molbiol.ru -> сиквенс

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* сиквенс

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Leka

26.01.2002 22:46

URL #1

Кто нибудь делал сиквенс PCR фрагмента без клонирования?
поделитесь опытом

Grunt
Постоянный участник

26.01.2002 22:52

URL #2

MBI Fermentas Taq sequensing kit. www.fermentas.com

a26
Постоянный участник

27.01.2002 00:35

URL #3

U menia est` opyt sequence of PCR fragments, no eto automatic fluorescent sequence. Interesuet li eto vas?

a26
Постоянный участник

27.01.2002 00:36

URL #4

U menia est` opyt sequence of PCR fragments, no eto automatic fluorescent sequence. Interesuet li eto vas?

Leka

27.01.2002 00:57

URL #5

Нет спасибо fluorescent sequence здесь не поможет, у меня секвенируется только процентов 30 от всей последовательности,
А секвенировать придеться один и тот же кусок на наличие в нем метилированных цитозинов, в общем и так сложности возникают, а уж как клонировать не хочется...

artais
Постоянный участник

27.01.2002 18:08

URL #6

Уважаемый Leka!
Мне пришлите методу PCR-automatic fluorescent sequence!

Интересно очень, возможно скоро придется делать.
Был бы Вам за это очень благодарен

Мое мыло: artais@rambler.ru
Best regards,
Artais

VLAD2
Участник

27.01.2002 19:30

URL #7

Leka,
Впрямую прод. ПЦР сиквинируются любым способом с разной степенью паршивости. Но циклический сиквинс с термостабильным ферментом дает лучшие результаты, особенно для коротких продуктов.. Не важно с какой меткой и на каком приборе.
А как вы собираетесь детектировать метилированые основания?

VLAD2
Участник

27.01.2002 19:31

URL #8

petr
Постоянный участник

27.01.2002 20:23

URL #9

Уважаемый Leka!
Я секвенировал ПЦР-продукты длиной 700bp напрямую и сам, и отдавал на автомат (если хотите, могу дать наводку, делают хорошо и быстро, но 20$ проба). Сам делал вручную с Sequenase 2.0 Version Kit (Amersham), циклический сиквенс пока отрабатываю, как раз тоже для чтения напрямую. Читал и вперед и взад. Читается нормально. Правда, конечно ПЦР-продукты напрямую секвенировать плохо, могут быть разные гадкие моменты. При этом первые оснований 30-40 не читаются вообще, но в целом, за исключением того, что сиквенс будет грязноватый можно ПЦР-продукт и прочитать. Но лучше конечно клонировать (почему не хотите? мне надо было просто сделать это быстро).

AVS
Постоянный участник
UK - Russia

27.01.2002 21:30

URL #10

Присоединяюсь к Петру - без клонирования сиквенс ПЦР продукта намного грязнее. А метилированный цитозин или нет - это уже другая песня.

artemboudilov
Постоянный участник

28.01.2002 13:43

URL #11

Секвенировать можно и ПЦР-продукты (если праймеры разные).
Ничего страшного в этом нет.
В большинстве случаев сиквенс нормальный, однако бывают и малопонятные (с точки зрения точного диагноза, а значит и средств борьбы)исключения, когда фермент отказывается работать. С плазмидами такое тоже иногда бывает, но гораздо реже.
Причины же "грязных" сиквенсов с ПЦР-ных продуктов очевидны:
1. плохое качество очистки фрагмента (тут и остатки праймеров и остатки неспецифики и следы ингибиторов)
2. неудачный выбор праймеров (как ни странно, часто встречается ситуация, когда праймер способен отжигаться внутри секвенируемого фрагмента).
3. "неудобная" нуклеотидная последовательность секвенируемого фрагмента (высокий процент GC, палиндромы, повторы), но тут раз на раз не приходится и, кроме того, в этом случае клонирование ничего не изменит.
Вот.
Best regards, ARTEMBoudilov

Veshka
Постоянный участник
Москва

28.01.2002 17:24

URL #12

Не очень ясно про метилированные цитозины - что там можно понять непосредственно сиквенсом - или вы их жрёте, а потом секвенируете, но это не важно. В любом случАе чисто получается только если продукт одноцепочечный. А сделать это нехитро -берётся один из праймеров с фосфоротиоатами и Т7-я экзонуклеаза...

petr
Постоянный участник

28.01.2002 22:40

URL #13

А если ПЦР с одним праймером (уже на почищеном ПЦР-продукте)? Не проще ли?

Leka

28.01.2002 22:51

URL #14

Скорей всего дело в праймере, двухдневная канитель с оптимизацией меня в этом убедила.Кроме праймеров и очистки есть еще свои заморочки.
Для определения мет. цитозинов, я обрабатываю ДНК бисульфитом, потом ПЦР, и с него то я и хотела сделать сиквенс, а там как ни очищай все равно идут примеси. И возня с очисткой равна возне с клонированием, т.к. простая очистка: форез-колонка не помогает.
Так что буду клонировать.

, Представляете 20 пар это 20 плашек, а если их не 20......

KGB
Участник

29.01.2002 03:09

URL #15

Интересно, а для чего Вам знать о метилировании цитозинов. Поделитесь, если не очень большой секрет!!!

petr
Постоянный участник

29.01.2002 11:46

URL #16

Дорогая Leka! Я сталкивался с очень схожей проблемой: неспецифика в ПЦР, от которой избавляться было сложно, а тратить время на возню с оптимизацией не хотелось, да и некогда было (да и не верил я в то, что смогу быстро оптимизировать), да и задачи такой не стояло. Вполне устраивал последующий саузерн в жестких условиях. Но когда встал вопрос о сиквенсе того, что я ПЦР^ю, тут-то и начались проблемы, да и свары с шефом (он утверждал, что я плохо чищу, при том, что при той-же очистке другие фрагменты секвенировались хорошо). Словом пришлось покудесничать малость:-))). Таки свой ПЦР-продукт я получил, и просеквенировал.
Если хотите, могу рассказать как. Только Вам в этой работе нужен будет еще зонд. Пишите.

Leka

29.01.2002 16:47

URL #17

to KGB:
Как известно

...
можно сказать что это такой вид мутации- мет. цитозины, там где их исходно не должно быть.Т.е. метилирование в норме встречается по всему геному, но CpG островки в норме не метилированны, а в опухолевых образцах почти всегда.Чаще это промоторная область, тогда как в самом гене нет мутации.А снижение уровня экспрессии есть. Вот такая закономерность.Сейчас очень много работ на эту тему.Вам интересно?

Кис

29.01.2002 18:23

URL #18

Ну тогда это вообще становится интересным. Откуда в ПЦР продукте возмутся метилцитозины ? Да, он есть в исходной ДНК. Далее ставим ПЦР с холодными трифосфатами. Куда уходит метилирование ? Все-таки в клетке есть специальный механизм поддержания статуса метилирования. Тоже с клонированием. Если в колях и есть механизм метилирования ДНК - то его функционирование скорее всего отлично от эукариотического и не факт, что исходный вариант метилирования сохранится после роста плазмиды в бактерии.
Если говорить дальше - то есть специальные методы выявления метилирования конкретных CpG сайтов в геноме. Например, метил-чувствительная ПЦР.

Кис

29.01.2002 18:27

URL #19

Это продолжение предыдущего постинга.
Так что же Вы все-таки хотите делать, Leka ?
Если смотреть метилирование в опухоли - то никакого сиквенса здесь нет и близко. Вот любопытно - начинаем с техники сиквенса и выходим на проблемы общеметодологические.
Кстати, значительная часть CpG островков в норме метилирована.

Leka

29.01.2002 19:40

URL #20

После модификации: ПЦР с праймерами на область где нет CpG островков, получается где то в 400пар фрагментик,опять таки изменение Т на А, а вот после этого собственно сиквенс только для того чтобы посмотреть какие из существующих островков метилированны, какие нет и сколько это процентов по сравнению с нормой.Потому что все остальное дает только приблизительный ответ: да есть мет. или его нет.Конечно можно подобрать праймеры и на все CpG островки, но опять таки это сложнее чем просто сиквенс.
У вас есть возражения?

Leka

29.01.2002 19:41

URL #21

Да, я забыла написать что это собственно промоторная область.

artemboudilov
Постоянный участник

29.01.2002 19:52

URL #22

Уважаемый Кис!
А откуда следует, то что CpG островки в норме метилированы?
Может я отстал от жизни?
Насколько мне известно основной особенностью CpG-островков как раз и является их способность оставаться неметилированными при прохождении клеточного цикла.
Т.е., конечно, появление CpG-островков связано с развитием системы метилирования (напомню: метилирования цитозина по пятому атому углерода в динуклеотиде CG) и гипермутабельностью (!) метилцитозина. Ведь как известно, дезаминирование метилцитозина это случайный процесс, приводящий к образованию тимина, и следовательно, к появлению в этом месте неспаренных нуклеотидов T и G. Если система репарации глюкает - мутация фиксируется.
Гипермутабельность метилцитозина, в конечном итоге, приводит к элиминированию значительной части цитозинов и соответственно динуклеотидов CpG в геноме позвоночных. Например, в геноме Drosophila melanogaster, у которой система метилирования отсутствует, динуклеотид CpG распределен равномерно. Вот.
Т.е. именно способность CpG-островков избегать метилирования и позволила им сохранить себя в промоторных областях 5'-концов генов (не всех, конечно) и энхансерных областях 3'-концов (тоже не всех)....
Или я ошибаюсь?

Best regards, ARTEMBoudilov

Кис

29.01.2002 20:04

URL #23

Есть.
1. Ставим ПЦР с праймерами на фланки CpG островка. ДНК нативная ? Или обработанная cульфитом ?
2. На сколько процентов по сравнению с нормой. С чем будет идти сравнение - пика с пиком для разных букв в одной позиции ? Как будет идти нормирование на разную по факту величину сигнала для разных букв ?

KGB
Участник

29.01.2002 20:55

URL #24

В принципе я совершенно согласен с Артемом. CpG islands безусловно неметилированы в нормальной клетке. В раке- совсем другое дело. Но рак это уже аномалия. Единственное дополнение. В Drosophilе все же есть метилирование, которое важно в развитии. CpG островки метилированы на неактивной Х хромосоме мыши и человека, а также в случае импринтинга. Вот такое дополнение. Leka я вам написал на e-mail про MBD4.

Leka

29.01.2002 22:32

URL #25

To KGB: Да я прочитала, спасибо, с вашего позволения отвечу чуть позже. Кстати, я в стокгольме, но через 3 месяца буду в москве, это сильно меняет дело?
To Кис: Хорошо, давайте по другому.
Задачка: у вас есть сиквенс промотора конкретного гена, сиквенс GC rich, и там присутствуют CpG islands, несколько! например 10, и очень интересно, какие из них метилированны. поштучно. зачем- это уже другой вопрос. Ваши предложения?

artemboudilov
Постоянный участник

29.01.2002 23:45

URL #26

To Leka
Ах CpG, CpG.... Уж не EZab ли ваш стокгольмский шеф?

Кстати, действительно, не очень-то просто выцепить метилированные CpG. Тут Кис прав. Если брать ДНК из опухолевых клеток, в которых возможно метилирование промоторных областей потенциальных генов-супрессоров (наверняка речь о них), то просто ПЦР ничего не даст(я думаю Вы это знаете, но так на всякий случай...).
Можно предварительно деградировать ДНК рестриктазами, чувствительными к метилированию и затем амплифицировать нужный район. Если участок метилирован, рестриктаза его стороной обойдет и Вы на выходе после ПЦР получите красивую полоску. Но тут встает вопрос о недорезе.
Можно модифицировать цитозины, оставляя нетронутыми метилцитозины и использовать это, например, при выборе праймеров
и т.д.
Вот. Вообще это все в литературе описано давно, а конкретики я не знаю, т.к. вплотную такой проблемой никогда не занимался. Так, немного теоретически подкован...

Удачи,
ARTEMBoudilov
Best regards, ARTEMBoudilov

Leka

30.01.2002 00:28

URL #27

браво! именно он.
На самом деле все давно описано и исходно вопрос был про другое (конкретнее про мою лень)

И ответ я на него уже получила, так что, думаю, тема закрыта.
А вообще, мне кажется, что CpG это скорее дань моде, хит сезона...А хочу я заняться совсем другими вещами, а эту повинность, чем быстрее отработаю тем лучше.Из-за этого не хотела заниматься клонированием.
Спасибо всем за советы, и дискуссию,с вами приятно общаться.

Leka

30.01.2002 00:37

URL #28

Кстати, как тебе здесь понравилось?

KGB
Участник

30.01.2002 01:46

URL #29

Друзья мои! Мне очень обидно слышать слова типа "CpG это скорее дань моде, хит сезона...". Это совсем не так.
Что касается ПЦР после бисульфидной обработки. Обычно, конечно же люди клонируют ПЦР продукт и секвенируют сразу около 20-30 клонов и после этого мы получаем представление о степени метилирования CpG islandа.

Кис

30.01.2002 11:29

URL #30

В случае множественных СpG в ограниченной области на самом деле путь один - бисульфид. А далее - как у KGB, секвенировать после клонирования 20-30-40 клонов.
И два слова о метилировании в норме. Конкретный пример - ген FMR1 c его триплетными повторами. В норме часть этих повторов метилирована, при экспансии - гиперметилирование с блокированием экспрессии гена. Ситуация сложнее - погорячился, когда написал что большинство CpG в норме метилировано. Какая-то часть - важная для онтогенеза определенных типов клеток. И анализ CpG метилирования вряд ли только мода - все-таки это достаточно фундаментальный механизм регуляции экспрессии генома не только при раке, но и в норме.
Далее - ссылочка
Bird A.
DNA methylation patterns and epigenetic memory.
Genes Dev. 2002 Jan 1;16(1):6-21.
Обзор в свободном доступе.

Leka

30.01.2002 14:41

URL #31

Насчет: "хит сезона"

Например, можно посмотреть сколько публикаций за последние, ну скажем, 2 месяца в pubmede. И сравнить с другими публикациями по конкретному гену. Не интересовались?

KGB
Участник

30.01.2002 16:21

URL #32

Браво, Кис!
Действительно, в норме 80 процентов ЦфГ метилтрованы. Но ЦфГ островки действительно неметилированы. Исключения:
а) неактивная хромосома (кстати FMR1 и FMR2 лишь частные случаи)
б) контроль импринтинга H19/Igf2 к примеру
в) рибосомальный спейсер
г) junk DNA
А обзор очень метко подметил Кис. Кто заинтеоесован могу послать .pdf file

Кис

30.01.2002 17:07

URL #33

Ну если FMR1 - то там частичное метилирование не связано с активнойнеактивной Х хромосомой, у мужиков частично метилированы эти самые CGG повторы. И это вполне возможно как-то влияет на его экспрессию.
А далее интересный вопрос - много ли Вы, KGB, знаете работ по анализу метилирования CpG островков вне опухолевого контекста ? То есть корректного ответа на сей вопрос пока просто нет.
Leka, сравнение не корректно. Если вместо слова метилирование загнать скажем транскрипция - то статей тоже будет куча. Более, чем по каждому конкретному гену. Что естественно. Уж если так - то сравните конкретный ген=супрессор опухолей. И сколько там будет статей по анализу метилирования и разному всякому прочему.

KGB
Участник

30.01.2002 18:38

URL #34

Знаете, Кис, буквально три дня назад я обсуждал этот вопрос с Adrianom. Могу сказать Вам, что наиюолее интересный пример метилирования CpG islands вне опухолевого контекста- импринтинг. К примеру, уже упоминавшийся мною ЦфГ островок апстримнее Н19. Или ЦфГ островок р57 локуса. Все это весьма интересно и есть что обсудить. Может проявитесь? Буду рад с Вами обсудить актуальные проблемы метилирования. Особенно, если Вы в Москве.

30.01.2002 21:42

URL #35

Leka, если не трудно, объясните: какие нуклеотидные замены в ампликоне будут указывать на наличие метилирования (или как вообще его можно "вычислить" по сиквенсу ампликона после обработки бисульфитом)? Метилирование оснований в регуляции генной экспрессии - штука интересная, кто знает, может, тоже придется столкнуться?
А что до ПЦР - у нас в лаборатории вообще-то частенько секвенируют ампликоны впрямую. Я сам этим занимался, причем брал не nested-праймеры, как обычно делают, а те же, что и для амплификации. (Только температуру иногда приходится давать градуса на 2 повыше, чем при ПЦР.) Фрагменты были до 450 bp длиной, из M. tuberculosis - т.е. G+C ~65%. Правда, надо сказать, что праймеры удачно подобрались - на форезе даже с цифровой камерой шмера не было видно. Так что чистил я ампликоны не из геля, а прямо из ПЦР смеси, а не из геля - только проверял количество и чистоту предварительно. (Может, в этом дело? Тогда, может быть, хотя бы "поиграть" условиями (температура отжига, кол-во матрицы) и добиться чистоты с имеющимися праймерами?)
Пользовался китом fmol DNA Cycle Sequencing System (Promega) - соответственно, ручной циклический сиквенс (меченые праймеры, Р33). Ампликоны чистил иногда на Wizard PCR Preps (Promega), а иногда китом, приобретенным в НИИ вирусологии (NaJ + glassmilk). И читалось будь здоров, начиная где-то с 3го-5го нуклеотида от конца праймера. Без всяких затыков :-)

30.01.2002 21:43

URL #36

Leka

30.01.2002 23:44

URL #37

To Blot: а можете написать мне на e-mail, я думаю здесь это все рассказывать будет уже не интересно. Я опишу подробности.

moonlife447
Участник
London, UK

25.09.2022 12:22

URL #38

Ufa1688
Постоянный участник

27.09.2022 19:34

URL #39

Yet in the days ahead 1688.comit will be tempting to dismiss ufabet เข้า สู่ระบบMoscow’s broadened claims ufabet168cof sovereignty and บอลสเต็บsaber-rattling as the dying แฮนดิแคปthroes of an empire ลิงค์รับทรัพย์that forgot to look under the hood UFA1688before it went driving in a storm. สล็อตออนไลน์This is a win or lose moment ราคาบอลfor Putin, and he does not see ufa1688a future in which he loses.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.