Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* E.coli Компетентные клетки с помощью PEG.
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 04.08.2001 02:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Необходимы к.клетки, есть приятная методика с ПЭГОМ 3000-8000. Питался вооспроизвести, получается плохо. Может кто знает более эффективный и с малыми затратами метод или знает ньансы данного метода? Cпасибо
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 05.08.2001 14:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Tak eto i est' naibolee optimal'nyi metod. Vo vsyakom sluchae bol'shinstvo moikh znakomykh pol'zovalis' i pol'zuutsya imenno im. Khotya, bylo delo, i s khloridom rubidiya prigotovlyali. Tam effektivnost' do 10 v vos'moi dokhodila.
A s PEGom khorosho vykhodit na kletkakh XL-1.
Nuansy... Kletki ne doljny pererasti. Luchshe pust' men'she plotnost' budet. Nu i vsyo doljno byt' kholodnym: bufera, tsentrifujnye stakany, rotor, probirki, ta korobka kuda vy ikh slojite.... Prichyom eto vsyo doljno byt' kholodnym DO togo kak vy pristupite sobstvenno k prigotovleniu kletok.
Ne rasstraivaites', sperva ni u kogo ne poluchaetsya. Krome togo, davno podmecheno, chto u baryshen' kletki vykhodyat vsegda luchshe!
Esli "k.kletki" deistvitel'no neobkhodimy, mojet stoit poiskat' priyatnuu baryshnu?;-)
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 06.08.2001 16:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Я делаю так:
1. Ночную культуру (в моем случае 2 мл культуры JM109) в 200 мл LB, растить до OD600 ~ 0.3 – 0.4 (я как-то растил 3 ч, видимо, перерастил; однако клетки получились). Как показал опыт, хороший результат при соотношении ночная культура : среда 1:100 дает 2-х часовой подрост клеток; OD600 при этом достигает 0.35.
2. Охладить колбу 15ґ на льду, далее все манипуляции тоже на льду.
3. Осадить клетки 15ґ 3500 rpm, ротор JA-14; супернатант стерильно убрать.
4. Ресуспендировать осадок в TSS буфере, ~ 5% от начального объема культуры (я брал на 200 мл LB 7 мл TSS).
Состав буфера TSS:
LB + 10% PEG Mr 6000 (wt/vol),
5% DMSO, 50 mM MgCl2, pH = 6.5
Например:
Среда LB 10 мл
PEG Mr 6000 1.15 г
1 M MgCl2 0.575 мл
DMSO 0.575 мл
Стерилизовать через фильтр.
5. Оставить суспензию на льду на 10ґ.
6. Расфасовать аликвоты по 200 мкл, в азот и на -70є С.
Получается нормально.
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 06.08.2001 19:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Спасибо Vlad2 за ваши любезныи ответы. Каковы параметры приятной баришни? Сами понимаете клетеи-клетками но и о себе надо подумать.
А если серьезно... Может вы знаете Фирмы производители реактивов... Какой фирмы лучше ПЭГ и мол. массы и.т.п.
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 07.08.2001 14:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Kupite TSS u "Epicentre" i ne morochte sbe golovu.
U nas nekotorye uje paru let im pol'zuutsya. 10 v shestoi - garantirovano, inogda 10 v sed'moi vykhodit.
http://www.epicentre.com/catalog/tss.htm
Khotya ya lichno predpochitau kletki ot "Stratagene".
Leni matushka... ;-)
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 03.09.2001 19:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Очень важно OD (600nm), но тоже - в зависимости от штамма клеток. если смотреть на кривые, то наибольшая компетентность (для штамма XL10 Gold, Stratagene ) наблюдается при 0,300-0,380, далее спад, и очень короткий пик при OD600 = 0,9. в то же время штамм JC 8672 не подчиняется такому правилу.
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 12.09.2001 18:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

stask, расскажите пожалуйста как вы проводите дальнейшую трансформацию плазмидой. Вы избавляетесь от ПЕГа?
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 16.09.2001 16:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Нет, а зачем? Ни ПЭГ, ни ДМСО мне вроде не мешают.
Трансформирую как все:
1. Клетки оттаиваю во льду ~20ґ;
2. К 100-200 мкл клеток добавляю плазмидку, если пере- , или 1/2 лигазной смеси (у меня это 7-10 мкл), если трансформация;
3. ДНК+ клетки держу 20-30ґ на льду;
4. Шок +42єС 90ґґ, затем охлаждаю ~3ґ на льду;
5. Добавляю 4 объема (т.е. 400-800 мкл) среды (LB или 2YT), и на 30ґ на +37 єС (можно с качанием, можно и без);
6. Затем на чашку с антибиотиком. Миллилитр сохнет долго, можно уменьшить объем: открутить клетки 2000 rpm 5ґ (если обороты регулируемые) или на 14000 rpm 30ґґ (если нет), убрать 800 мкл, в оставшихся 200 мкл нежно рассуспендировать сэмплером (пальчиком не получается) осадок клеток – и на чашку.
7. Вроде все.
Всех благ!
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 02.10.2001 00:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Трансформирую без +42 шока и без подроста (при селекции на amp). С подростом эффективность почему-то меньше раз в 5.
Все остальное то-же что у stask.
Участник оффлайн!




 прочитанное сообщение 30.11.2001 21:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

В данной методике температурный шок не обезателен. А вот час подроста необходим для селекции с антибиотиком

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 23.10.21 07:27
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft