Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
NatKo |
Мне нужно почистить АТ, полученные к 24-субъединичному белку. К Sepharose-BrCN я этот белок пришила, но при элюции АТ (при рН=3) вместе с ними выходят и субъединицы. Как от этого избавиться? заранее благодарна за помощь <img src="graemlins/shuffle.gif" border="0" alt="[смущение]" /> |
Dimych Постоянный участник Kr-sk - Puschino - NYS - Calgary... Круг замкнулся |
1. Оставить все как есть, предварительно отмыв колонку от "лишних" субъединиц. Можно сказать наверняка, что пошился Ваш белок вполне статистически и останется на колонке "всякой твари по паре". Даже поболее немного. Емкость будет несколько ниже, чем если бы там висело все, но все ж лучше, чем загрязненные образцы. 2. Перешить белок глутаром или еще чем. Глутаровые сшивки, правда, неустойчивы в кислых рН. Ну и сам подбор условий занятие отдельное, поскольку при передозировке у Вас будет преципитат, а при недошиве проблемы останутся. Так что первый вариант видится мне наименее хлопотным и наиболее надежным. |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
Dimych Постоянный участник Kr-sk - Puschino - NYS - Calgary... Круг замкнулся |
Будь добреньким, расшифруй, не ленись. Или скажи, кто этим добром торгует, а я уж сам описания гляну. Интересно мне - вдруг сгодится. Я кроме глутара ничем не пользовался, самому тыкаться и искать ломы, да и не так, чтобы уж очень дешево. |
Lex Постоянный участник |
|
NatKo |
спасибо за советы но даже в третий! раз при промывании рН=3 (второй и третий - без АТ)субъединицы сходят тока в путь :-(( Хотя, может, в четвертый раз помыть? :-))я все-таки попробую :-)) как я поняла при таком значении рН глутаровый альдегид поможет, как мертвому... :-)) поэтому, уважаемый Veshka! скажите пожалуйста, где можно узнать о методах использования упомянутых Вами веществ? спасибо |
Dimych Постоянный участник Kr-sk - Puschino - NYS - Calgary... Круг замкнулся |
На счет промывки: поставьте объем побольше и в путь. Ну и соли милимолей 200 (извиняюсь, что про это советую, но я и сам иногда забывал тривиальные вещи). Может быть имеет смысл отмывка с мочевиной или гуанидином. |
Midgardsormen Постоянный участник |
http://www.piercenet.com/Objects/View.cfm?...pe=File&ID=0418 оттуда грузится пдф. Вообще потыркаться по пирсу нехило |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
Aronich Участник |
но почему не попробиват crosslink еше в растворе (naprimer HMDC - hexamethylene diisocyanate targets aminogroups) а потом вязат на агарозу |
Dimych Постоянный участник Kr-sk - Puschino - NYS - Calgary... Круг замкнулся |
|
Tom1 Постоянный участник |
Может есть смысл пришить только ту субединизу на которую реально получены антитела????? [Текст переведён с транслита] |
NatKo |
ха! в том и дело, что АТ-то поликлональные! :-)) выделенные осаждением каприловой кислотой они дают такую неспецифику, что тесты ... сами понимаете какие :-(( поэтому я и решила их аффинно очистить если вы спросите, почему у меня нет моноклонов - потому что в беларусской науке счас сложно с деньгами :-(( а ответить на вопрос, все ли субъединицы выходят, я не могу, потому как их аж 24, и этот белок самопроизвольно собирается. но наверняка на агарозе чего-то остается Aronich если не получится с агарозой, придется, скорее всего сшивать в растворе - просто белка жалко Midgardsormen спасибо за ссылку Dimych спасибо, соли как раз столько и добавляла :-))) ничуть не обижаюсь :-)) пойду забивать колонку :-)) |
NatKo |
тоже спасибо :-)) |
Tom1 Постоянный участник |
Естно что на какую-то субединизу ответ лучше чем на остальные. За это и горовит сваливание белка с аффинной колонки. Что значит не возмогно посмотреть какие дополнительно шодят?? Что копплекс устоичив к SDS i 2-Meo слабо вериться... кстати о птичках судя по всему кролика кололи всеми субединизами сразу тогда и моноцлональные антитела не помогут... Я думау что надо выделить одну субединицу и на нее получить антитела.... [Текст переведён с транслита] |
NatKo |
на счет моноклонов к субъединице - надо будет сказать шефьям, когда деньги появятся а кроликов действительно кололи "цельным белком",но состоящим из одинаковых субъединиц а можно Вас по-Email'u вопросами закидать? <img src="graemlins/shuffle.gif" border="0" alt="[смущение]" /> |
Tom1 Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
Midgardsormen Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
Что касаемо слабои пришивки антигена на гель дык это как два пальза об асфальт если бромциан старый. Я уже тут когда-то писал что лучше на епокси шить... P.S. To:Worm.. А в какои лабе был в UW по времени должны были пересекаться.... Я там был с 1999-2001 [Текст переведён с транслита] |
Midgardsormen Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
Midgardsormen Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
Deuscht [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] |
Tom1 Постоянный участник |
Kakoj u tebya e-mail chto posle vladimir???? |
Midgardsormen Постоянный участник |
|
NatKo |
да, белок состоит из 24х одинаковых субъединиц когда антитела получали, меня не спрашивали (никого не спрашивали), как бедных кроликов колоть - жираф большоой так что у меня есть антисыворотки, у которых достаточно высокий титр специфических АТ, но почему-то при их выделении (я упоминала - каприловой кислотой) они дают огромную неспецифику и очень небольшое связывание - может, вообще собака порылась в выделении этих АТ по поводу совета номер один Dimycha - соотношение сходящих с колонки АТ и субъединиц (при рН=3)примерно 1:10,а при промывке вначале обычным буфером (рН=7,4, соль и т.п.)они не смываются - так что вроде BrCN живой |
Tom1 Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
NatKo |
|
Midgardsormen Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
50% только насыщения!!!! потом осадок диализнуть против буфера с низкои солью и на анионнообменник иммонoглобулины в проскоке. если все аккуратно делать то на форезе видно только 5-6 полос причем IgG мажорная. [Текст переведён с транслита] |
Tom1 Постоянный участник |
Ты мои е-маил получил??? [Текст переведён с транслита] |
Tom1 Постоянный участник |
Ты мои е-маил получил??? [Текст переведён с транслита] |
Midgardsormen Постоянный участник |
|
NatKo |
спасибо, только колонку уравновешивать буфером с такой же солью как в диализе или без оной? Midgardsormen может, и сефароза+белок так реагирует на экстрим, потому как в ИФА она нормально взаимодействует с АТ (хоть и с высокой неспецификой) - а там промывка далеко не одна |
Tom1 Постоянный участник |
прилагаю описание выделения ..sorry за англисиский это я тут для местных лаборантов переводил... Scheme of purification IgG from rabbit serum. Add to serum sodium sulphate ( to 50%) mix overnight and spin down 6000rpm-10000rpm 0.5 h. Or add to serum 1v of 50% PEG-6000 (2v serum –1v PEG) Pellet solved in min. volume of next buffer 25mMtris, 35 mM NaCl pH 8.8 (buffer A) If you used sodium sulphate you must dialyzing sample against the same buffer 4h two times. If you use PEG you can use the sample w/t dialyzing. In the next step will apply the sample to DEAE resin ( usually I used DEAE-Trisarcryl M), which equilibrated with buffer A. IgG not bind to resin. ( see fig 1.) The ballast proteins was eluted with next buffer 25mM tris 1M Nacl pH 8.8. If you want concentrating IgG you can do next step. Dialyzing IgG against 20mM HEPES 150mM NaCl pH 7.4 overnight 4 times. Apply the IgG solution to HTP resin and will elute the IgG by 2000mMNaPi pH7.2 (see fig 2.) Column size for purification IgG from 50ml serum DEAE 2.5x16.5 cm (v =80ml) HTP 2.5x4.5 cm (v=28ml) [Текст переведён с транслита] |
Tom1 Постоянный участник |
|
NatKo |
мне тут еще насоветовали как можно избавиться от глициновых буферов - достаточно просто, поэтому наводит на мысль о гениальности и успехе :-)) 3% этанолом или банальным 2М NaCl - говорят, получается |
Tom1 Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
NatKo |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
guest: 123vega IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |