, ещё) смеси для амплификации не готовим. В стрипах уже готовая леофилизированная сухая смесь от производителя. Только кап туда 50мкл выделенной РНК и всё ) Цветочки по ошибке... Пишется лио- |
Asterix Постоянный участник |
Возьмите их сами где-нибудь подальше от вашей больницы и лаборатории.. лучше всего в ближайшем лесу. Поймайте там пяток отдыхающих и попросите помочь науке и практике , сдать вам био-образец анонимно. По два тампона с носа. Очень может быть что контаминация происходит там где эти образцы берут , в смысле в процедурном кабинете .. ну или кто там у вас первичное звено которое забор образцов делает, может они сами бессимптомные носители и у них кругом этот вирус. Посмотрите сами как они делают забор проб в реальности , может идеи какие придут откуда контаминация.
|
Asterix Постоянный участник |
Отдел контроля качества там как правило хорошо работает , если он есть конечно. Очевидное фуфло там не пропустят, это же будет выговор начальнику отдела. И финансовые потери ... всю партию отзывать и расходы возмещать на повторный анализ. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Vista @ 28.05.2020 11:53) В стрипах уже готовая леофилизированная сухая смесь от производителя. Только кап туда 50мкл выделенной РНК и всё ) Да, забыл спросить. А положительный контроль Вы же как-то вносите в эти полностью готовые смеси и наверняка той же пипеткой? Неужели и смеси с положительным контролем тоже сухие? |
MMM Постоянный участник |
Выделение на магнитный сорбент. Сразу экстракт на сорбент или есть еще одна стадия с разделением фаз? Только кап туда 50мкл выделенной РНК и всё ) Пардон! А ревертирование? Или тогда программа ПЦР должна включать предварительную стадию ревертирования на 37 градусах. Делали смывы с полным выделением, говорит, что если загрязнение ампликонами зоны выделения, то при отмывке они вымываются и мы их не детектируем. Так ли это? Зачем делать смывы с полным выделением? Берете сначала проверяете пипетки. Для этого просто раскапываете из проверяемой пипетки в пробирку с ПЦР набором (желательно в нескольких повторностях) автоклавированную воду из ампул для иньекций и проводите реакцию. Тоже с и со смывами. Стерильную или автоклавированную вату смочить той же водой протереть поверхность. Потом тампон экстрагировать опять водой и экстракт в реакцию. Если у вас ревертирование идет в наборе, то убрав стадию ревертирования из программы , и начав сразу с 95 градусного прогрева. Вы сможете отличить РНК или ДНК является загрязнителем? забудьте - у Вас же реал-тайм! Вы же пробирки после реакции не открываете и не размазываете по столам и рукам. А хрен их знает, может именно так они и делают. Неужели и смеси с положительным контролем тоже сухие? А почему нет? Лиофилизованная ДНК матрица прекрасно хранится. Сообщение было отредактировано MMM - 28.05.2020 13:44
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
- нет там никаких предварительных разделений фаз. ГТЦ + сорбент и пошло поехало... - ОТ-ПЦР в одной пробирке и в одном буфере. По другому в КДЛ нельзя. Отстаете! - про проверку пипеток Вы правильно намекнули, но это такое..., короче ЭТО не предусмотрено в КДЛ. - убрать ревертирование практически невозможно. Пока температура смеси от комнатной (несколько минут) до 95 доползает (еще минута) ревертаза уже насинтезирует кучу всего. - РНК контрольная в лиофилизованной реакционной смеси - идеальный вариант. Я тоже бы так делал. |
Vista |
(-Ъ- @ 28.05.2020 12:48) Спасибо за поправку), так то я грамотная)))) писала на работе с мобильного |
Vista |
(-Ъ- @ 28.05.2020 13:42) Да, забыл спросить. А положительный контроль Вы же как-то вносите в эти полностью готовые смеси и наверняка той же пипеткой? Неужели и смеси с положительным контролем тоже сухие? Да, конечно, этой же пипеткой. Контроль как пробы вносим, для cov он готовый жидкий |
semi Постоянный участник Москва |
Есть продукт в контроле выделения? В отрицательном контроле? В заведомо отрицательных пробах? На каком цикле появляется контаминация? Просто из любопытства - положительным контролем служит плазмида или всё-таки РНК? |
MMM Постоянный участник |
(-Ъ- @ 28.05.2020 15:58) - убрать ревертирование практически невозможно. Пока температура смеси от комнатной (несколько минут) до 95 доползает (еще минута) ревертаза уже насинтезирует кучу всего. дерьмо вопрос - просто капаем в стоящую на 95 градусах сухую пробирку воды и все ревертазе - кирдык.
|
Vista |
(semi @ 28.05.2020 17:56) А в чём у вас выражается контаминация? Есть продукт в контроле выделения? В отрицательном контроле? В заведомо отрицательных пробах? На каком цикле появляется контаминация? Просто из любопытства - положительным контролем служит плазмида или всё-таки РНК? Выражается в большом количестве положительных проб (более половины постановки), Ct близкие к пороговым, небольшие амплитуды. Мы так то избалованы готовым программным обеспечением))), может чего не так назову, соррян) У нас результат +, минус, недействит. Отрицат. контроль по разному проходит, в основном норм. Что содержит положительный, не знаю. В тестах на гепатит лиофилизат, на корону - жидкий |
Vista |
(-Ъ- @ 28.05.2020 15:58) МММ, - нет там никаких предварительных разделений фаз. ГТЦ + сорбент и пошло поехало... - ОТ-ПЦР в одной пробирке и в одном буфере. По другому в КДЛ нельзя. Отстаете! - про проверку пипеток Вы правильно намекнули, но это такое..., короче ЭТО не предусмотрено в КДЛ. - убрать ревертирование практически невозможно. Пока температура смеси от комнатной (несколько минут) до 95 доползает (еще минута) ревертаза уже насинтезирует кучу всего. - РНК контрольная в лиофилизованной реакционной смеси - идеальный вариант. Я тоже бы так делал. там все сразу в одной пробирке), никакого дополнительного ревертирования) |
Vista |
|
Vista |
Неужели нашли? |
MMM Постоянный участник |
(Vista @ 28.05.2020 22:50) сейчас позвонила на работу, следующая постановка прошла хорошо! Разница в серии набора!!! Неужели нашли? То бишь производственный брак? Эхе-хе. А я вектор- бест'у доверял. |
MMM Постоянный участник |
Контаминация - это когда в минус контролях всегда положительный ответ и во всех пробах положительный ответ! Когда у вас в рабочих пробах все больные, а минус контроли показывают четкий воспроизводимый минус - это фантастика или чрезвычайная везуха(вроде зеро на рулетке)
|
Vista |
(MMM @ 29.05.2020 07:20) Вы им хотя бы инфу вышлите. Может этот лот и в других лабах есть. Пусть хоть вышлют информационное письмо, чтоб другие не трахались. Контаминация - это когда в минус контролях всегда положительный ответ и во всех пробах положительный ответ! Когда у вас в рабочих пробах все больные, а минус контроли показывают четкий воспроизводимый минус - это фантастика или чрезвычайная везуха(вроде зеро на рулетке) Так что же у нас? Бест же будет отпираться) их же менеджер нам помогает искать причину контаминации и возможность её ампликонами не отрицает. Позвоню конечно, но.... да и у нас, 2 дня норм, потом 2-3 постановки в мусор |
Vista |
(MMM @ 29.05.2020 07:20) Вы им хотя бы инфу вышлите. Может этот лот и в других лабах есть. Пусть хоть вышлют информационное письмо, чтоб другие не трахались. Контаминация - это когда в минус контролях всегда положительный ответ и во всех пробах положительный ответ! Когда у вас в рабочих пробах все больные, а минус контроли показывают четкий воспроизводимый минус - это фантастика или чрезвычайная везуха(вроде зеро на рулетке) А если это кросс-контаминация, она же может быть не на всю плашку, а с какой-то пробы? Нас в ИЛС учили, если от начала до конца вести все пробы по номерам, например, с 1-ой по 10-ую, то можно понять с какой началась контаминация |
vb Постоянный участник |
(MMM @ 29.05.2020 04:08) и на проруху бывает старуха. от косяков никто не застрахован, тем более в такой спешке. но, справедливости ради, когда я раньше плотно работал с подобными конторами, бест был, наверное, самый адекватный в смысле приемки претензий, замены наборов и устранения причин. некоторые конторы, аффилированные с органами надзора вообще всех вертели и слали туда же. |
MMM Постоянный участник |
(Vista @ 29.05.2020 09:34) Так что же у нас? Бест же будет отпираться) их же менеджер нам помогает искать причину контаминации и возможность её ампликонами не отрицает. Позвоню конечно, но.... да и у нас, 2 дня норм, потом 2-3 постановки в мусор У вас +, как я понял, на грани. Т.е. если есть контаминация то мизерная. При смене лота фигня пропадает. Это может быть даже просто taq man подтухший лабильный разваливается по мере циклов нагрева и сигнал растет. Так что скорее всего косяк производителя. В принципе они у себя это могут проверить на своем сохраненном лоте. Как можно растянуть контаминацию на несколько пробирок начиная с какой-то я представляю слабо. Это можно сделать только загрязнив пипетку или раствор общего реагента(но у вас нет общих реагентов) или при выделении через общий реагент(лизирующий буфер). А выделенные пробы как можно перекрестно растянуть - непонятно(ну только через пипетку). Сообщение было отредактировано MMM - 29.05.2020 10:26 |
dk Постоянный участник Россия |
|
Vista |
|
Panaev Постоянный участник |
(Vista @ 28.05.2020 22:17) Выражается в большом количестве положительных проб (более половины постановки), Ct близкие к пороговым, небольшие амплитуды. Мы так то избалованы готовым программным обеспечением))), может чего не так назову, соррян) У нас результат +, минус, недействит. Отрицат. контроль по разному проходит, в основном норм. Что содержит положительный, не знаю. В тестах на гепатит лиофилизат, на корону - жидкий То есть отрицательный контроль проходит как отрицательный? Просто неожиданно большое количество положительных результатов среди образцов? Тогда это вряд ли проблема лаборатории. 1. Контаминация может быть на этапе отбора проб. Можно попытаться проследить корреляцию между источником образцов и результатами. 2. Наборы могут быть не очень специфичными. Бывает. Реагируют на какой-нибудь микроб, распространенный неравномерно в популяции. Вот у вас волнами и находит.
|
Asterix Постоянный участник |
Если у вас там в позитивах везде именно то что ожидается и идентично позитивному контролю , то скорее всего контаминация где-то таки на этапе пробоотбора. А если у вас там другого размера ампликоны есть , отличные от позитивного контроля вашего .. то очевидно что проблема с китом , ну то есть дизайн сырой, недопроверенный на массовом скрининге мультицентровом. Хорошо что вы обратили внимание на эту странность ... правильно сделали.. Осталось еще один форез и можно писать заметку в какое-нибудь Клинико-Диагностическое Дело. Если у вас нет кухни для агарозного ДНК фореза , то просто отдайте пробирки после реакции в научную лабораторию ... там с удовольствием вам помогут , это несложно и ничего не стоит. |
Begemotik Участник |
(Panaev @ 29.05.2020 11:38) Реагируют на какой-нибудь микроб, распространенный неравномерно в популяции. Вот у вас волнами и находит. дельное, кстати замечание. Например, простуженным не рекомендуют выполнять постановки
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(MMM @ 28.05.2020 19:22) дерьмо вопрос - просто капаем в стоящую на 95 градусах сухую пробирку воды и все ревертазе - кирдык. Теоретик, как Вы себе представляете на реалтайм циклере на 95 гр. Ревертазу убивать . Vista, Я ещё раз говорю, что Вектор бест производит, говоря по-русски, "одноступенчатый" ОТ-ПЦР и в лабах эти ферменты в глаза не видят. Там тупо делают, то что прописано и попробуй делай шаг в сторону - сразу расстрел в виде контаминации. Частые контаминации с наборами в кдл - это не совершенные наборы! 1. На уровне отбора проб и прободготовки - много манипуляций, долго, трудоемко и, в итоге, кросс-контаминация! А стремиться надо к "direct RT-PCR" - это без выделения РНК. 2. На уровне ПЦР - никаких манипуляций с жидким К+. Иначе гарантированный разнос пипеткой. Открыл ПЦР пробирку и добавил РНК (лизат), а в К- и К+ - воды (растворителя) и все - на реакцию. По другому - только 100% роботизированный автомат как у Роша! Вся ответственность на производителях китов, персонал лабораторий тут не причём. О других производителях, молчу... Сообщение было отредактировано -Ъ- - 29.05.2020 17:45
|
noushadamir Dubai |
We already know about Avast and the powerful antivirus software that they make. This time, you will get to know a lot about the great features that come along with this Avast Safezone browser. |
kb1 Участник |
В крайнем случае можете попробовать наборы других производителей. Их - масса. Есть и в лио- формате |
Begemotik Участник |
(-Ъ- @ 29.05.2020 15:25) стремиться надо к "direct RT-PCR" - это без выделения РНК. представим, что нет потока и необходимости перерабатывать 1000 проб за смену, а есть задача усилить чувствительность. В связи с этим: директ-от-пцр - это же, скорее, вынужденное решение? Я так понимаю оно убивает любые попытки довести чувстительность до максимума. И, наверное, таким способом и соскобом с глотки вряд ли можно что-то поймать у бессимптомников? Или всё не так? |
semi Постоянный участник Москва |
...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC) For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Begemotik @ 30.05.2020 09:13) не хотел раньше лезть с вопросом, пока проблема не разрешится, но поскольку автор удовлетворен, небольшой оффтоп: представим, что нет потока и необходимости перерабатывать 1000 проб за смену, а есть задача усилить чувствительность. В связи с этим: директ-от-пцр - это же, скорее, вынужденное решение? Я так понимаю оно убивает любые попытки довести чувстительность до максимума. И, наверное, таким способом и соскобом с глотки вряд ли можно что-то поймать у бессимптомников? Или всё не так? Ессно, не так. Какой смысл делать директ ОТ-ПЦР, если реакция ингибирована. Наоборот, матрица без потерь и развала. Надо только "уметь ее готовить". |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(semi @ 31.05.2020 13:51) Смотрю на инструкцию CDC и вижу, что у них положительный контроль - это in vitro транскрибированная РНК. И это правильно. Что служит положительным контролем в отечественных наборах? Меня терзают смутные сомнения, что это ампликон, заклонированный в плазмиду. ...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC) For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ... На самом деле изготовление транскрипта когда есть под рукой нужный ампликон с Т7 промотором совсем просто. Самое сложное - в каком виде подавать его в качестве (+) контроля в китах |
semi Постоянный участник Москва |
(-Ъ- @ 31.05.2020 17:31) На самом деле изготовление транскрипта когда есть под рукой нужный ампликон с Т7 промотором совсем просто. Самое сложное - в каком виде подавать его в качестве (+) контроля в китах CDC поставляет РНК положительного контроля в лиофизованном виде. После разведения надо сделать аликвоты по 30 мкл, аликвоты заморозить на -70 oC. После размораживания аликвоту используют, её неиспользованные остатки выбрасывают. ...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC) Preparation: 1) Precautions: This reagent should be handled with caution in a dedicated nucleic acid handling area to prevent possible contamination. Freeze-thaw cycles should be avoided. Maintain on ice when thawed. 2) Resuspend dried reagent in each tube in 1 mL of nuclease-free water to achieve the proper concentration. Make single use aliquots (approximately 30 μL) and store at ≤ -70oC. 3) Thaw a single aliquot of diluted positive control for each experiment and hold on ice until adding to plate. Discard any unused portion of the aliquot... |
vb Постоянный участник |
(semi @ 31.05.2020 10:51) Смотрю на инструкцию CDC и вижу, что у них положительный контроль - это in vitro транскрибированная РНК. И это правильно. Что служит положительным контролем в отечественных наборах? Меня терзают смутные сомнения, что это ампликон, заклонированный в плазмиду. ...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC) For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ... ну вы реально велосипед изобретаете. это понятно любому, кто сталкивался с клинической диагностикой, даже не в качестве разработчика. использование ампликонов в качестве положительного контроля неприемлимо даже при детекции днк, не то что рнк. и любой уважающий себя производитель не марается таким. хотя в условиях спешки все может быть, я уже ничему не удивляюсь. |
semi Постоянный участник Москва |
(vb @ 31.05.2020 21:48) .... это понятно любому, кто сталкивался с клинической диагностикой, даже не в качестве разработчика... Не согласна с этим тезисом. Сталкивалась с множеством безграмотных. Мне любопытна история про положительный контроль для теста на РНКовый вирус. Судя по тому, что пишет уважаемая Виста про раствор для положительного контроля, в ее лаборатории работают с ДНК в качестве положительного контроля. Про наборы Вектора пишут, что у них нет внутреннего РНКового контроля. "...одним из недостатков «векторовского» набора является то, что в нем есть лишь реагенты для ПЦР, то есть третьей, заключительной операции анализа. А для выделения РНК и обратной транскрипции предлагается использовать наборы других производителей. В комплектации набора также отсутствует внутренний контрольный образец (ВКО) — молекула РНК, защищенная от действия нуклеаз, которую добавляют в образец и которая вместе с мишенью проходит все стадии анализа..." Сообщение было отредактировано semi - 01.06.2020 11:10 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(semi @ 01.06.2020 12:06) Про наборы Вектора пишут, что у них нет внутреннего РНКового контроля. "...одним из недостатков «векторовского» набора является то, что в нем есть лишь реагенты для ПЦР, то есть третьей, заключительной операции анализа. А для выделения РНК и обратной транскрипции предлагается использовать наборы других производителей. В комплектации набора также отсутствует внутренний контрольный образец (ВКО) — молекула РНК, защищенная от действия нуклеаз, которую добавляют в образец и которая вместе с мишенью проходит все стадии анализа..." А что Вы хотели, когда был "дан приказ ему на запад" за кратчайшие сроки разработать, испытать и ,самое главное, зарегистрировать изделие это медицинское. И еще наладить массовое производство. Пожалуйста, получите, что хотели. Мне бы такие скорости. Кстати, Виста получает наборы не от Вектора, а от ВектораБеста, а это совсем другие киты, другой денежный поток и умелое мытье рук . Я еще раз говорю, что изготовить транскрипты не так сложно. За ночь их столько нарабатывается в реакции, аж смесь мутнеет. И к тому же во времена реал тайм ПЦР нет нужды делать их длинными в несколько сот нукл. как раньше это делали во времена ЭФ детекции. Но самое приятное эти коротенькие транскрипты, меньше 100 нукл. в присутствии ингибитора РНК-аз хранятся месяцами в холодильнике. На мой взгляд нет необходимости строить MS2 фаговую "армированную" конструкцию в качестве (+) контролей, внутренних контролей и т. |
semi Постоянный участник Москва |
(-Ъ- @ 01.06.2020 13:06) ...Но самое приятное эти коротенькие транскрипты, меньше 100 нукл. в присутствии ингибитора РНК-аз хранятся месяцами в холодильнике. .. В простой морозилке? Или вообще при 4 оС? Сообщение было отредактировано semi - 01.06.2020 12:14 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(semi @ 01.06.2020 13:13) При 2-8 град., в простом холоде. Да и с Ингибитором морозить уже как бы нельзя. Так что не так страшны эти РНК-азы, как их малюют. Сообщение было отредактировано -Ъ- - 01.06.2020 12:45
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |