molbiol.ru -> Многоцветный цитометрический анализ культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток

> Все форумы > Тематические форумы > Клеточные технологии

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Многоцветный цитометрический анализ культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Компания Biocommerce - официальный дистрибьютер продукции компаний Miltenyi Biotec GmbH (Германия) и RanD S.r.l. (Италия).

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Biocommerce

г. Москва, ул. Кулакова, д.20, стр.1А

17.10.2018 16:12

URL #1

Тщательная характеристика плюрипотентности является обязательной процедурой, при получении свежевыделенных эмбриональных или индуцированных клеточных линий плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). Однако, не менее важно проводить контроль созданных клеточных линий с целью выявления признаков спонтанной дифференцировки. Контроль плюрипотентности и состояние дифференцированности культуры (PSC) обычно проводится методом иммунофлюоресцентной микроскопии. Однако, данный метод весьма кропотлив и не позволяет провести надежную количественную оценку клеточных популяций.
Несмотря на все свои возможности, метод проточной цитометрии довольно редко применяется в исследованиях стволовых клеток. В данном обзоре представлен протокол для многоцветного цитометрического анализа, который позволяет количественно определять внутриклеточные и поверхностные маркеры одновременно, для обеспечения легкого мониторинга плюрипотентного статуса человеческой культуры PSC.

Клеточные линии
Человеческие PSC культивировались в среде StemMACS™ iPS-Brew XF, human (#130-104-368) в лунках 6-луночного культурального планшета, лунки которого покрыты Matrigel® hESC-Qualified Matrix. Для того, чтобы подтвердить, что методом проточной цитометрии можно обнаружить потерю плирипотентности стволовых клеток, были также проанализированы hiPSCs, дифференцированные в нейрональную линию. Клеточные линии плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных стволовых клеток были обработаны 0.05% раствором trypsin/EDTA для получения "single cells" клеточной суспензии, пригодной для цитомтерического анализа.

Проточный цитометрический анализ

Окрашивание клеток антителами
Панель для анализа PSCs включает антитела как для поверхностных, так и для внутриклеточных маркеров. На первом этапе окрашиваются поверхностные маркеры. Затем, клетки фиксируются и пермеабилизируются для внутриклеточного окрашивания.

Для того, чтобы настроить прибор и провести компенсацию флюоресценции обязательно необходимо подготовить контрольные образцы с одиночной окраской каждым антителом и также неокрашенный контрольный образец, который культивировался и подвергался таким же процедурам, что и остальные образцы.

На заметку: Fluorescence-minus-one (FMO) контроль может быть очень полезен для более точного определения гейтов. FMO-контроль содержит все антитела, кроме одного.

Методика окрашивания:

1) Определить количество клеток. Использовать для анализа 1×10⁶ iPS-клеток.
2) Центрифугировать клеточную суспензию при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
3) Ресуспендировать образец 1 в 77.8 μL буфера. Это будет образец, окрашенный всей панелью антител.
4) Ресуспендировать образцы 2-7 в 100 μL буфера. Это будут: неокрашенный контроль и одиночно окрашенные контрольные образцы.
5) Добавить по 10 μL каждого антитела (согласно схеме в табл.2) в образец 1 для определения поверхностных маркеров: Anti-TRA-1-60-PE, ii) Anti-SSEA-4-VioGreen™, and iii) Anti-SSEA-5-VioBlue®. Add 2.2 µL of Anti-SSEA-1-PE-Vio 770.
6) Добавить по 10 μL каждого антитела по отдельности (согласно схеме в табл.2) в образцы 3-5 для определения поверхностных маркеров.
7) Не добавляйте антитела в образцы 2,6,7 на данном этапе.
8) Тщательно перемешать образцы и инкубировать 10 мин в темноте при 2-8 °C.
На заметку: высокая температура или длительная инкубация могут привести к неспецифическому мечению клеток антителами.
9) Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
10) Ресуспендировать все образцы в 100 μL буфера. Добавьте по 100 μL раствора для фиксации (Inside Fix, Inside Stain Kit (#130-090-477)).
11) Тщательно перемешать образцы и инкубировать 20 мин при комнатной температуре в темноте.
12) Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
13) Ресуспендировать образец 1 в 90 μL буфера для внутриклеточного окрашивания/пермеабилизации (Inside Perm, Inside Stain Kit (#130-090-477)).
14) Ресуспендировать образцы 2-7 в 100 μL буфера для внутриклеточного окрашивания/пермеабилизации.
15) Добавить по 10 μL каждого антитела (согласно схеме в табл.2) в образец 1 для определения внутриклеточных маркеров: i) Anti-Sox2-FITC, and ii) Anti-Oct3/4 Isoform A-APC.
16) Добавить по 10 μL каждого антитела по отдельности (согласно схеме в табл.2) в образцы 6 и 7 для определения внутриклеточных маркеров.
17) Тщательно перемешать образцы и инкубировать 15 мин при комнатной температуре в темноте.
18) Промыть клетки добавлением 1 мл и центрифугированием при 300g в течение 5 мин. Аспирировать супернатант полностью.
19) Ресуспендировать осадок клеток в удобном для анализа объеме буфера для проточной цитометрии. Рекомендованный объем - 1 мл.
На заметку: Фиксированные и пермеабилизированные клетки имеют меньший размер, по сравнению с живыми клетками. Поэтому настройки FSC/SSC скорее всего придется отрегулировать.

С результатами и дот-плотами цитометрического анализа можно ознакомиться перейдя по ссылке: Многоцветный цитометрический анализ культуры плюрипотентных стволовых клеток человека

Оригинал статьи: Оригинал статьи

Картинки:
картинка: ______________________PSC_4.jpg

картинка: ______________________PSC_4.jpg

______________________PSC_4.jpg — (115.77к)

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

19.10.2018 22:15

URL #2

Isotype Controls??? Зачем?...и всего 6 цветов... Робяты, вы из 2006 года или ранее портал открыли? Читайте материалы по многоцветке, кои я в прикрепленных темах еще лет 8-10 назад разместил- куда как актуальнее будут.

P.S. И где dump, live/dead, doublet exclusion и прочее в протоколе?

Biocommerce

г. Москва, ул. Кулакова, д.20, стр.1А

21.10.2018 17:56

URL #3

(Дядя ФАКСер @ 19.10.2018 23:15)

P.S. И где dump, live/dead, doublet exclusion и прочее в протоколе?

Данная методика разработана с целью анализа культур плюрипотентных стволовых клеток, а именно для обеспечения надежного контроля состояния плюрипотентности PSC методом проточной цитометрии. В настоящее время основными рутинными методами контроля плюрипотентности линий стволовых клеток является оценка маркеров плюрипотентности методами ОТ-ПЦР, иммуногистологическое окрашивание или иммуноблот-анализ. Обычно используются одновременно два метода. Данные методы являются весьма трудоемкими и не позволяют провести надежную количественную оценку клеточных популяций.
Приведу несколько работ (ссылки ниже), которые подтверждают, что при работе с линиями плюрипотентных стволовых клеток применяются именно методы ОТ-ПЦР и иммуногистологическое окрашивание:
1) Патент способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток 2009
2) Выращивание индуцированных человеческих плюрипотентных стволовых клеток 2018
Приведенная данная методика проточной цитометрии предложена для внедрения в рутинную практику совместно или взамен (какого либо одного) из используемых методов для подтверждения плюрипотентного статуса линии стволовых клеток.
Да, конечно, сейчас, многоцветный цитометрический анализ ассоциируется с использованием 8-10 и более антител, однако далеко не каждая лаборатория может позволить себе такое оборудование, позволяющее проводить сложный многоцветный анализ, а также вряд ли такой многоцветный анализ (8-10 и более антител) можно назвать рутинной процедурой.
Считаю, что использование изотипических контролей является неотъемлемой частью цитометрического анализа, тем более, когда методика представляет собой не простое иммунофенотипирование клеточных популяций (такое как выявление Т,В и NK-клеток), а выявление специфических маркеров. Не говоря уже про внутриклеточное окрашивание, где без изотипических контролей вообще никак не обойтись.
Что касается doublet exclusion и live/dead, я с вами согласна, в оригинальный мануал это должно было войти, тем более, что работа предполагает снятие клеток с подложки перед анализом, а в суспензии "снятых"адгезионных культур всегда будут присутствовать дублеты.

Сообщение было отредактировано Biocommerce - 22.10.2018 14:59

Поблагодарили (1): Дядя ФАКСер

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

22.10.2018 11:49

URL #4

(Biocommerce @ 21.10.2018 16:56)

Что касается doublet exclusion и live/dead, я с вами согласна, в оригинальный мануал это должно было войти, тем более, что работа предполагает снятие клеток с подложки перед анализом, а в суспензии "снятых"адгезионных культур всегда будут присутствовать дублеты.

ICs - исключить, FMO - достаточно (это обсуждалось в цитометрическом комьюнити более 10 лет назад и аппрувнуто, как gold standard). Ссылку на диссер "младшей группы"- убрать.

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

22.10.2018 11:50

URL #5

https://expertcytometry.com/when-to-use-and...otype-controls/

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

22.10.2018 11:51

URL #6

А вот ссылочка на дискуссию давнюю https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometr...ary/032198.html

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

22.10.2018 11:53

URL #7

8 цветов- рутина последние годы даже в клинике. В ресече рутина ныне 12-14.

Леонид В
Постоянный участник
Квебек

13.11.2018 08:08

URL #8

(Biocommerce @ 21.10.2018 10:56)

Приведенная данная методика проточной цитометрии предложена для внедрения в рутинную практику * для подтверждения плюрипотентного статуса линии стволовых клеток.
*далеко не каждая лаборатория может позволить себе такое оборудование, позволяющее проводить сложный многоцветный анализ,

это всё так, но позволю себе пару вопросов (не в порядке полемики, но обмена мнениями ради)

Разве плюрипотентныя линии стволовых клеток получают и в далеко и в каждой лаборатории? Сельский медпункт?

Из певдонима Biocommerce можно сделать если не вывод, то предположение, что речь идет о деньгах. Слова “плюрипотентный“ и “стволовых клеток“ со словами “каждая лаборатория“ не ассоциируются.

Цитометр на 13 цветов стоит сейчас жалкие проценты от стоимости оборудования для лаборатории, которая манипулирует стволовыми клетками.
Анализ 13 цветов ничем не отличатся по сложности от анализа 3-х цветного. При условии, разумеется, что используются конъюгированные АТ, а не самопальные схемы непрямой флюоресценции с первичными и вторичными АТ, что было бы мало что странно, но просто несовместимо с работой над стволовыми клетками.

Возможно, что психологическая ориентация на использование словосочетания “сложный многоцветный“ неверно ориентировала Вас.
Сложность не в многоцветности а в ответе на вопрос зачем? Цветов хоть 30 и цены на цитометры давно упали. И программы анализа стали просты как банный веник.
А вот ответ на вопрос “зачем“ как был так и остался.

Поблагодарили (1): Дядя ФАКСер

watchesonline89
Постоянный участник

05.01.2023 11:49

URL #9

https://omegawatches89.mystrikingly.com/
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248
https://eatsleepride.com/c/383270
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0
https://omegawatches90.mystrikingly.com/
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online
https://62e8da780bf7c.site123.me/
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.