Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* гомогенизация тканей -- ткани --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Cellcoulter
IP-штамп: frstdxeaqBFNU
гость



 прочитанное сообщение 18.08.2008 10:17     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте.Помогите, пожалуйста, разобраться в методе!!!!
mol.gif
Стоит следующая задача: из ткани получить суспензию клеток, инкубировать n-ное количество суток и ввести мышкам. Нашли методику деградации и гомогенизации тканей, но теперь не уверены, что клетки после всего проделанного с ними смогут рости, да еще и делиться.
Методика: измельчить ткань в ступке, отмыть, поместить в раствор ферментов
• 0,25% трипсин в ФСБ (фосфатно-солевой буфер),
• 1 мМ ЭДТА в ФСБ
• 0,1% протеиназа (Sigma) в ФСБ
• ДНКаза (100 мкг\мл, конечная концентрация 1-5 мкг\мл) (Sigma Worthington)
• Коллагеназа (Sigma) (2000 ед.\ мл.)

Смущает наличие ДНК-азы, протеиназы. confused.gif Если мембраны разрушим, а тем более ДНК, то получим 100% мертвую культуру.
Подскажите, может есть другие варианты методики, менее травматичные для клеток.
Участник оффлайн! L-2M
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.08.2008 16:56     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А что за ткань, собственно? Так ли ее необходимо растирать в ступке? Потому что классика - это промыть в 10х антибиотике, потом отмыть антибиотик PBS, измельчить ткань ножницами, и в трипсин-ЭДТА на PBS (overnight, но тут могут быть вариации в зависимости от ткани) - а потом разбить пипеткой. А в некоторых случаях можно вообще без ферментов обойтись, а просто протереть ткань через ситечко.
Кстати, позвольте полюбопытствовать: откуда взята приведенная Вами методика? Для какой конкретно ткани она предназначена, и какие задачи предполагалось решать с помощью полученных таким образом клеток? А то мне тоже интересно стало: зачем там ДНКаза...
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 18.08.2008 16:56     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Трипсин тоже протеиназа. протеиназ и туева хуча. В данном конкретном случае надо смотреть католожный номер. ДНКаза непонятно зачем так как ДНК в ВКМ практически нету, а в клетки ей не проникнуть.

-- Если мембраны разрушим, а тем более ДНК, то получим 100% мертвую культуру.

Те или иные последствия выделения клеток из ткани определяются составом смеси разрушающей ВКМ, временем обработки, характером обрабатываемой ткани.

Конкретные условия можно подобрать только опытным путем.

Клетки можно убить и одним трипсином, если достаточно долго держать в нем. Так что надо не боятся, а надо пробовать и подбирать условия. А статей много и они могут только служить ориентиром для подбора конкретных условий. Если вы конечно не задались целью точно воспроизвести, то что делалось в статье.
Участник оффлайн! murus
Участник
Saint-Petersburg



 прочитанное сообщение 19.08.2008 12:39     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(L^2M @ 18.08.2008 16:56)
Ссылка на исходное сообщение  А что за ткань, собственно? Так ли ее необходимо растирать в ступке? Потому что  классика - это промыть в 10х антибиотике, потом отмыть антибиотик PBS, измельчить ткань ножницами, и в трипсин-ЭДТА на PBS (overnight, но тут могут быть вариации в зависимости от ткани) - а потом разбить пипеткой.


у меня возникла проблема при выделении клеток на трипсине, как раз если следовать классической схеме (то ли трипсин какой-то не такой попался). Вообщем суть в том, что выделить нужно клетки трофобласта из плаценты человека, есть официальный воркшоп, немного модифицированный в процессе работы (суть можно посмареть на нашем официальном сайте ).
Раньше всегда пользовались этой схемой и клетки хорошо выделялись. Но вот мы получили новую поставку трипсина (Сигма) и все пошло прахом... при инкубации измельченной ткани с трипсином и ЭДТА в течение получаса образуются дикие сопли, которые невозможно не только разбить и процедить через сито, они просто превращаются в густой гель, в котором видимо и улетают все клетки в трубу... результат - ноль.

Если есть у кого какие мысли, чем можно ингибировать ТАКУЮ активность трипсина - подскажите плиззз... уже всю голову сломали, как избавицца от этих соплей... weep.gif
Участник оффлайн! L-2M
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.08.2008 14:02     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Так Вы же и сами видите, что дело в трипсине: сама методика в полном порядке, ее менять нет никакой необходимости. Вариантов два: или трипсин слишком активный - или вообще по каким-то причинам ни на что не годный. Во втором варианте - делаете возврат и рекламацию. В первом - уменьшаете концентрацию трипсина так, чтобы он у Вас не рушил клетки напрочь. На сколько уменьшаете - это нужно подбирать эмпирически.

Еще уменьшить активность трипсина можно, снижая температуру инкубации (мы это делаем на +4, отсюда и overnight) - но, как мне кажется, в Вашем случае это нерационально: у Вас есть отработанная надежная методика, и нечего ее менять без действительной надобности - все Ваши проблемы, вероятно, состоят в высокой активности трипсина, и Вам нужно просто снизить его концентрацию в растворе.
Участник оффлайн! murus
Участник
Saint-Petersburg



 прочитанное сообщение 19.08.2008 14:16     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Спасибо за совет. Да, признаюсь, пока мысль об уменьшении концентрации не выходит у меня из головы как единственный метод преодоления проблемы.
Хотя уже пыталась попробовать это путем увеличения в 2 раза объема ЭДТА при инкубировании с трипсином и уменьшением количества материала для выделения (ведь я так понимаю чем больше материала, тем плотнее образуется гель из лизировавшихся клеток?). Пока это ничего не дало. Сопли практически те же... особенно когда после инкубации пытаюсь инактивировать трипсин версеном или средой.

Видимо все-таки надо менять изначальную концентрацию трипсина... и уменьшать количество ткани... Насчет температуры тоже хороший совет - спасибо, буду еще думать smile.gif
Участник оффлайн! L-2M
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.08.2008 12:36     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Простите, а уменьшать количество ткани зачем? Разве что - дабы трипсину было удобнее оную напрочь скушать wink.gif
Подбирайте концентрацию трипсина - и будет Вам щасте

PS простите, инактивировать трипсин версеном? это как?

Сообщение было отредактировано L^2M - 20.08.2008 12:38
Участник оффлайн! murus
Участник
Saint-Petersburg



 прочитанное сообщение 21.08.2008 11:53     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

я не правильно выразилась вероятно... просто путем сильного разбавления гомогенизированной массы версеном. концетрация трипсина снижается и соотвественно активность тоже.
А нарочь скушать нам как раз и надо... чтобы скушал ткань, а клетки вывалились :-)
Участник оффлайн! L-2M
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.08.2008 19:20     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Откуда, простите, вывалятся клетки???
1) Трипсин не рушит прицельно одни только межклеточные белки: переинкубировав ткань в трипсине, Вы не только отделите клетки друг от друга, но и лизируете их к свиньям (что у Вас, в сущности, и происходит: наблюдаемые Вами "сопли" – это, по-видимому, клеточный лизат: во всяком случае, он выглядит именно так).
Уменьшая количество ткани в пробе (т.е., увеличивая количество трипсина, приходящегося на единицу массы ткани), Вы интенсифицируете процесс лизиса. Вам это совершенно не нужно – у Вас и так вместо клеточной суспензии получается клеточный лизат.
Вот если бы у Вас, наоборот, ткань лизировалась недостаточно – тогда да, Ваше начинание имело бы смысл. Но Ваша проблема имеет диаметрально противоположный характер; соответственно, Вам снижать количество ткани нельзя.
2) Трипсин не инактивируют путем разведения препарата версеном.
Трипсин инактивируют путем добавления соевого ингибитора трипсина, или же введением в реакционную смесь сыворотки/ростовой среды с добавлением сыворотки (белки сыворотки конкурируют с белками препарата за трипсин, благодаря чему воздействие трипсина на клетки практически прекращается).
На самый крайний случай, если требуется получить суспензию клеток в бессывороточной среде (или другом бессывороточном растворе), а ингибитора трипсина нет – можно разводить препарат бессывороточной ростовой средой или нужным Вам раствором, соответственно. Но не версеном. Потому что версен – он и сам по себе может разрушать клетки, хотя и не так интенсивно, как трипсин.

Сообщение было отредактировано L^2M - 21.08.2008 19:23
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.08.2008 19:49     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Версен- ерто комерческое название раствора ЕДТА.....
Одно слово матчасть...
Участник оффлайн! Vladimirkox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.08.2008 20:57     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Активность старого и нового трипсина измерить и сравнить - слабо? Ну, шоб концентрацию подобрать и забыть о подобных проблемах?
Лучше останавливайте не версеном, а какой-нить 199 с ЭС КРС, а потом клетки пару раз отмыть и на ростовую среду.
Много ткани - плохо, уменьшая кол-во ткани в пробе, Вы интенсивность протеолиза не увеличите, поскольку концентрация трипсина будет примерно та же.
А что это у Вас за протеиназа, а нужна ли она Вам?
сellcoulter
IP-штамп: frstdxeaqBFNU
гость



 прочитанное сообщение 25.08.2008 08:27     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(L^2M @ 18.08.2008 15:56)
Ссылка на исходное сообщение  А что за ткань, собственно? Так ли ее необходимо растирать в ступке? Потому что  классика - это промыть в 10х антибиотике, потом отмыть антибиотик PBS, измельчить ткань ножницами, и в трипсин-ЭДТА на PBS (overnight, но тут могут быть вариации в зависимости от ткани) - а потом разбить пипеткой. А в некоторых случаях можно вообще без ферментов обойтись, а просто протереть ткань через ситечко.
Кстати, позвольте полюбопытствовать: откуда взята приведенная Вами методика? Для какой конкретно ткани она предназначена, и какие задачи предполагалось решать с помощью полученных таким образом клеток? А то мне тоже интересно стало: зачем там ДНКаза...


Ткань- эмбриональная печень.
Для инъекций нам нужно получить как можно меньше конгломератов, поэтому и думаем измельчать ткань в ступке. Достаточно ли будет просто протереть ткань через ситечко? Как то не хочется обрабатывать ткань ферментами
перед инкубацией.
Участник оффлайн! Guest1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 25.08.2008 09:59     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(Tom1 @ 21.08.2008 19:49)
Ссылка на исходное сообщение  Версен- ерто комерческое название раствора ЕДТА.....
Одно слово матчасть...


Угу - раствор ЕДТА в вотке smile.gif
Участник оффлайн! murus
Участник
Saint-Petersburg



 прочитанное сообщение 25.08.2008 10:20     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(L^2M @ 21.08.2008 19:20)
Ссылка на исходное сообщение  Откуда, простите, вывалятся клетки???
2) Трипсин не инактивируют путем разведения препарата версеном.
Трипсин инактивируют путем добавления соевого ингибитора трипсина, или же введением в реакционную смесь сыворотки/ростовой среды с добавлением сыворотки (белки сыворотки конкурируют с белками препарата за трипсин, благодаря чему воздействие трипсина на клетки практически прекращается).

Да-Да-да! smile.gif Спасибо за подробные инструкции, но во-первых, - я уже выше сказала, что просто неправильно выразилась словом инактивировать, если оно так сильно задело, то лучше сказать - развожу версеном.
а во-вторых, что такое версен и чем инактивировать трипсин я знаю и так, поверьте за 5 лет работы в этой области было достаточно времени наработать методику и разобраться что к чему. И если бы вы посмотрели методику по указанной ссылке, то могли бы увидеть, чем мы инактивируем трипсин - средой с сывороткой.
Версен был взят в качестве экспериментального варианта (еще раз повторюсь - не для инактивации!), потому что при добавлении среды с сывороткой сопли сильно увеличиваются в объеме и концентрации. Поэтому в кач-ве варианта, пробовали обойтись без нее. (соевый ингибитор в нашей методике не работает).

Версен- ерто комерческое название раствора ЕДТА.....
Одно слово матчасть...

Вот именно!!! золотые слова! umnik.gif

Активность старого и нового трипсина измерить и сравнить - слабо? Ну, шоб концентрацию подобрать и забыть о подобных проблемах?
Лучше останавливайте не версеном, а какой-нить 199 с ЭС КРС, а потом клетки пару раз отмыть и на ростовую среду.
Много ткани - плохо, уменьшая кол-во ткани в пробе, Вы интенсивность протеолиза не увеличите, поскольку концентрация трипсина будет примерно та же.


а как ее измерить? изначально всегда брали одинаковую активность трипсина (согласно стандартной методике выделения клеток) и если разные поставки трипсина идут с разной активностью, то как это можно определить на взгляд?
опытным путем (если речь об этом) - уже подбираем... только пока уменьшение концетрации не сильно что изменило к тому же на подбор этот дурацкий уже слито н-ное кол-во реагентов и еще сольется... frown.gif Будем пытаться еще больше снизить концетрацию, посмотрим что из этого получится... но все же хотелось бы как-то минимизировать кол-во подбираемых модификаций исходя из опыта тех, кто сталкивался с подобным.

Вот, например, почему при инактивации инкубируемого с трипсином материала средой с сывороткой, происходит не уменьшение соплей, а сильное увеличение и превращение массы в густой гель???
Понятно что идет лизис... но по идее - это должно инактивировать трипсин, а получается все наоборот... и раньше такого не было, сколько лет работаем с этой методой, все было ок.

Сообщение было отредактировано murus - 25.08.2008 10:40
Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость



 прочитанное сообщение 25.08.2008 14:52     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Может версен ПБСом заменить всетаки - нафига вам ЕДТА ?
http://cvi.asm.org/cgi/reprint/3/1/14?view=long&pmid=8770498
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 25.08.2008 19:46     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

"разной активностью, то как это можно определить на взгляд?"
я плякал....
1." Справочник биохомика"
2. Посмотреть в Google
учите матчасть....
Участник оффлайн! Vladimirkox
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 25.08.2008 20:08     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

http://www.library.biophys.msu.ru/gettext?Serial=550
http://chem.kstu.ru/butlerov_comm/vol3/cd-.../md03-1-197.pdf или типа того.
А разгоните Ваш новый трипсин в SDS-PAAG, и старый тоже.
А почему это лизис должен инактивировать трипсин?
Мне кажется, что у Вас трипсина в 100-1000раз больше чем надо, а в добавок к нему примешан хемотрипсин и другая бяка.
Участник оффлайн! L-2M
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.08.2008 19:07     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Уважаемая Murus, методику на вашем сайте я читала достаточно внимательно. Но то, что написано там; и то, что Вы мне описываете здесь – как-то слабо стыкуется.
В любом случае – у Вас или перелизис, или некачественный трипсин; Вам об этом уже сказали все, кому не лень. Проверить, какое из этих предположений правильно – можете только Вы сами. Как - Вам уже сказали.
Не понимаю в упор, почему у Вас простой подбор концентрации трипсина привел к сильному перерасходу реактивов. Ведь там же все просто и элементарно: берете Ваш рабочий раствор трипсина, делаете 3-4 десятикратных разведения, берете бросовый кусок плаценты (кстати, опять непонятно – то ли у Вас человеческая плацента, то ли мышиная печень, то ли оба этих объекта, то ли задающих вопросы вообще двое), делите на 3-4 пробы (по числу разведений), режете, заливаете, инкубируете, и смотрите наличие "соплей". Ту концентрацию, при которой "сопли" не возникли, а ткань гомогенизировалась – берете в дальнейшую работу.

Так вот, давайте договоримся следующим образом – Вы:
- или пробуете подобрать концентрацию трипсина эмпирически;
- или при помощи аналитических методов проверяете качество старого и нового трипсина;
- или делаете и то, и другое;
, а потом уже исходите из полученных результатов.

Если яснее все равно не станет, то, пожалуйста, сначала сами определитесь - а потом расскажите и нам: что Вы делали; как Вы делали; и зачем Вы делали именно так; а заодно подберите нужные слова (чтобы не приходилось чесать в затылке, читая об инактивации трипсина версеном, и о вываливающихся из ткани клетках).
Тогда Вам смогут посоветовать что-то более конкретное; и не будут Вас посылать учить матчасть. ОК? smile.gif

Сообщение было отредактировано L^2M - 26.08.2008 20:13
Guest
IP-штамп: frQG2qglqvAdc
гость



 прочитанное сообщение 27.08.2008 22:12     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(Cellcoulter @ 18.08.2008 09:17)
Ссылка на исходное сообщение  Смущает наличие ДНК-азы, протеиназы.  confused.gif Если мембраны разрушим, а тем более ДНК, то получим 100% мертвую культуру.
-"сопли" это и есть ДНК, так что ДНКаза вполне уместна, чтобы не слипались неповрежденные клетки. А живые клетки она повредить, естественно, никак не может...

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Vladimirkox
Участник оффлайн! murus
Участник
Saint-Petersburg



 прочитанное сообщение 03.09.2008 19:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

А почему это лизис должен инактивировать трипсин?
Мне кажется, что у Вас трипсина в 100-1000раз больше чем надо, а в добавок к нему примешан хемотрипсин и другая бяка.

lol.gif под словом ЭТО имелось ввиду - добавление сыворотки со средой, а не лизис.
насчет бяки в трипсине - полностью согласна. заказали новый invitrogen.

(кстати, опять непонятно – то ли у Вас человеческая плацента, то ли мышиная печень, то ли оба этих объекта, то ли задающих вопросы вообще двое)

вот именно... если внимательно следить за дискуссией то можно заметить (невооруженным взглядом) что задающих вопрос по теме двое - автор вопроса и собственно я. Совершенно разобщенных во времени и пространстве...
к тому же опять же - читая методу на сайте, абсолютно ясно с какими именно клетками и тканями мы работаем.

"сопли" это и есть ДНК, так что ДНКаза вполне уместна, чтобы не слипались неповрежденные клетки. А живые клетки она повредить, естественно, никак не может...

точно... к этой мысли мы тоже пришли. будем пробовать смешивать! rolleyes.gif
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.01.2022 06:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.08.2022 00:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Равным образом общая концепция сложившегося положения позволяет выполнить важные задания по разработке направлений прогрессивного развития. https://www.tes.com/teaching-resources/shop/andrej77e0
Участник оффлайн! xy34704




 прочитанное сообщение Сообщение на английском  10.08.2022 06:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

奇力片副作用
威而鋼官網
藍色小藥丸
guest: Ufa1688
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.08.2022 13:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

Shields began ดรีมเกมส์ the termination process aff 1688 for Meany and Goodlett ทางเข้าufa1688 shortly after federal ufabet เข้า สู่ระบบ civil rights charges against SLOTXO the officers were announced ALLWAYSPIN The police YGGDRASIL department fired KA Gaming Hankison in June Joker Gaming 2020, and Jaynes in ไฮโล January 2021, the police รูเล็ต department said.
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.10.2022 19:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Равным образом рамки и место обучения кадров в значительной степени обусловливает создание новых предложений. https://www.2laneamerica.com/profile/slava38b/profile
Участник оффлайн! Ufa1688
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  03.10.2022 19:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

Seaman Recruit Ryan ufa1688 Mays was acquitted on ราคาบอล charges of willful hazarding สล็อตออนไลน์ of a vessel and aggravated UFA1688 arson, the Navy said in a statement ลิงค์รับทรัพย์ following a court martial แฮนดิแคป in which a judge ruled บอลสเต็บ there was not enough evidence ufabet เข้า สู่ระบบ that Mays set the fire that destroyed ufa1688auto the USS Bonhomme Richard ufa1688 auto ทางเข้า more than two years ago.
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.02.2023 00:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

С другой стороны общая концепция сложившегося положения позволяет оценить значение системы массового участия. https://www.worldanvil.com/author/ivan84r
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.02.2023 13:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Теперь становится очевидно, что движение в данном направлении обеспечивает широкому кругу (специалистов) участие в формировании позиций, занимаемых участниками в отношении поставленных задач. https://www.thepublicdiscourse.com/author/gennadij54k/
Участник оффлайн! Ufa1688
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.04.2023 18:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

The identity nigoal123 of the boy is not known. app aff1688 He was at an event with the M3M 123goal Foundation, the philanthropic ปั่นสล็อต arm of Indian real estate ทาง เข้า ufabet company M3M Group, based เกมสล็อต in Dharamshala, where the Dalai ufabet vip Lama lives in permanent ทาง เข้า ufabet มือ ถือ exile. CNN has reached out แฮนดิแคป คือ to the M3M Foundation สูตรสล็อต for comment.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 15:57
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft