Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Alanin |
|
Леонид В Постоянный участник Квебек |
виноват, не совсем понял Ваш вопрос. Если Вы всё размороженное выкинули, то где Вы обнаруживаете МП? В замороженном? Что подразумевается под словом “обнаруживаются“? (каков метод обнаружения?) |
Alanin |
Сначала. Все было хорошо, культуры были чистые. Но где-то с месяц назад ко мне что-то занесли. Все размороженные линии стали прорастать при тех же условиях работы. Смотрела используемые среды, трипсин после суточной инкубации - чисто. Сыворотка чистая. Заподозрили микоплазму. Были проведены вышеописанные мероприятия, после чего снова разморозила культуру - проросла. Окрасила Hoechst, визуализировала на конфокальном микроскопе - оказалось краску плохо смыла, не микоплазма это. Но проблема как была, так никуда и не делась. Клетки вроде неплохо себя чувствуют, но исследованиям очень мешает. Я бы выложила фото, но у меня камера плохая. |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Alanin @ 04.12.2017 04:32) Простите, если как-так описываю проблему или что-то говорю не так. Я просто совсем новенький сотрудник, но мне выпало сразу вот такое испытание) мы все когда-то были новенькими, не смущайтесь. А за одного битого двух небитых дают, так что радуйтесь каждой проблеме. (Alanin @ 04.12.2017 04:32) чистые = “хорошо выглядели под микроскопом“? (Alanin @ 04.12.2017 04:32) можно попросить Вас уточнить слово “прорастать“? Вы инокулируете культуру и ... ? Утром среда желтая, все клетки отлипли? Через 2 дня ? Через неделю ? Среда не желтая, но клеткам хрен ... эээ ... клеточная морфология отлична от нормальной? Раз нет камеры, то развивайте описательные таланты: “В шестнадцатом часу, среда начала приобретать несвойственный ей оттенок свежего яичного желтка поданного, по английски, с дижонской горчицей ... “ итд. Обратитесь за вдохновением к классикам (Чехов, Бунин) Очень успокаивает нервы, когда на работе неурядицы. (Alanin @ 04.12.2017 04:32) на основании чего? (Alanin @ 04.12.2017 04:32) можно попросить конкретизации “неплохо себя чувствуют“? Удвоение с прежней скоростью? Количество мертвых (отлипших) прежнее? итд зачем Вы использовали аж конфокальный микроскоп, и как у него может быть плохая камера если для конфокальной микроскопии используют фотоумножители? |
Alanin |
Микоплазму заподозрили на основании "клинической картины" - прозрачная среда во флаконе с клетками, не мутнеет, но изменяет оттенок в фиолетовую сторону относительно нормы. В пространстве между самими клетками виднеется мелкое нечто, напоминающее песок. Это нечто трипсином не снимается и без клеток (в умершей культуре) не живет, не видно его. Камера у меня плохая не на конфокале, а фотокамера, чтоб натуральную картину визуализировать) Поведение клеток почти не изменилось, они не дохнут почем зря, только прикрепляются чуть хуже и растут чуть медленнее, как мне кажется. На днях разморозила культуру старой заморозки, которой больше года. В ней за пару дней пока не образовалось этого нечто, напоминающего песок, в то время, как культуры более поздней заморозки "прорастают" этим на следующий день. Начальство говорит еще раз проанализировать на предмет микоплазмы. Вот Сообщение было отредактировано Alanin - 06.12.2017 10:43 |
vb Постоянный участник |
Что значит "проанализировать на предмет"? |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Alanin @ 06.12.2017 03:41) Микоплазму заподозрили на основании "клинической картины" - прозрачная среда во флаконе с клетками, не мутнеет, но изменяет оттенок в фиолетовую сторону относительно нормы. уже теплее первое: проверить исправность системы подачи CO2 например, взять пробирку со 1-2 мл среды (коммерческой) и оставить открытой в ламинаре на часок. Поставить в инкубатор. В норме через 20 мин должна вернуться к красно-желтоватой. Защелачивание среды, как признак пророста явление, скажем прямо, редкое. Спросить у соседей нет ли у них проблем (т.е. не завелось ли в автоклавной нового Сансаныча, которому забыли показать, как правильно стерилизовать) Спросить у соседей капельку их сыворотки и попробовать с ней. (Alanin @ 06.12.2017 03:41) В пространстве между самими клетками виднеется мелкое нечто, напоминающее песок. Это нечто трипсином не снимается и без клеток (в умершей культуре) не живет, не видно его. добавить Hoechst 33342 2 µg / ml подождать полчасика. Посмотреть на флюоресцентном микроскопе. Если Вы ничего кроме ядер не видите, то скорее всего чисто. Если Вы что-то видите то это может быть микоплазма, а может и не быть. PCR нужно ставить. (Alanin @ 06.12.2017 03:41) На днях разморозила культуру старой заморозки, которой больше года. В ней за пару дней пока не образовалось этого нечто, напоминающего песок хм ... это плохо ... похоже действительно ... того-с вообще лечение от микоплазмы — гиблое дело, особенно если реактивы нужно ждать месяцами. Проще всё выкинуть. Есть однако старый секретный “дедушкин способ“ основанный на различной чувствительности микоплазмы и эук. клеток к неионным детергентам. PMID: 4888862 PMID: 4341521 найдите путем серийных разведений (в микроплашке) концентрацию детергента при которой клетки едва выживают. И подержите в этом их недельку, пусть с трудом растут, лишь бы не сдохли.
|
Alanin |
(vb @ 06.12.2017 23:18) Как я выше уже писала, окрашивала Hoechst и смотрела на конфокальном микроскопе. (Леонид В @ 07.12.2017 10:26) добавить Hoechst 33342 2 µg / ml подождать полчасика. Посмотреть на флюоресцентном микроскопе. Если Вы ничего кроме ядер не видите, то скорее всего чисто. Если Вы что-то видите то это может быть микоплазма, а может и не быть. PCR нужно ставить. Результаты с конфокала не были точь-в-точь похожи на примерные картинки, но у меня все равно вызывали подозрение. Эксперт из другого института сказал, что это плохо смытая краска. Но вот, скоро снова пойду смотреть) Подача СО2 в норме. Читала, что микоплазма кушает аргинин и защелачивает среду, хотя в других случаях глюкозу и закисляет, но это не у меня. Но спасибо Вам за советы! Попробую эти детергенты, пока реактив не пришел. |
vb Постоянный участник |
(Alanin @ 07.12.2017 09:02) Как я выше уже писала, окрашивала Hoechst и смотрела на конфокальном микроскопе. Результаты с конфокала не были точь-в-точь похожи на примерные картинки, но у меня все равно вызывали подозрение. Эксперт из другого института сказал, что это плохо смытая краска. Но вот, скоро снова пойду смотреть) Подача СО2 в норме. Читала, что микоплазма кушает аргинин и защелачивает среду, хотя в других случаях глюкозу и закисляет, но это не у меня. Но спасибо Вам за советы! Попробую эти детергенты, пока реактив не пришел. Я бы предпочел чтото более специфичное - посев или пцр. |
Alanin |
|
CowDoc Постоянный участник Middle East |
Выкидывайте ВСЕ!!! Закажите новые клетки, или у друзей, которым верите, попросите поделиться. Лечить .... оно вам надо? У вас времени много? Эффект сомнительный. И кто же помещение стирилизует УФ? Так, поверхностная обработка, детский лепет. В пятницу вечером, перед выходными, выключаем вентиляцию, готовим противогаз, чайник, 20-30 мл формола на куб.м. + столько же воды, ставите кипятиться. Как выкипает, автоматически выключается (в этом плане хороши дешевые китайские стеклянные) или удлинитель/таймер и контролируете из др. помещения. Удобно индукционную панель - дешево и есть контроль выкипания + слабое кипение. Вторую панель ставите через таймер через 2 часа после формола (экспозиция дезинфекции) с нашатырем (тот же объем и тж процедура). Ради любопытства и до всяких QA возьмите смыв до и после - результат вас порадует. И микоплазма так быстро не растет в культуре клеток, тем более не на селлективной среде. |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(CowDoc @ 08.12.2017 08:01) это, безусловно, самый лучший способ. (CowDoc @ 08.12.2017 08:01) это, разумеется, радикально, но ... микоплазма это чаще всего руки, рот, дырявый фильтр в боксе (если среда с антибиотиками и они подавляют др. бактерии) итд. если все (любые) культуры в инкубаторе моментально (быстро) заражаются чем-то, то это либо общий реактив, сыворотка, например, либо инкубатор per se, либо пипетки-банки, которые прошли через автоклав, но помещение как таковое это вряд ли. Во всяком случае не до стадии противогаза. смущает быстрое защелачивание ... очень подозрительно. |
vb Постоянный участник |
|
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(vb @ 08.12.2017 11:59) ммм ... ну, защелачивание видел неоднократно, но с проростом это не было связано. Поломка инкубатора, забытый бикарбонат (в доисторическую эпоху, когда его надо было добавлять в среду самому) итд но, говорят, бывает. Грибы, вроде, некоторые защелачивают. Но сам не видел, ни, слава Богу, в инкубаторе, ниже в литературе
|
CowDoc Постоянный участник Middle East |
А относительно радикально - то извините, это нормальная практика регулярная стерилизация помещени Н2О2 или, где еще не запрещено, формол. Когда у тебя комнатка 20 кв.м., может и нет смысла, а когда у тебя производственные помещения кат. В, и ферментеры по 2-3 тонны, то не до "... а может так, а может этак ...". И еще раз, вы видели, что за месяц может прям так микоплазма вылезти? за месяц, даже если 3 пересева в неделю = 12 пассажей, а на быстро растущих культурах, так не выскачет. Она или есть, или нет. Как потом человек будет MSC и WSC формировать и хорактеризовать. Good Cell Bank Practice нельзя нарушать, потом дороже станет. |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(CowDoc @ 09.12.2017 02:32) производственные помещения кат. В, и ферментеры по 2-3 тонны, то не до "... а может так, а может этак ..." ну, в данном случае речь явно не идет о ферментерах на 3 тонны. Словом, выкинуть всегда лучше чем оставить. А уж если есть старая не зараженная культура, то решение однозначно. |
Biyolugy |
Кто что использует для определения уреплазмы и что посоветуете? Хотелось бы услышать аргументированное мнение. |
Guest IP-штамп: frcLIpgx60FF2 гость |
(Леонид В @ 01.12.2017 21:53) Добрый день, виноват, не совсем понял Ваш вопрос. Если Вы всё размороженное выкинули, то где Вы обнаруживаете МП? В замороженном? Что подразумевается под словом “обнаруживаются“? (каков метод обнаружения?) дайте в культуру немного по времени бромдезоксиуридина потом краситель хехст потом легким уф микоплазме кирдык |
Guest IP-штамп: frcLIpgx60FF2 гость |
(Guest @ 03.12.2018 22:08) дайте в культуру немного по времени бромдезоксиуридина потом краситель хехст потом легким уф микоплазме кирдык культуру лучше загнать в стационарку |
lillyjeets Philippines |
(Alanin @ 06.12.2017 11:41) Культуры были чистые - это значит, были без посторонних организмов. Микоплазму заподозрили на основании "клинической картины" - прозрачная среда во флаконе с клетками, не мутнеет, но изменяет оттенок в фиолетовую сторону относительно нормы. В пространстве между самими клетками виднеется мелкое нечто, напоминающее песок. Это нечто трипсином не снимается и без клеток (в умершей культуре) не живет, не видно его. Камера у меня плохая не на конфокале, а фотокамера, чтоб натуральную картину визуализировать) Поведение клеток почти не изменилось, они не дохнут почем зря, только прикрепляются чуть хуже и растут чуть медленнее, как мне кажется. На днях разморозила культуру старой заморозки, которой больше года. В ней за пару дней пока не образовалось этого нечто, напоминающего песок, в то время, как культуры более поздней заморозки "прорастают" этим на следующий день. Начальство говорит еще раз проанализировать на предмет микоплазмы. Вот виноват, не совсем понял Ваш вопрос. Если Вы всё размороженное выкинули, то где Вы обнаруживаете МП? В замороженном? Сообщение было отредактировано lillyjeets - 18.12.2018 15:12 |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
|
Faiz-45 |
1. Если вы взяли эту культуру из чьей-то коллекции (паример институт полиомелита) - Вам уже дали зараженную культуру на 5-6 паасжей и покупали вновь. - это действительно факт. 2. В сыворотках (даже эмбриональных) от некоторых фирм, особенно российских, очень часто (!) имеется микоплазма. Совет - покупайте сыворотку с подтверждением отсутствия микоплазы, чаще всего это пневмония. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |