Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
curious67 Постоянный участник |
|
klav Постоянный участник Москва |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Павел Постоянный участник Новосибирск |
А вообще, универсальных систем экспрессии нет. Но я чаще предпочитаю экспрессию под T7 промотором в штамммах (DE3). на втором месте - термоиндукция, после этого индукция под промоторами lac и комбинированными iptg-индуцируемыми. Растворимость белка -вопрос еще тот. Бывают просто необъяснимые вещи. Например, экспрессия EcoDam метилазы в чистом виде дает на выходе полностью растворимый продукт, с хорошим выходом. А добавка полигистидинового тэга полностью переводит продукт в тельца. Экспрессия, впрочем, также высока. |
curious67 Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
pQE для 6-His |
curious67 Постоянный участник |
|
klav Постоянный участник Москва |
(curious67 @ 25.04.2007 11:44) так промотор же собственный, может, и мешался к тому же. Ситуация нестандартная- а если бы просто засунуть гидролазу под пиюсишный lac? У нас был и такой тоже вариант. По разнице активностей +/- собственный промотор увидели, что Рлак и собственный объединяют усилия :-). 2 Павел : У нас вставка гидролазы в полилинкере, который внутри альфа пептида. (pUC19) Так что если стоп транскрипции на вставке сильный, при индукции ИПТГ альфа пептида быть не должно. |
Павел Постоянный участник Новосибирск |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
curious67 Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано curious67 - 28.04.2007 23:26 |
Esya Постоянный участник PA, USA |
и у меня никаких особых проблем с их выделением и секвенированием не наблюдалось, того что китом с мини выделяется достаточно для теста - есть или нет вставка, а потом - миди и вполне хватит на все нужды - да и количество лизируемых бактерий легко увеличить раза в 3, до pUC не дотянетесь, но выход нормальный |
curious67 Постоянный участник |
а куда они все девались? Были хорошие, а сейчас плохие пошли? Да нет, все понятно, конечно. А если серьезно, то по моему мнению, c pQE, скажем, работать поприятнее. |
Veshka Постоянный участник Москва |
Обычно я с ходу ставлю продукт концевым отрезанием в pET. Что касается альтернативных систем, то они бывают и ничего, но выход, выход.... |
Esya Постоянный участник PA, USA |
Если честно, я не китами ДНК (нуклеиновые кислоты) не выделяю из принципа (хотя умею по всякому и даже принцип действия знаю ), провайдед в лабе есть деньги. Вот в прошлой денег не было (вернее жадности было больше чем денег) - клянусь, на китах экономили, растворчики сами готовили, а только колонки покупали - в результате вечные проблемы с сиквенсом, повторы и деньги и время. Мне больше нравится знать, что если она не прорезалась, не про секвенировалась - то это не от меня, а в принципе и репу на эту тему не чесать. |
AVP Постоянный участник New Jersey |
(Veshka @ 29.04.2007 15:35) что PL и PR промоторы ... не дают желаемого выхода? (только давайте не будем рассматривать частные случаи)... |
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
AVP Постоянный участник New Jersey |
(Esya @ 29.04.2007 16:23) обычно они мало у кого есть в руках... |
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
AVP Постоянный участник New Jersey |
(Esya @ 29.04.2007 22:29) а помимо деревенских мест приходилось работать? ноги то у этого вопроса как раз и ростут из деревни... |
Veshka Постоянный участник Москва |
Сообщение было отредактировано Veshka - 30.04.2007 11:21
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
Guest IP-штамп: frFNQ1Yb4qZoo гость |
отсюда вопрос - и какого фига выход упал более чем в 5 раз? вот вам и разница между Т5 и Т7 промотором... |
Esya Постоянный участник PA, USA |
С белками нет универсальных рецептов и идеальных подходов, есть те, которые чаще всего работают. |
curious67 Постоянный участник |
это да. У меня самый положительный опыт с pQE, если страшно, что течет- есть серия pQE-80, там прекрасненько стоит lacI. T7 промтор вспоминаю как страшный сон- всегда все нерастворимое было, хотя и килограмм. И еще. "на четвертом для ленивых qiagen" дело не в лени, а в том, что есть белковики, есть молбиологи, не все любят возиться с белками, иным ДНК ближе |
Veshka Постоянный участник Москва |
Что касается pQE - действительно в некоторых случаях в моих руках она лучше Т7. Это те случаи, когда из-под Т7 мне не удавалось получить ни грамма. Было и обратное. Сообщение было отредактировано Veshka - 01.05.2007 02:11 |
Atropos Постоянный участник abroad |
(Guest @ 30.04.2007 18:17) Я недавно под одним и тем же T7 промотором поменял 6xHIS-содержащий таг из 22 АМК на другой из 24 АМК (как раз от pET28), и после индукции IPTG выход упал раз в 30-50 (хотя на чашках без IPTG в обоих случаях активный фермент нарабатывается в сходных и весьма заметных количествах). Тоже интересно, с чего это так вдруг. Сообщение было отредактировано Atropos - 01.05.2007 17:37 |
curious67 Постоянный участник |
(Atropos @ 01.05.2007 18:36) Я недавно под одним и тем же T7 промотором поменял 6xHIS-содержащий таг из 22 АМК на другой из 24 АМК (как раз от pET28), и после индукции IPTG выход упал раз в 30-50 (хотя на чашках без IPTG в обоих случаях активный фермент нарабатывается в сходных и весьма заметных количествах). Тоже интересно, с чего это так вдруг. это-то как раз и не удивительно- структура 5'-конца РНК изменилась, рибосомам неудобно из-за вторичной структуры, или время полужизни РНК упала |
Tom1 Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frHvyGooYAnV2 гость |
В общем, если нужно много белка и вполне устраивает очистка в денатурирующих условиях - pQE хороший вариант. PS Белки удается экспрессировать и в других, не M15[pREP4], хозяйских клетках - TOP10, JM107. |
enisseisk |
|
spectator |
|
Guest IP-штамп: frT94qSJLu4.M гость |
|
guest: Inalhe IP-штамп: frv8Mvfo5WhfE гость |
|
The problem Постоянный участник |
(spectator @ 07.06.2008 11:28) что скажете о PinPoint™ Xa Protein Purification System (Promega) ничего хорошего из Галилеи |
guest: Vika IP-штамп: fr3mxwI9lNtaw гость |
(curious67 @ 02.05.2007 18:08) да-да, совсем не течет, это правда. Из pBAD-TOPO запросто делается нормальный вектор под рестриктазы, и вперед Подскажите, пожалуйста, какие штаммы можно использовать для экспресии с pBAD вектора? |
Guest IP-штамп: frL2oriqkXcQg гость |
отличие рbad-а от т7 -в опероне. те то, что в случае t7 промотера включается лактозой (потому и течет) или ее неметаболизируемым аналогом иптг, в случае pbad-a включается арабинозой, которой в клетке нету, поэтому этот промотер и не течет. |
The problem Постоянный участник |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
|
frNFBHcL2JSwo Постоянный участник IP-штамп: frNFBHcL2JSwo |
|
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
|
petr Постоянный участник |
|
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
(petr @ 18.04.2009 18:56) Ну если клонирование в лабе поставлено нормально, почему бы не переставить промотор самим? оно ж совсем не сложно Эт верно :-) Я бы скорее наоборот сделал: выкинул бы из, скажем, pQE80 все, что между EcoRI и HindIII (RBS, гистидины и полилинкер) и засунул бы слепленный из двух отожженых олигов pET-полилинкер с предшествующим ему RBS-ом. Все уже продумано даже Но это же олиги надо заказывать и т.п.... |
Miss Marple Участник Москва vs. Европа |
|
angel eyes The bad Россия, Е-бург |
Вот счастье то .... Сообщение было отредактировано angel eyes (The bad) - 07.05.2009 20:48 |
Tuco Ramires Постоянный участник Rio Grande |
Сколько бандитов, охочих до могилки Арчи Стентона, шастает на форуме Воистину, имя им - легион |
RJ Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано RJ Dio - 08.05.2009 14:04 |
flip-flop |
|
guest: Miss Marple IP-штамп: frvGveEk9h7B. гость |
(angel eyes (The bad) @ 07.05.2009 20:47) Другим способом наш белочек не получить. Зато рецептор к нему мы с удовольсвием выделяем как секретируемый белок Sf9 Так что, не каждый Горох ещё такое делает. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |