Какая концентрация праймеров в реакции? Указанные вами мкл делу не помогают, так как непонятно, какая у вас концентрация стока праймеров.
Снизьте до 150-200 nM.
И зачем так долго держать реакцию на элонгации?

Qubit нормально работает. И есть у многих, т.е. не будет проблем с закупкой реактивов.

Если гонять на форезе выделенную геномную ДНК КРС, то риски минимальные. Это же не ампликоны или плазмиды.

Точно.
Если консервативные последовательности, то лучше все-таки митохондриальные, IMHO.
Есть небольшой опыт с праймерами на хромосомные консервативные рибосомные повторы, которые тянут всё - от птицы до человека. С ними всё время лезет сигнал в контроле выделения. Видимо, контаминированы наборы для выделения ДНК. С митохондриальными такого нет.

В ИОГене в лаборатории Рогаева был Covaris.

Мило...но немного напомнило 90-е.
Сделайте, если сможете, чтение хроматограмм сенгеровского секвенирования с выравниванием против референсной последовательности. Такая опция есть в Ugene, Snapgene, benchling, Genome Compiler, но, возможно, будет востребовано, как отдельная программа. Chromas ведь, к примеру, до сих пор используется в хвост и гриву.
И делайте на английском, аудитория будет пошире.

Вебинар NCBI
"Updated BLAST rRNA Databases: RefSeq Ribosomal RNA Sequences for Identification of Fungi, Bacteria, and Archaea"
Wed, Jun 17, 2020 7:00 PM - 7:45 PM MSK.
NCBI produces a set of curated marker rRNA sequences (targeted loci) for Bacteria and Archaea (16S) and Fungi (18S, 28S and ITS). We now have 41,000 markers, which are available as a distinct set of BLAST databases. These sequences are largely from type strains and are useful for identifying organisms. You will learn about the scope of the targeted loci projects and see practical examples of using these data and NCBI BLAST to help identify organisms and explore their diversity. You will also learn about and see how to avoid pitfalls of assigning identities only from the BLAST results from a single locus.
https://register.gotowebinar.com/register/3...632048342917133

Тогда, похоже, ничего не остается, как осуществлять ротацию персонала на рабочих местах и проводить постоянный анализ (оператор, лот, условия и т.д), который советовали выше.
Какая разница, что Ваш уникальный оператор, как многорукая Шива, выделяет РНК со скоростью робота, если все равно приходится повторять анализы?

На последних циклах в пробах что-то поднимается, но не поднимается в отрицательном контроле — это не контаминация, а что-то с дизайном или качеством олигов, смею предположить. Температуру отжига повысить нельзя? СОП не велит?

Так это же препринт. Можете авторам прямо задать этот вопрос. В качестве самоназначенного рецензента.

Продолжу флудить здесь. Простите, уважаемая Виста.
Прикольная комбинация серологического теста и ПЦР для выявления антител к SARS-Cov2.
Позволяет работать с сухими пятнами крови.

"..For the testing, the eluent was assayed using a modified Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP) protocol [12-14]. Briefly, 8 µL of eluent was incubated with 8 µL of 1 femtomole of SARS-CoV-2 spike protein S1 subunit-DNA conjugate pair mixtures at 37 °C for 30 min. If present, the SARS-CoV-2 antibodies in the specimen engage with S1-DNA conjugate to agglutinate into a dense immune complex. To quantify the degree of agglutination, 116 µL of ligation solution (20 mM Tris, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 20 mM DTT, 25 μM NAD, 0.025 U/μl ligase, 100 nM connector) was mixed with 4 µL eluent/conjugate mixture and incubated at 30 °C for 15 min. Then, 25 µL of the ligated solution was mixed with PCR master mix that contained primer pairs and polymerase for amplification under standard thermocycling conditions (95 °C for 10 min, 95 °C for 15 sec, 56 °C for 30 sec, 13 cycles). The pre-amplified products were then quantified in a 96-well qPCR plate. SYBR green-based qPCR was performed on a Bio-Rad CFX96 real-time PCR detection system (95 °C for 10 min, 95 °C for 30 sec, 56 °C for 1 min, 40 cycles). As a result of agglutination, specimens harboring high quantities of antibodies will have large quantities of amplifiable DNA, thus exhibiting a strong qPCR signal (low Ct). In contrast, samples without SARS-CoV-2 antibodies
will have few DNA amplicons, thus yielding a weaker qPCR signal (high Ct)"
https://www.medrxiv.org/content/10.1101/202...6004v1.full.pdf

Вот тут пишут, какой состав буфера в реакции должен быть, что Taq-полимераза сревертировала РНК без обратной транскриптазы.
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.27.120238v1

В простой морозилке? Или вообще при 4 оС?

Не согласна с этим тезисом. Сталкивалась с множеством безграмотных.

Мне любопытна история про положительный контроль для теста на РНКовый вирус.

Судя по тому, что пишет уважаемая Виста про раствор для положительного контроля, в ее лаборатории работают с ДНК в качестве положительного контроля.

Про наборы Вектора пишут, что у них нет внутреннего РНКового контроля.
"...одним из недостатков «векторовского» набора является то, что в нем есть лишь реагенты для ПЦР, то есть третьей, заключительной операции анализа. А для выделения РНК и обратной транскрипции предлагается использовать наборы других производителей. В комплектации набора также отсутствует внутренний контрольный образец (ВКО) — молекула РНК, защищенная от действия нуклеаз, которую добавляют в образец и которая вместе с мишенью проходит все стадии анализа..."
https://pcr.news/stati/test-na-koronavirus-dlya-rossii-2/

CDC поставляет РНК положительного контроля в лиофизованном виде. После разведения надо сделать аликвоты по 30 мкл, аликвоты заморозить на -70 oC. После размораживания аликвоту используют, её неиспользованные остатки выбрасывают.


...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC) Preparation:
1) Precautions: This reagent should be handled with caution in a dedicated nucleic acid handling
area to prevent possible contamination. Freeze-thaw cycles should be avoided. Maintain on ice
when thawed.
2) Resuspend dried reagent in each tube in 1 mL of nuclease-free water to achieve the proper
concentration. Make single use aliquots (approximately 30 μL) and store at ≤ -70oC.
3) Thaw a single aliquot of diluted positive control for each experiment and hold on ice until adding to plate. Discard any unused portion of the aliquot...

Смотрю на инструкцию CDC и вижу, что у них положительный контроль - это in vitro транскрибированная РНК. И это правильно. Что служит положительным контролем в отечественных наборах? Меня терзают смутные сомнения, что это ампликон, заклонированный в плазмиду.
...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC)
For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ...
https://www.fda.gov/media/134922/download

А в чём у вас выражается контаминация?
Есть продукт в контроле выделения? В отрицательном контроле? В заведомо отрицательных пробах? На каком цикле появляется контаминация?
Просто из любопытства - положительным контролем служит плазмида или всё-таки РНК?

Использование носиков с фильтрами - профилактика контаминации, передающейся через дозаторы.

Справедливости ради надо отметить, что больница в Коммунарке открылась только что и прежде запланированного срока. То есть, они начали работать с колёс.

https://vk.com/wall-110012660_323
Денис Проценко, главврач 40-й (просьба расшарить)

«Уважаемые коллеги! Нам в команду требуются врачи и лаборанты для ПЦР-диагностики
Звоните по общему номеру +7 495 744 07 03 или +7 968 921 40 23»

В статье пишут deltaCt, правда, я не поняла, какой они использовали референс. Какой-то внутренний положительный контроль?

Это фишка количественного ПЦР.
С клиникой показатели теста могут коррелировать, а именно: малые значения deltaCt обычно свидетельствует о высокой вирусной нагрузке и можно ожидать тяжелое течение болезни (https://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS1473-3099(20)30232-2/fulltext).

КСтати, вот свеженькое сравнение разных RT-qPCR тестов, которые используют за рубежом. Авторы работают в Штатах.
Vogels et al. Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-COV-2 qRT-PCR assays //MedRxiv. - 2020. - https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108
https://www.medrxiv.org/content/10.1101/202...3.30.20048108v1

А это от корейцев:
Jung et al. Comparative analysis of primer-probe sets for the laboratory confirmation of SARS-CoV-2//bioRxiv 2020.02.25.964775; doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.25.964775
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.25.964775v1

От китайцев:
Xiong et al. Comparative performance of four nucleic acid amplification tests for SARS-CoV-2 virus// bioRxiv 2020. - oi: https://doi.org/10.1101/2020.03.26.010975
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.26.010975v1

С вакциной, похоже, какая-то засада. Я совсем не иммунолог, но насколько поняла, что иммунизация антикороновирусными вакцинами сама по себе может вызвать патологические процессы в лёгких.
"These results suggest that an excessive host immune response against the nucleocapsid protein of SARS-CoV is involved in severe pneumonia caused by SARS-CoV infection."

Tseng, C. T., Sbrana, E., Iwata-Yoshikawa, N., Newman, P. C., Garron, T., Atmar, R. L., ... & Couch, R. B. (2012). Immunization with SARS coronavirus vaccines leads to pulmonary immunopathology on challenge with the SARS virus. PloS one, 7(4).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3335060/

Yasui F. et al. Prior immunization with severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus (SARS-CoV) nucleocapsid protein causes severe pneumonia in mice infected with SARS-CoV //The Journal of Immunology. – 2008. – Т. 181. – №. 9. – С. 6337-6348.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18941225

Honda-Okubo Y. et al. Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus vaccines formulated with delta inulin adjuvants provide enhanced protection while ameliorating lung eosinophilic immunopathology //Journal of virology. – 2015. – Т. 89. – №. 6. – С. 2995-3007.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25520500

В NYT пишут (https://www.nytimes.com/2020/03/28/opinion/germany-coronavirus.html), что немцы вовремя загнали пожилых людей в самоизоляцию, поэтому средний возраст инфицированных в Германии значительно ниже, чем у итальянцев (46 vs 63). И процент пожилых среди заболевших ниже, чем в среднем по популяции.
Плюс санитарные меры: отслеживание контактов заболевших, диагностика среди них и карантин инфицированных.

IMHO, нет. Проветривать смысл имеет.
Пруф: Liu, Y., Ning, Z., Chen, Y., Guo, M., Liu, Y., Gali, N. K., ... & Liu, X. (2020). Aerodynamic Characteristics and RNA Concentration of SARS-CoV-2 Aerosol in Wuhan Hospitals during COVID-19 Outbreak. bioRxiv.
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.08.982637v1