Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* о трансформации HEk296 pcdna3.1, вопрос(((
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Ledonala




 прочитанное сообщение 05.07.2005 09:24     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование
Вопрос
Коллеги!
Подскажите, если кто знает!
Делаем трансформацию HEK296 плазмидой pcDNA3.1, несущей ген ионного канала P2X, селекция на зеоцине, клетки растут, пытаемся зарегистрировать каналы, и оказывается, что они есть в одной клетке на 20. Что происходит?
Ответьте, пожалуйста, кто имеет дело с трансформацией/трансфекцией, какие там могут быть загвоздки?
Может ли оказаться, что во всех клетках, растущих на зеоцине плазмиды есть, но белок-рецептор каким-то образом блокируется, ингибируется или не встраивается в мембрану?
Участник оффлайн! Misha
Участник



 прочитанное сообщение 05.07.2005 10:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Эффективность трансфекции значит у вас такая 1 клетка на 20.
Увеличивайте эффективность трансфекции, а для начала просто проверьте использовав все те же условия, только вместо вашей плазмиды возьмите плазмиду с GFP и просто подсчитайте кол-во трансфецированных клеток - это и будет приблизительно уровень трансфекции.
Как чистите ДНК для трансфекции и чем трансфецируете?
Участник оффлайн! Baudelaire
Постоянный участник
где только можно



 прочитанное сообщение 05.07.2005 12:00     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Скажите пожалуйста а какой метод трансфекции применяете ?
Уровень трансфекции сильно зависит от чистоты плазмиды.
Перед трансфекцией проводят оптимизацию процесса(концентрация плазмиды, концентрация клеток, среда, наличие сыворотки, временной фактор и т.д.).
Напишите подробно, что вы делаете, а так довольно тяжело давать советы.
Участник оффлайн! Chlorum
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.07.2005 12:39     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

занимаюсь щас аналогичным. Было бы любопытно читануть как это делают профи.. smile.gif
Участник оффлайн! Ledonala




 прочитанное сообщение 05.07.2005 12:54     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Пробовали трансфецировать плазмидой с GFP, клетки не считали, но до селекции светилось 80 процентов клеток, может больше, но слабо. После селекции светило около 5 процентов, но хорошо.
Плазмиду чистим китом фирмы V-gene: Endotoxin-free Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit.
Трансфецируем Промеговским TransFast™ Transfection Reagent. По протоколу, это катионный липид. Селекцию делаем через два дня после трансфекции, с антибиотиком стоит 10 дней.
Я занимаюсь очисткой плазмиды, трансфекцию делает другой человек, я в трансфекции эукариот мало ориентируюсь, работала только с прокариотами. Поэтому, может быть задаю глупые вопросы, какие параметры еще указать, чтоб вы дали советы?
Скажите, как делать оптимизацию?
Участник оффлайн! Baudelaire
Постоянный участник
где только можно



 прочитанное сообщение 05.07.2005 13:49     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Ledonala: Я понял Вас. Проблема не в эффективности трансфекции, а в падении уровня трансформированных клеток во время селекции.
Основное правило при селекции это подбор оптимальной концентрации антибиотика в вашем случае зеоцина. То есть просто титруете антибиотик и ведете культуру в течение 2-3 недель и смотрите визуально размножаются у вас клетоки или растут. Ах да обязательно сменяйте среду с антибиотиком через каждые три дня.
Определившись с концентрацией антибиотика начинаете трансфекцию.
После 2 дней после трансфекции, желательно клетки просто снять и посадить в среду с уже подобранной концентрацией. Остальное дело техники.
то что вы наблюдаете, скорее всего причина бурного роста не трансформированных клеток, после чего соответственно у вас и падает соотношение между трансфомированными и нетрансформированными.
кимкидук
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 05.07.2005 13:58     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Может стоит еще после трансфекции посмотреть на уровень мРНК, а то вдруг фишка в пострансляторных штуках?
Участник оффлайн! Ledonala




 прочитанное сообщение 05.07.2005 16:55     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Baudelaire:  
<То есть просто титруете антибиотик и ведете культуру в течение 2-3 недель и смотрите визуально размножаются у вас клетоки или растут.>

Как это размножаются или растут? Ведь ежели титровать в пределах какой-то, рекомендуемой к этому антибиотику, концентрации то вобщем они должны везде размножаться и рости, или нет?

кимкидук:
<Может стоит еще после трансфекции посмотреть на уровень мРНК, а то вдруг фишка в пострансляторных штуках?>

Имеется в виду выделить мРНК и посмотреть наличие моего гена?
Участник оффлайн! gostya
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  05.07.2005 17:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

1) kletki vse-taki navernoe hek293
2) eti kletki transfetsiruyutsya obychno horosho
3) pCDNA3.1 (Invitrogen) neset usto'chivost' k neomycin, a ne zeocin, zachem vy delaete selektsiyu na zeocine?
4) na sa'te Invitrogena polno metodik, v tom chisle kak provodit' selektsiyu kletok

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): E.
ANK
IP-штамп: frkm4fFVoZNpc
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  05.07.2005 21:11     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Kstati, nikto ne v kyrse, esli delat' selekciyu klonov, to vrode kak govoryat, belki ystoychivosti peredauytsya sosednim kletkam cherez kontakti, a otsyuda i rost kletok bez plasmidki? Pravda li eto, ili slyhi??
кимкидук
IP-штамп: frOi4YBLrDrwQ
гость



 прочитанное сообщение 05.07.2005 23:50     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

да, ртПЦР на ваш ген, чтоб исключить вероятность неэкспресии плазмиды
Участник оффлайн! Baudelaire
Постоянный участник
где только можно



 прочитанное сообщение 06.07.2005 06:18     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Извините я опечатался. По поводу высказывания"То есть просто титруете антибиотик и ведете культуру в течение 2-3 недель и смотрите визуально размножаются у вас клетоки или растут". Я имел ввиду размножаются или нет.
При определенной концентрации антибиотика вы даже визуально уже увидите прекращение роста клеток и они будут откреплятся. Вы выбираете ту концентрацию при которой клетки просто у вас не будут размножатся, ведь у них устойчиволсти к зеоцину.
Участник оффлайн! Baudelaire
Постоянный участник
где только можно



 прочитанное сообщение 06.07.2005 06:37     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Кстати, согласен с gostya точно ли у вас маркер к зеоцину или нет.
к
IP-штамп: frQtbDwjgPMwo
гость



 прочитанное сообщение 06.07.2005 10:43     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Скорее всего Вам придется сменить линию. Переходите на HeLa, например. 293 хороши в транзиентной трансфекции, но для стабильной это выбор неудачный, т.к. у них в принципе нестабильный геном (неравномерное распределение хромосом при митозе и проч. неприятности). Ген будет потерян при длительной селекции, что бы Вы с ним ни делали.
Участник оффлайн! Ledonala




 прочитанное сообщение 06.07.2005 11:32     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Да, конечно же HEK293, а плазмида у нас с зеоциновой устойчивостью pcDNA3.1(Zeo+), извините, ошиблась.

Попробую сделать ртПЦР, спасибо.

Baudelaire:<При определенной концентрации антибиотика вы даже визуально уже увидите прекращение роста клеток и они будут откреплятся. Вы выбираете ту концентрацию при которой клетки просто у вас не будут размножатся, ведь у них устойчиволсти к зеоцину.>

Я правильно поняла, что мы берем нетрансфецированые клетки для этого? И они будут размножаться при низких концентрациях антибиотика? И нужно найти такую, при которой уже не будут? И трансфецированые клетки высаживать на нее?

к:< Переходите на HeLa, например. 293 хороши в транзиентной трансфекции, но для стабильной это выбор неудачный, т.к. у них в принципе нестабильный геном (неравномерное распределение хромосом при митозе и проч. неприятности). Ген будет потерян при длительной селекции, что бы Вы с ним ни делали.>

То есть трансфекция проходит, клетки размножаются, устойчивость к антибиотику есть у всех, а наш ген многие клетки теряют? Так?
А если перейти на COS, это хорошие клетки?
Участник оффлайн! Baudelaire
Постоянный участник
где только можно



 прочитанное сообщение 06.07.2005 13:04     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Ledonala: Вы меня правильно поняли.
Я конечно в курсе HEK293 и соглашусь с коллегой что в основном они применяются для временной экспресии. Чаше всего используют для получения стабильной линии CHO К1, но не в коем случае не COS.
Участник оффлайн! Ledonala




 прочитанное сообщение 06.07.2005 15:16     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Baudelaire:<Я конечно в курсе HEK293 и соглашусь с коллегой что в основном они применяются для временной экспресии. Чаше всего используют для получения стабильной линии CHO К1, но не в коем случае не COS.>

Простите еще раз за глупые вопросы, а почему КОСы не подходят?
Где можно почитать про временную и стабильную трансфекцию?
Guest
IP-штамп: frlkSmZr37YvE
гость



 прочитанное сообщение 06.07.2005 18:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

все используют для стабильной:
и хек и кос и хела и ЧО, хела кстати анеуплоидные, наверняка это тоже не очень хорошо

gostya
Участник оффлайн! Alolga




 прочитанное сообщение 12.07.2005 13:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Народ, кто работает с линией НЕК 293? Где можно в России приобрести эти клетки? Желательно легально, аттестованные, но если таких нет, то хоть какие -нибудь. Спасибо!
АК
IP-штамп: frw3GfipDY0Lk
гость



 прочитанное сообщение 12.07.2005 14:29     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(Alolga @ 12.07.2005 13:00)
Ссылка на исходное сообщение  Народ, кто работает с линией НЕК 293? Где можно в России приобрести эти клетки?  Желательно легально, аттестованные, но если таких нет, то хоть какие -нибудь. Спасибо!


(095)111-8579 Елена Александровна. Если срочно и в МГУ удобнее - можете зайти с флаконом ко мне в любое время (корпус Б, к.425)
малыш без карлсона
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 13.07.2005 09:32     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

А у кого нибудь CHO есть?
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.10.2022 19:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Повседневная практика показывает, что рамки и место обучения кадров обеспечивает широкому кругу (специалистов) участие в формировании направлений прогрессивного развития. https://www.wightproms.co.uk/profile/grualert/profile
Участник оффлайн! Ufa1688
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  03.10.2022 19:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Seaman Recruit Ryan ufa1688 Mays was acquitted on ราคาบอล charges of willful hazarding สล็อตออนไลน์ of a vessel and aggravated UFA1688 arson, the Navy said in a statement ลิงค์รับทรัพย์ following a court martial แฮนดิแคป in which a judge ruled บอลสเต็บ there was not enough evidence ufabet เข้า สู่ระบบ that Mays set the fire that destroyed ufa1688auto the USS Bonhomme Richard ufa1688 auto ทางเข้า more than two years ago.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 19:44
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft