molbiol.ru -> раствор для гомогенизации при выделении рнк тестикулярной ткани

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* раствор для гомогенизации при выделении рнк тестикулярной ткани -- выделение рнк --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Мар00242
Участник

23.02.2019 13:39

URL #1

При выделении рнк из ткани тестикул времени, указанного в инструкции к набору для выделения, не хватает для полной гомогенизации и для полного лизиса. Можно ли увеличить это время и не поспособствует ли это деградации рнк.
Какое оптимальное время для выделения рнк (чтобы получить пригодную для ревертирования в кднк рнк для последующей пцр) в плане по инструкции 1,5 часа проходит, если пару образцов. Если всю мою серию, то нужно за два подхода каждый этап центрифугирования выполнять, время до 4-6 часов увеличивается. Реально ли при таком количестве времени получить хорошую рнк или кидать образцы на -80 и потом по 6 штук скажем выделять. Сколько тогда на -80 можно хранить. РНК-латтеры специальные купить возможности нет.
Насколько важен меркаптоэтанол в качестве антирнказного агента. Вытяжки нет, образцов много.... Выделение на колонках.

Мар00242
Участник

23.02.2019 13:40

URL #2

*времени НАГРЕВАНИЯ, указанного в инструкции к набору для выделения

ship
Постоянный участник
Moscow

23.02.2019 19:48

URL #3

а слабо название набора написать? какое еще нагревание при выделении РНК???
1.5 часа это что за время?

ткани после забора храните в азоте или на -80С, для выделения РНК растриаете кусочек ткани в ступке в жидком азоте, заливаете лизис буфером, далее на колонку.

с меркаптоэтанолом можно и без вытяжки, главное не разлить.

Мар00242
Участник

24.02.2019 16:33

URL #4

рнк-втк, нагревание в растворе для гомогенизации 40 градусов, в лизирующем без нагревания 10мин при комнатной температуре
ткань как гель (тестикулярная крыс), все равно растирать?
а в лизирующем становится как раз плотным цельным куском

Мар00242
Участник

24.02.2019 16:37

URL #5

1,5 часа время, которое проходит от взятия пробы до постановки обратной транскрипции (или до заморозки образцов рнк)

Мар00242
Участник

24.02.2019 16:43

URL #6

без вытяжки мне потом плохо весь вечер. А нельзя меркаптоэтанол вообще не добавлять к гомогенизирующему раствору?

Инструкцию к набору прикрепить не получилось( говорят, спам(

Мар00242
Участник

24.02.2019 16:48

URL #7

в ступку прям к образцу залить жидкий азот что-ли? а потом ждать пока испарится. Кусочки ткани заморожены в эппендорфах и честно говоря то, что она гелеобразной структуры сбило с толку, если ее достать из эппендорфа в ступку, то она сразу размораживается и гелем становится..

ship
Постоянный участник
Moscow

24.02.2019 19:15

URL #8

(Мар00242 @ 24.02.2019 14:33)

а в лизирующем становится как раз плотным цельным куском

что явно указыает на то, что лизис ткани у вас будет неэффективным.

ship
Постоянный участник
Moscow

24.02.2019 19:18

URL #9

(Мар00242 @ 24.02.2019 14:37)

время до постановки ОТ вообще не играет никакой роли. важно взять ткани и БЫСТРО ее заморозить в азоте. ее хоть год можно хранить до выделения рнк.
далее важно не дать ткани оттаять до лизиса. выделенную также можно годами хранить на -80с и потом уже ставить ОТ.

в целом совет, скачайте, например, мануал к набору RNEasy qiagen и почитайте, там много полезной информации.

ship
Постоянный участник
Moscow

24.02.2019 19:19

URL #10

(Мар00242 @ 24.02.2019 14:43)

без вытяжки мне потом плохо весь вечер. А нельзя меркаптоэтанол вообще не добавлять к гомогенизирующему раствору?

можно и не добавлять.

ship
Постоянный участник
Moscow

24.02.2019 19:22

URL #11

(Мар00242 @ 24.02.2019 14:48)

бросаете замороженную ткань в жидкий азот в ступке, не давая ткани оттаять растираете ее в пыль пестиком, подливая азот по мере надобности, чтобы ничего не оттаяло и не грелось.
после того как растерли в пыль - заливаете все лизис буфером, объем берете исходя и веса ткани. буфер замерзнет, соответственно, далее ждете и по мере оттаявинаия буфера и растертой ткани, начинаетте пипеткой перемешивать буфер и ткань.

Мар00242
Участник

24.02.2019 19:51

URL #12

спасибо огромное, и еще 1 маленький вопрос, получается что раствор для гомогенизации в этом наборе лишний , можно этот этап с плавлением на 40 градусах в гомогенизирующем растворе пропустить

ship
Постоянный участник
Moscow

24.02.2019 20:57

URL #13

(Мар00242 @ 24.02.2019 17:51)

я не знаю что это за набор и какой там протокол, скините - будет понятно. но нагревание - это чтото странное.

Мар00242
Участник

24.02.2019 22:20

URL #14

инструкция

Файл/ы:

________________________________.pdf
размер: 147.5к
кол-во скачиваний: 138

ship
Постоянный участник
Moscow

25.02.2019 02:43

URL #15

ощущение, что школьники набор делали в качестве задания для олимпиады.

купите себе банку тризола у еврогена и выделяйте без всяких наборов, если у вас
нет возможности купить какие то вменяемые наборы для выделения рнк.

после фразы "Препараты РНК могут быть использованы для определения
уровня экспрессии белков в ткани с помощью различных методов, основанных на
детекции специфической РНК." дальше можно не читать. писал неуч и двоечник.

в конце тоже перл: РНК хранить при -18С .
выкиньте нафиг этот набор.

ship
Постоянный участник
Moscow

25.02.2019 02:45

URL #16

(Мар00242 @ 24.02.2019 17:51)

исходя из протокола - да, можно пропустить. но я только не понял, они что предлагают лизировать ткань в 1 мл, а потом отобрать 50 мкл для выделения РНК?

Мар00242
Участник

25.02.2019 07:45

URL #17

Да, разбавление такое большое получается... Не знаю,что получится после растирания ткани,но в том варианте как я пыталась делать- в лизирующем та часть ткани,которая этому самому лизису подвергается,и раствор лизирующий вместе с тканью становятся клейкой тягучей массой- и отобрать 50 мкл пипеткой очень сложно,так на глаз за пару-тройку подходов. И потом на каком-то этапе после добавления сорбента,кажется, тоже такая же история. Попробую растереть и сделать ккак в инструкции и еще один вариант с меньшим количеством лизирующего,потому что мне кажется при таком разведении я рнк при измерении концентрации просто не найду. Так я цепляла,пипеткой возле ткани вот то что описала- "клейстер" - около 70 мкг/мл чего-то и выделялось,в смысле в геле бэннд днк тоже был, но и рнковый шмер тоже,28,18s-еле-еле но просматривались. Что там после от происходит даже и не знаю,в пцрке ближе к 30 циклам выход. Пока как то так...

genseq
Постоянный участник

25.02.2019 08:14

URL #18

Насколько я понял, этот набор (РНК-ВТК) разработан и зарегистрирован в Беларуси (ИБХ НАН):
https://cyberleninka.ru/article/n/molekulya...lochnoy-zhelezy
А инструкцию заставили писать девушку, которой можно простить некоторые огрехи. Но для написания новой ("хорошей") инструкции желательно иметь "плохой" исходный вариант, который можно критиковать, исправлять и перелопачивать.
Понятно, что лучше всего выделять РНК фенольным методом (тризолом). Но здоровье дороже, и для поточных исследований этот вариант не проходит. Да и меркаптоэтанол, если не ошибаюсь, можно заменить нелетучим ацетилцистеином (АЦЦ).

Что касается этапа "плавления", то это просто неудачная формулировка. Нужно было написать "оттаивание". Ещё настораживает непривычный для простых юзеров термин "субнатант". Специалистам, конечно, виднее, но я бы его убрал.

Сообщение было отредактировано genseq - 25.02.2019 08:17

Мар00242
Участник

25.02.2019 09:48

URL #19

спасибо всем за комментарии. Я еще чуть-чуть помучаюсь с этим набором, а там видно будет

Мар00242
Участник

25.02.2019 22:00

URL #20

наибольший выход нк 140 и 90 мкг/ мл получился при заливке растертой в жидком азоте ткани лизирующим буфером 400 мкл, если все по протоколу делать (без меркаптоэтанола), то 10-20 мкг/мл. Но в любом случае содержится много ДНК.

Мар00242
Участник

25.02.2019 22:10

URL #21

гель

Картинки:

WP_20190225_003__1_.jpg — (345.73к)

watchesbiz
Постоянный участник

11.11.2021 17:03

URL #22

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.