Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Ledonala |
Подскажите, если кто знает! Делаем трансформацию HEK296 плазмидой pcDNA3.1, несущей ген ионного канала P2X, селекция на зеоцине, клетки растут, пытаемся зарегистрировать каналы, и оказывается, что они есть в одной клетке на 20. Что происходит? Ответьте, пожалуйста, кто имеет дело с трансформацией/трансфекцией, какие там могут быть загвоздки? Может ли оказаться, что во всех клетках, растущих на зеоцине плазмиды есть, но белок-рецептор каким-то образом блокируется, ингибируется или не встраивается в мембрану? |
Misha Участник |
Увеличивайте эффективность трансфекции, а для начала просто проверьте использовав все те же условия, только вместо вашей плазмиды возьмите плазмиду с GFP и просто подсчитайте кол-во трансфецированных клеток - это и будет приблизительно уровень трансфекции. Как чистите ДНК для трансфекции и чем трансфецируете? |
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
Уровень трансфекции сильно зависит от чистоты плазмиды. Перед трансфекцией проводят оптимизацию процесса(концентрация плазмиды, концентрация клеток, среда, наличие сыворотки, временной фактор и т.д.). Напишите подробно, что вы делаете, а так довольно тяжело давать советы. |
Chlorum Постоянный участник |
|
Ledonala |
Плазмиду чистим китом фирмы V-gene: Endotoxin-free Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit. Трансфецируем Промеговским TransFast™ Transfection Reagent. По протоколу, это катионный липид. Селекцию делаем через два дня после трансфекции, с антибиотиком стоит 10 дней. Я занимаюсь очисткой плазмиды, трансфекцию делает другой человек, я в трансфекции эукариот мало ориентируюсь, работала только с прокариотами. Поэтому, может быть задаю глупые вопросы, какие параметры еще указать, чтоб вы дали советы? Скажите, как делать оптимизацию? |
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
Основное правило при селекции это подбор оптимальной концентрации антибиотика в вашем случае зеоцина. То есть просто титруете антибиотик и ведете культуру в течение 2-3 недель и смотрите визуально размножаются у вас клетоки или растут. Ах да обязательно сменяйте среду с антибиотиком через каждые три дня. Определившись с концентрацией антибиотика начинаете трансфекцию. После 2 дней после трансфекции, желательно клетки просто снять и посадить в среду с уже подобранной концентрацией. Остальное дело техники. то что вы наблюдаете, скорее всего причина бурного роста не трансформированных клеток, после чего соответственно у вас и падает соотношение между трансфомированными и нетрансформированными. |
кимкидук IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
Ledonala |
<То есть просто титруете антибиотик и ведете культуру в течение 2-3 недель и смотрите визуально размножаются у вас клетоки или растут.> Как это размножаются или растут? Ведь ежели титровать в пределах какой-то, рекомендуемой к этому антибиотику, концентрации то вобщем они должны везде размножаться и рости, или нет? кимкидук: <Может стоит еще после трансфекции посмотреть на уровень мРНК, а то вдруг фишка в пострансляторных штуках?> Имеется в виду выделить мРНК и посмотреть наличие моего гена? |
gostya Постоянный участник |
2) eti kletki transfetsiruyutsya obychno horosho 3) pCDNA3.1 (Invitrogen) neset usto'chivost' k neomycin, a ne zeocin, zachem vy delaete selektsiyu na zeocine? 4) na sa'te Invitrogena polno metodik, v tom chisle kak provodit' selektsiyu kletok
|
ANK IP-штамп: frkm4fFVoZNpc гость |
|
кимкидук IP-штамп: frOi4YBLrDrwQ гость |
|
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
При определенной концентрации антибиотика вы даже визуально уже увидите прекращение роста клеток и они будут откреплятся. Вы выбираете ту концентрацию при которой клетки просто у вас не будут размножатся, ведь у них устойчиволсти к зеоцину. |
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
|
к IP-штамп: frQtbDwjgPMwo гость |
|
Ledonala |
Попробую сделать ртПЦР, спасибо. Baudelaire:<При определенной концентрации антибиотика вы даже визуально уже увидите прекращение роста клеток и они будут откреплятся. Вы выбираете ту концентрацию при которой клетки просто у вас не будут размножатся, ведь у них устойчиволсти к зеоцину.> Я правильно поняла, что мы берем нетрансфецированые клетки для этого? И они будут размножаться при низких концентрациях антибиотика? И нужно найти такую, при которой уже не будут? И трансфецированые клетки высаживать на нее? к:< Переходите на HeLa, например. 293 хороши в транзиентной трансфекции, но для стабильной это выбор неудачный, т.к. у них в принципе нестабильный геном (неравномерное распределение хромосом при митозе и проч. неприятности). Ген будет потерян при длительной селекции, что бы Вы с ним ни делали.> То есть трансфекция проходит, клетки размножаются, устойчивость к антибиотику есть у всех, а наш ген многие клетки теряют? Так? А если перейти на COS, это хорошие клетки? |
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
Я конечно в курсе HEK293 и соглашусь с коллегой что в основном они применяются для временной экспресии. Чаше всего используют для получения стабильной линии CHO К1, но не в коем случае не COS. |
Ledonala |
Простите еще раз за глупые вопросы, а почему КОСы не подходят? Где можно почитать про временную и стабильную трансфекцию? |
Guest IP-штамп: frlkSmZr37YvE гость |
и хек и кос и хела и ЧО, хела кстати анеуплоидные, наверняка это тоже не очень хорошо gostya |
Alolga |
|
АК IP-штамп: frw3GfipDY0Lk гость |
(Alolga @ 12.07.2005 13:00) Народ, кто работает с линией НЕК 293? Где можно в России приобрести эти клетки? Желательно легально, аттестованные, но если таких нет, то хоть какие -нибудь. Спасибо! (095)111-8579 Елена Александровна. Если срочно и в МГУ удобнее - можете зайти с флаконом ко мне в любое время (корпус Б, к.425) |
малыш без карлсона IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |