Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Cellcoulter IP-штамп: frstdxeaqBFNU гость |
Стоит следующая задача: из ткани получить суспензию клеток, инкубировать n-ное количество суток и ввести мышкам. Нашли методику деградации и гомогенизации тканей, но теперь не уверены, что клетки после всего проделанного с ними смогут рости, да еще и делиться. Методика: измельчить ткань в ступке, отмыть, поместить в раствор ферментов • 0,25% трипсин в ФСБ (фосфатно-солевой буфер), • 1 мМ ЭДТА в ФСБ • 0,1% протеиназа (Sigma) в ФСБ • ДНКаза (100 мкг\мл, конечная концентрация 1-5 мкг\мл) (Sigma Worthington) • Коллагеназа (Sigma) (2000 ед.\ мл.) Смущает наличие ДНК-азы, протеиназы. Если мембраны разрушим, а тем более ДНК, то получим 100% мертвую культуру. Подскажите, может есть другие варианты методики, менее травматичные для клеток. |
L-2M Постоянный участник |
Кстати, позвольте полюбопытствовать: откуда взята приведенная Вами методика? Для какой конкретно ткани она предназначена, и какие задачи предполагалось решать с помощью полученных таким образом клеток? А то мне тоже интересно стало: зачем там ДНКаза... |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
-- Если мембраны разрушим, а тем более ДНК, то получим 100% мертвую культуру. Те или иные последствия выделения клеток из ткани определяются составом смеси разрушающей ВКМ, временем обработки, характером обрабатываемой ткани. Конкретные условия можно подобрать только опытным путем. Клетки можно убить и одним трипсином, если достаточно долго держать в нем. Так что надо не боятся, а надо пробовать и подбирать условия. А статей много и они могут только служить ориентиром для подбора конкретных условий. Если вы конечно не задались целью точно воспроизвести, то что делалось в статье. |
murus Участник Saint-Petersburg |
(L^2M @ 18.08.2008 16:56) А что за ткань, собственно? Так ли ее необходимо растирать в ступке? Потому что классика - это промыть в 10х антибиотике, потом отмыть антибиотик PBS, измельчить ткань ножницами, и в трипсин-ЭДТА на PBS (overnight, но тут могут быть вариации в зависимости от ткани) - а потом разбить пипеткой. у меня возникла проблема при выделении клеток на трипсине, как раз если следовать классической схеме (то ли трипсин какой-то не такой попался). Вообщем суть в том, что выделить нужно клетки трофобласта из плаценты человека, есть официальный воркшоп, немного модифицированный в процессе работы (суть можно посмареть Раньше всегда пользовались этой схемой и клетки хорошо выделялись. Но вот мы получили новую поставку трипсина (Сигма) и все пошло прахом... при инкубации измельченной ткани с трипсином и ЭДТА в течение получаса образуются дикие сопли, которые невозможно не только разбить и процедить через сито, они просто превращаются в густой гель, в котором видимо и улетают все клетки в трубу... результат - ноль. Если есть у кого какие мысли, чем можно ингибировать ТАКУЮ активность трипсина - подскажите плиззз... уже всю голову сломали, как избавицца от этих соплей... |
L-2M Постоянный участник |
Еще уменьшить активность трипсина можно, снижая температуру инкубации (мы это делаем на +4, отсюда и overnight) - но, как мне кажется, в Вашем случае это нерационально: у Вас есть отработанная надежная методика, и нечего ее менять без действительной надобности - все Ваши проблемы, вероятно, состоят в высокой активности трипсина, и Вам нужно просто снизить его концентрацию в растворе. |
murus Участник Saint-Petersburg |
Хотя уже пыталась попробовать это путем увеличения в 2 раза объема ЭДТА при инкубировании с трипсином и уменьшением количества материала для выделения (ведь я так понимаю чем больше материала, тем плотнее образуется гель из лизировавшихся клеток?). Пока это ничего не дало. Сопли практически те же... особенно когда после инкубации пытаюсь инактивировать трипсин версеном или средой. Видимо все-таки надо менять изначальную концентрацию трипсина... и уменьшать количество ткани... Насчет температуры тоже хороший совет - спасибо, буду еще думать |
L-2M Постоянный участник |
Подбирайте концентрацию трипсина - и будет Вам щасте PS простите, инактивировать трипсин версеном? это как? Сообщение было отредактировано L^2M - 20.08.2008 12:38 |
murus Участник Saint-Petersburg |
А нарочь скушать нам как раз и надо... чтобы скушал ткань, а клетки вывалились :-) |
L-2M Постоянный участник |
1) Трипсин не рушит прицельно одни только межклеточные белки: переинкубировав ткань в трипсине, Вы не только отделите клетки друг от друга, но и лизируете их к свиньям (что у Вас, в сущности, и происходит: наблюдаемые Вами "сопли" – это, по-видимому, клеточный лизат: во всяком случае, он выглядит именно так). Уменьшая количество ткани в пробе (т.е., увеличивая количество трипсина, приходящегося на единицу массы ткани), Вы интенсифицируете процесс лизиса. Вам это совершенно не нужно – у Вас и так вместо клеточной суспензии получается клеточный лизат. Вот если бы у Вас, наоборот, ткань лизировалась недостаточно – тогда да, Ваше начинание имело бы смысл. Но Ваша проблема имеет диаметрально противоположный характер; соответственно, Вам снижать количество ткани нельзя. 2) Трипсин не инактивируют путем разведения препарата версеном. Трипсин инактивируют путем добавления соевого ингибитора трипсина, или же введением в реакционную смесь сыворотки/ростовой среды с добавлением сыворотки (белки сыворотки конкурируют с белками препарата за трипсин, благодаря чему воздействие трипсина на клетки практически прекращается). На самый крайний случай, если требуется получить суспензию клеток в бессывороточной среде (или другом бессывороточном растворе), а ингибитора трипсина нет – можно разводить препарат бессывороточной ростовой средой или нужным Вам раствором, соответственно. Но не версеном. Потому что версен – он и сам по себе может разрушать клетки, хотя и не так интенсивно, как трипсин. Сообщение было отредактировано L^2M - 21.08.2008 19:23 |
Tom1 Постоянный участник |
Одно слово матчасть... |
Vladimirkox Постоянный участник |
Лучше останавливайте не версеном, а какой-нить 199 с ЭС КРС, а потом клетки пару раз отмыть и на ростовую среду. Много ткани - плохо, уменьшая кол-во ткани в пробе, Вы интенсивность протеолиза не увеличите, поскольку концентрация трипсина будет примерно та же. А что это у Вас за протеиназа, а нужна ли она Вам? |
сellcoulter IP-штамп: frstdxeaqBFNU гость |
(L^2M @ 18.08.2008 15:56) А что за ткань, собственно? Так ли ее необходимо растирать в ступке? Потому что классика - это промыть в 10х антибиотике, потом отмыть антибиотик PBS, измельчить ткань ножницами, и в трипсин-ЭДТА на PBS (overnight, но тут могут быть вариации в зависимости от ткани) - а потом разбить пипеткой. А в некоторых случаях можно вообще без ферментов обойтись, а просто протереть ткань через ситечко. Кстати, позвольте полюбопытствовать: откуда взята приведенная Вами методика? Для какой конкретно ткани она предназначена, и какие задачи предполагалось решать с помощью полученных таким образом клеток? А то мне тоже интересно стало: зачем там ДНКаза... Ткань- эмбриональная печень. Для инъекций нам нужно получить как можно меньше конгломератов, поэтому и думаем измельчать ткань в ступке. Достаточно ли будет просто протереть ткань через ситечко? Как то не хочется обрабатывать ткань ферментами перед инкубацией. |
Guest1 Постоянный участник |
(Tom1 @ 21.08.2008 19:49) Угу - раствор ЕДТА в вотке |
murus Участник Saint-Petersburg |
(L^2M @ 21.08.2008 19:20) Откуда, простите, вывалятся клетки??? 2) Трипсин не инактивируют путем разведения препарата версеном. Трипсин инактивируют путем добавления соевого ингибитора трипсина, или же введением в реакционную смесь сыворотки/ростовой среды с добавлением сыворотки (белки сыворотки конкурируют с белками препарата за трипсин, благодаря чему воздействие трипсина на клетки практически прекращается). Да-Да-да! Спасибо за подробные инструкции, но во-первых, - я уже выше сказала, что просто неправильно выразилась словом инактивировать, если оно так сильно задело, то лучше сказать - развожу версеном. а во-вторых, что такое версен и чем инактивировать трипсин я знаю и так, поверьте за 5 лет работы в этой области было достаточно времени наработать методику и разобраться что к чему. И если бы вы посмотрели методику по указанной ссылке, то могли бы увидеть, чем мы инактивируем трипсин - средой с сывороткой. Версен был взят в качестве экспериментального варианта (еще раз повторюсь - не для инактивации!), потому что при добавлении среды с сывороткой сопли сильно увеличиваются в объеме и концентрации. Поэтому в кач-ве варианта, пробовали обойтись без нее. (соевый ингибитор в нашей методике не работает). Версен- ерто комерческое название раствора ЕДТА..... Одно слово матчасть... Вот именно!!! золотые слова! Активность старого и нового трипсина измерить и сравнить - слабо? Ну, шоб концентрацию подобрать и забыть о подобных проблемах? Лучше останавливайте не версеном, а какой-нить 199 с ЭС КРС, а потом клетки пару раз отмыть и на ростовую среду. Много ткани - плохо, уменьшая кол-во ткани в пробе, Вы интенсивность протеолиза не увеличите, поскольку концентрация трипсина будет примерно та же. а как ее измерить? изначально всегда брали одинаковую активность трипсина (согласно стандартной методике выделения клеток) и если разные поставки трипсина идут с разной активностью, то как это можно определить на взгляд? опытным путем (если речь об этом) - уже подбираем... только пока уменьшение концетрации не сильно что изменило к тому же на подбор этот дурацкий уже слито н-ное кол-во реагентов и еще сольется... Будем пытаться еще больше снизить концетрацию, посмотрим что из этого получится... но все же хотелось бы как-то минимизировать кол-во подбираемых модификаций исходя из опыта тех, кто сталкивался с подобным. Вот, например, почему при инактивации инкубируемого с трипсином материала средой с сывороткой, происходит не уменьшение соплей, а сильное увеличение и превращение массы в густой гель??? Понятно что идет лизис... но по идее - это должно инактивировать трипсин, а получается все наоборот... и раньше такого не было, сколько лет работаем с этой методой, все было ок. Сообщение было отредактировано murus - 25.08.2008 10:40 |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Tom1 Постоянный участник |
я плякал.... 1." Справочник биохомика" 2. Посмотреть в Google учите матчасть.... |
Vladimirkox Постоянный участник |
А разгоните Ваш новый трипсин в SDS-PAAG, и старый тоже. А почему это лизис должен инактивировать трипсин? Мне кажется, что у Вас трипсина в 100-1000раз больше чем надо, а в добавок к нему примешан хемотрипсин и другая бяка. |
L-2M Постоянный участник |
В любом случае – у Вас или перелизис, или некачественный трипсин; Вам об этом уже сказали все, кому не лень. Проверить, какое из этих предположений правильно – можете только Вы сами. Как - Вам уже сказали. Не понимаю в упор, почему у Вас простой подбор концентрации трипсина привел к сильному перерасходу реактивов. Ведь там же все просто и элементарно: берете Ваш рабочий раствор трипсина, делаете 3-4 десятикратных разведения, берете бросовый кусок плаценты (кстати, опять непонятно – то ли у Вас человеческая плацента, то ли мышиная печень, то ли оба этих объекта, то ли задающих вопросы вообще двое), делите на 3-4 пробы (по числу разведений), режете, заливаете, инкубируете, и смотрите наличие "соплей". Ту концентрацию, при которой "сопли" не возникли, а ткань гомогенизировалась – берете в дальнейшую работу. Так вот, давайте договоримся следующим образом – Вы: - или пробуете подобрать концентрацию трипсина эмпирически; - или при помощи аналитических методов проверяете качество старого и нового трипсина; - или делаете и то, и другое; , а потом уже исходите из полученных результатов. Если яснее все равно не станет, то, пожалуйста, сначала сами определитесь - а потом расскажите и нам: что Вы делали; как Вы делали; и зачем Вы делали именно так; а заодно подберите нужные слова (чтобы не приходилось чесать в затылке, читая об инактивации трипсина версеном, и о вываливающихся из ткани клетках). Тогда Вам смогут посоветовать что-то более конкретное; и не будут Вас посылать учить матчасть. ОК? Сообщение было отредактировано L^2M - 26.08.2008 20:13 |
Guest IP-штамп: frQG2qglqvAdc гость |
(Cellcoulter @ 18.08.2008 09:17) Смущает наличие ДНК-азы, протеиназы. Если мембраны разрушим, а тем более ДНК, то получим 100% мертвую культуру. -"сопли" это и есть ДНК, так что ДНКаза вполне уместна, чтобы не слипались неповрежденные клетки. А живые клетки она повредить, естественно, никак не может...
|
murus Участник Saint-Petersburg |
А почему это лизис должен инактивировать трипсин? Мне кажется, что у Вас трипсина в 100-1000раз больше чем надо, а в добавок к нему примешан хемотрипсин и другая бяка. под словом ЭТО имелось ввиду - добавление сыворотки со средой, а не лизис. насчет бяки в трипсине - полностью согласна. заказали новый invitrogen. (кстати, опять непонятно – то ли у Вас человеческая плацента, то ли мышиная печень, то ли оба этих объекта, то ли задающих вопросы вообще двое) вот именно... если внимательно следить за дискуссией то можно заметить (невооруженным взглядом) что задающих вопрос по теме двое - автор вопроса и собственно я. Совершенно разобщенных во времени и пространстве... к тому же опять же - читая методу на сайте, абсолютно ясно с какими именно клетками и тканями мы работаем. "сопли" это и есть ДНК, так что ДНКаза вполне уместна, чтобы не слипались неповрежденные клетки. А живые клетки она повредить, естественно, никак не может... точно... к этой мысли мы тоже пришли. будем пробовать смешивать! |
vadimchik152a Постоянный участник |
|
xy34704 |
|
guest: Ufa1688 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |