Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
- 1.077 g/ml Ficoll-Hypaque (Pharmacia) или Histopaque-1077 (Sigma) - кровь (обычная, мобилизированная, пуповинная, костный мозг) в пробирках или контейнерах с антикоагулянтом (гепарин, ЭДТА, ACD) - PBS (phosphat-buffered saline) - любая культуральная среда с 5-10% сыворотки. - центрифужные пробирки (на 15- и/или 50 мл.) - центрифуга Методика 1. Разбавить кровь PBS 11-2, пуповинную кровь 12-4, костный мозг 12-5 2. В пустые 50-мл. центрифужные пробирки разлить Ficoll из расчёта 1 мл. 1 мл. крови (допустимо 21, 11.5), в зависимости от общего объёма разбавленной крови 3. Нежно и медленно(!) нанести развбавленную кровь на Ficoll, используя 25 мл. пипетку 4. Центрифугировать в режиме 1800 или 2000 rpm 30-40 мин. при комнатной температуре, brake off (медленный разгон и торможение) 5. Нежно собрать клетки интерфазы (слой между плазмой - вверху и собственно фиколлом и осадком - внизу) пипеткой в пробирку с небольшим объёмом среды, ресуспендировать 6. Заполнить пробирку PBS, центрифугировать 800 или 1000 rpm 8-10 мин. 7. Отмывка. Аспирировать надосадок, ресуспендировать осадок в среде или PBS, заполнить пробирку PBS, повторно центрифугировать 800 (1000) rpm 8-10 мин. 8. Аспирировать надосадок, осадок ресуспендировать в среде, подсчитать количество клеток. --------- ссылки Boyum A. Scand J Clin Lab Invest 1968 sup. 21 77-89 Boyum A. Lymphology 1977; 10 71-76 модификации |
Master@Work IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Потеря мононуклеаров даже при соблюдении всех правил достаточно велика. |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
градиентное центрифугирование остаётся самым простым и распространённым в мире методом для выделения мононуклеаров. Альтернативы хависят от целей - нужны ли тебе все мононуклеары или только гемопоэтик, или мононуклеары обогащённые гемопоэтиком и/или + Т-клеточная деплеция??? Всё зависит от целей не думаю, что только лизис без градиента лучше - мы делаем градиент, потом пре-плэтинг, потом лизис - получается очень красиво и без "мусора". если же тебе нужны только CD34+, lin(-) чистые или обогащённые ими мононуклеары, то можно без градиента - есть аппараты типа Isolex (Baxter) или специальные киты от Stem Cells Technologies - там работа с цельной кровью, без предварительного градиента в фиколле. |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
|
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
|
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
кто-нибудь замечал разницу по выходу (количеству клеток) MNC при фиколл-градиенте крови в 50-мл. и 15-мл. пробирках??? говорят в 50-мл. потери гораздо больше? может кто подсчитывал?? а то самому экспериментировать неохота... спасибо |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
|
Art IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Лучше только чача. :partyman: |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
(\"Art\") А по мне лучше полиглюкина ничего нет
Лучше только чача. :partyman: По количеству глюков - это да |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
(\"Art\") Лучше только чача. :partyman: Мимо носа носят чачу, мимо рота алычу! А у меня перерыв между курсом аминазина и сульфазина! Ага! Так вот о Шурике (который Боюм). Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта: гепарин или натрий 2-ЭДТА каждый дает свою собственную селективную потерю при выделении МНК и влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет. Механизм антикоагуляционный разный, это надо потом учитывать при отмывке собранных с интерфазы (чем мыть!) Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как красиво звучит, однако) раствора. В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу), если в протоку то забуференный PBSом физ. р-р, ну а если в культуру - то ничего лучше нет чем СБАОАНСИРОВАННЫЙ СОЛЕВОЙ РАСТВОР (например - Тироде ) без Са++ и Мg++. Разведенку наслаивают из расчета з мл фиколла-гипака + 9 мл разведенки. Это классика!!!! И она характерна для стандартных стеклянных химических пробирок на 20,0 мл. Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты. Кому надо, поищите! Наслаивают как, ничего не имею против, да действительно gentle/ Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо! Кто начинает лучше шприцом с длинной иглой и хорошо скользящим поршнем, а нет, так пастерочкой - по капельке, по капельке..., да по стеночке пробирки , по стеночке... Главное фиколл не проломить! Центрифугировать в бакете при ускорении 400 G, число оборотов по формуле или номограмме (???). Время центрифугирования - 20 -40 мин. Отсасываем 2/3 над интерфазой и плюем это в чашку чая ближайшего СНСа (подождите, пока он(а) отвернется)! Оставшуюся 1/3 над интерфазой собираем вместе с интерфазой, держа пастерку или иглу шприца НАД последней, круговыми движениями, по- стеночке пробирки.. Собранную клеточную суспензию отмывают опять же ССР без Са и Mg , а чтобы клеткам лучше и больше их было к отмывочному раствору добавьте 5% ЭТС (ээ-ээ- тут вот Varki на ночь глядя вспомнил), можно и пулированную сыворотку IVAВ группы от 8-12 доноров (инактивированную и проверенную на ВИЧ и Гепатит). Если мыть Са-содержащими растворами, имеется опасность, что гигантское ко-во тромбоцитов в собранной с интерфазы кл. суспензии выкинет фибрин - получим в пробирке желе. Да, при использовании гепарина это бывает редко, но его надо тогда использовать в больших кон-ях свыше 100 Ед на мл крови, а это опять для функции кл не есть хорошо. Выделили? Ну вот и молодцы! А что и сколько? Для того, что бы знать это надо в цельной крови , с учетом разведения объемом антикоагулянта подсчитать кол-во яс клеток/мл и Х на объем крови, потом сделать мазок (с усиками!), высушить, зафикировать, покрасить, промыть, высушить и под иммерсией просчитать формулу ( да! да! с моноцитами, эозинофилами, Пя ит.д.) Вот и получим абс. число МНК (среди которых CD34+ шастают), и число моноцитов и др кл. в нашем обрзце. ЭТО НАЗЫВАЕТСЯ "ВХОД"!!! А потом посчитаем что на "ВЫХОДЕ": кол-во МНК/мл х N мл полученной кл. суспензии. А затем из нее мазок надо сделать - тоненькой-тоненькой пастеркой кл. суспензия переносится в микроцентрифужные пробирки ок. 0,5 мл (на заказ стеклодувы делают где то за Соколом, напротив Строгино) туда добавлюят сыворотку КРС пипетируют и центрифугируют -сыворотку отсасывают почти всю ( ну и термины у меня!) а в остатке ресуспендируют клеточный осадок и капельку ( ну типа -Gutten Morgen) наносят на предм. стекло и делают мазок зашлиф. стеклышком. Сушат, фиксируют, красят, моют, сушат и под иммерсию - опять формулу. Вот когда все это сделаешь то и будешь знать, что такое эффективность выделения. что такое чистота выделения и какие сколько клеток выделил и что такое воспроизводимость метода. И тогда понимаешь, почему Alexander Bojum писал в эпоху хрущевской оттепели, что эффективность выделения МНК из периферической крови человек составляет всего около 55%, а чистота выделения колеблется от 60 до 75 %, нейтрофилов от 10-15-25%, а то и выше да еще и моноцитов до 7-8%. Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки. Art! Что касаемо, выделения клеток на полиглюкине, да было и такое, и на 30% сахарозе выделяли, и на чистом верографине с d=1.077 - по бедности, апофигизму и незнанию канонов! Но это неправильно. И еще о братьях наших меньших: автор метода зучал возможность его применения для выделения лимфоцитов у кроликов, и мышей. У кролика еще туда-сюда, но уже нужна другая плотность. А вот у мышей и других грызунов, это метод МНК не пошел и грамотными людьми не применялся. Но тогда еще никто не знал про дорманантные СК! Все пошел спать, хотя как тут заснеш из "лесная сказка" такой шум, такой шум - понаехали на черных бумерах вованы с черепно-мозговой травмой и до утра теперь не успокоятся. Solo P.S. Чуть не забыл, еще жинеспосбность на "выходе" посчитать желательно... |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
спасибо за подробный коммент! у меня ряд вопросов: Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта
а какая всё-таки разница? где потери больше как по общему к-ву так и по отдельным фракциям? кто-нибудь проводил отдельное исследование?? а как по поводу цитрата? а цитрат+декстран? каждый влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет.
абсолютно! а как? Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как красиво звучит, однако) раствора.
а корд блад? а bone marrow?? я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2) В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу)
PBS! Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты.
я думаю почти весь мир работает с кровью в 50-мл. фальконах, стандарты однако колеблются - 1 мл. фикола на 1-2 мл. разведённой крови. а вот на мой вопрос: зависимость количественного выхода MNC от диаметра пробирки (50 мл., 15 мл) никто не ответил конкретно ((( неужели личного опыта нет ни у кого? может у Solo? Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо!
только так и делаем, очень просто и удобно Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки.
а сколько их там? у вас есть личная статистика? могу сказать по cord blood - 0.1-0.9% CD34+ в MNC Но тогда еще никто не знал про дорманантные СК!
а вот это отдельная очень интересная тема, предлагаю обсудить в разделе "клеточная биология" |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
(\"Alex\") to Solo:
спасибо за подробный коммент! у меня ряд вопросов: Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта
а какая всё-таки разница? где потери больше как по общему к-ву так и по отдельным фракциям? кто-нибудь проводил отдельное исследование?? а как по поводу цитрата? а цитрат+декстран? каждый влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет.
абсолютно! а как? Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как красиво звучит, однако) раствора.
а корд блад? а bone marrow?? я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2) В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу)
PBS! Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты.
я думаю почти весь мир работает с кровью в 50-мл. фальконах, стандарты однако колеблются - 1 мл. фикола на 1-2 мл. разведённой крови. а вот на мой вопрос: зависимость количественного выхода MNC от диаметра пробирки (50 мл., 15 мл) никто не ответил конкретно ((( неужели личного опыта нет ни у кого? может у Solo? Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо!
только так и делаем, очень просто и удобно Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки.
а сколько их там? у вас есть личная статистика? могу сказать по cord blood - 0.1-0.9% CD34+ в MNC Но тогда еще никто не знал про дорманантные СК!
а вот это отдельная очень интересная тема, предлагаю обсудить в разделе "клеточная биология" Доброе утро Alex! сейчас бегу на завтрак, а потом на целый день на побережье ( 20 км до моря), так что подробно вечером , после вечерних коктейлей! Кстати в этоом дюбайском отеле отменная кухня, даже несмотря на пост есть что поесть! Особенно хороша кольраби в панировке под фисташковым соусом! Но тем не менее - цитрат НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ - ОН ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ ИЛИ ТРОМБОЦИТАРНЕОЙ МАСС ПРИДУМАН БЫЛ!!!!! А НЕ ДЛЯ ЖИВЧИКОВ МНК! Насчет расчтвора ТИРОДЕ, я пошутил - хотел вставить смайлик, но он куда то провалился - конечно Хэнкс. Об осталдьном вечером. Solo. P.S. Alex, а может не будем дорминантные обусждать, а ..? А то в Шереметьево вернусь, а там - " двое в синем, две в штатском, синий воронок.." |
Роман IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
|
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
(\"Роман\") ДормАнантные-дормИнантные СК, что это такое, с чем их едят??? - Кольраби в сухарях???
Ассалям-алейкум многоуважаемый Роиман! Во-первых я уже Вам отписался! А во-вторых - кольраби в панировочных сухарях, поджарена на оливковом масле и полита фисташковым соусом! Вот что это значит! А на тарелку рядом с ней кладется фиолетовый физалис и ломтик ярок-оранжевой спелой и сочной папайи, а не того Го...а, которое продается в в "Седьмом континете" в Белокаменной. А с чем едят дорманантные или дорминантьные, это надо спросить у отцов-основателей сайта. Мне с моимм куцым умишкой это до сих пор не ясно! В сое время я лечился в Смоленской областной, так у нас там чувак был в соседней палате - он открыл новый тип иммунокомпетентных клеток и назвал их "лохмацитами"! И начал изучать их функции..... Solo. |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
РОМАН! Прошу простить меня за опечатку! Сегодня их будет много! Solo/ |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Solo |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
у меня ряд вопросов: [quote]Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта[/quote] а какая всё-таки разница? где потери больше как по общему к-ву так и по отдельным фракциям? кто-нибудь проводил отдельное исследование?? а как по поводу цитрата? а цитрат+декстран? [quote]каждый влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет. [/quote] абсолютно! а как? 1.Гепарин. С ним много мороки. Во-первых, использовать официнальный нельзя. Гепарин в растворе очень быстро разрушается и все фармпроизводители во всем мире стабилизируют его добавляя производноые бензола. Бензольные кольца очень плохи для пролиферации и дифференцировки клеток. Самому готовить гепарин - мутота. Надо знать его удельную активность в ЕД/мг. Взвесь, раствори, простерилизуй через 0,22, а через 2-3 дня в мойку, так как активность уже та. Затем дозировка. Гепарин можно использовать в диапазоне 25-150 ЕД/мл крови. Соредняя доза около 50 ЕД/мл крови. Высокие доы 100-150 уже влияют ... Особый вопрос индивидуальная чувствительность образца крови от дааного донора. У одного донора свой статус сверт/противосвертывающей ситемы, у другого другой. А в результате при использовании гепарина высок риск образования микротромбов, в которых нужные нам клетки и мы их теряем! Это вопрос изучался и значим - отвечаю! Поэтому -то при заборе крови надо смочить стенки пробирки сод. в ней антикоагулянтом и при заборе аккуратно помещивать. Сразу после забора тщательно перемешать содержимое пробирки переворачивая ее 2-3- раза. БЬЕМСЯ ЗА ВЫХОД!!! 2. Альтернатив Na2-ЭДТА. Готовим 10- 20- кратный концентрат 2.7% раствора с рН=7,2 (нужен рН-метр, 0,1 М р-р NaOH для доведения рН - 2-3 раза каждый день, воронка фильтровальная бумага для предварительной фильтрации и стерилизуем на 0,22. Ставим в холодильник и до очередного трудового отпуска! Естествеено , что кровь надо при этом разводить р-ром Хенкса без Са++ и Мг++, и отмывать клетки 3 раза собранные с интерфазы этим же ра-ром. Я уже писал, что цитрат придуман был для забора крови - цель эритроциты, ну и тромбоциты. Для МНК не годится . ОДНОЗНАЧНО! С чем больше ВЫХОД, и где меньше потери, в т.ч. селективные.. Работы такие были, старые. западные, разница была, но не приципиальная. Оценивали по имеющимся тогда возможностям - маркеры Т- и Б-клеток - Е-РОК, ЕАС-РОК. Общее заключение, такое тогда было сделано: разница есть, но она не принципиальная - используй всегда один и тото же метод и ВАК тебе судья! Новые работы с МАБами - не следил. Разница в функциональной активности тоже старье -. что тогда могли сделать - пролиферацию, вроде была разница, но не принципиальная. Короче - ЭДТА технологичней и воспроизводимей. Вернусь в Москву спрошу еще у аксакалов! [quote]Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как красиво звучит, однако) раствора.[/quote] а корд блад? а bone marrow?? я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2) Разведение всегда было законо 1:3 для венозной крови, если только это не кровь б-х лимфопролиферативными заболеваниями. Да, разводили и 1:1 и 1:2, но это от бедности и жадности . Фиколл и сейчас не дешев: 500г около 550 долларов пол каталагу Сигмы +++++++... ( У нас на факультет в мужском туалете долго дацзыбао висела: "Мальчик на улице доллар нашел, с долларом эти в Березку пошел, долго папаша звонил в Комитет, доллар вернули, а мальика нет!"). Идеология разведения крови перед наслаиванием на интерфазу: 1. Уменьшить кунцентрацию клеточных эленментов, чтобы им было легче седементировать в плазме до фиколла (интерфазы). 2. УМЕНЬШИТЬ КОНЦЕНТРАЦИЮ МНК, ЧТОБЫ ОНИ НЕ ЗАБИВАЛИ ПОЛВЕХНОСТЬ ИНТЕРФАЗЫ И ДАВАЛИ ВОЗМОЖНОСТЬ ПОДОЙТИ К НЕЙ ДРУГИМ КЛЕТКАМ - ЭРИТРОЦИТАМ (КОТОРЫЕ НА ИНТЕРФАЗЕ ПОД ФЛИЯНИЕМ фИКОЛЛА 400, ОБРАЗУЮТ МОНЕТНЫЕ СТОЛБИКИ И ПРОВАЛИВАЮТСЯ ПОД ИНТЕРФАЗУ, НЕЙТРОФИЛАМ иИ ДРУГИМ ДИССЕИДЕНТАМ. 3. Уменьшить гидродинамитческое давление столба плазмы, за счет снижения её удельной плотности путем разведения, на интерфазу - 400 как-никак! В результат всего этого и повышается эффективность выделения МНК! [quote]В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу)[/quote] PBS! да пожалуйста! Но всетаки сбалансированный солевой раствор типа Хенкса или Эрла для культуральщика, это как чистите зубы утром и вечером! [quote]Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты. [/quote] я думаю почти весь мир работает с кровью в 50-мл. фальконах, стандарты однако колеблются - 1 мл. фикола на 1-2 мл. разведённой крови. а вот на мой вопрос: зависимость количественного выхода MNC от диаметра пробирки (50 мл., 15 мл) никто не ответил конкретно ((( неужели личного опыта нет ни у кого? может у Solo? В свое время, на семингаре фирмы Фармация (Швеция) этот вопрос обсуждалсся -выделение МНК из больших объемлв крови. Разницы нет никакой. Вопрос только в количестве фиоклл-гипака: стандартно 3 мл фиколл-гипака выдерживают столбик крови разведенной 1:3 высотой 9 мл. Следовательно для 50,0 мл пробирки надо взять 12 мл фиколл-гипака (верографина, уротраста ит.д.) и наслоить 36 мл разведенной 1:3 крови. Ну возьмите для спокойствия 14 мл фикоол-гипака. ЧТО КАСАЕТСЯ СРОКОВ ХРАНЕНИЯ КРОВИ ДО ВЫДЕЛЕНИЯ, НЕ БОЛЕЕ "-; ЧАСОВ при +4!!! ИСПОЛЬЗОВАТЬ КРОВЬ, КОТОРАЯ ПОЛУЧЕНА 8-12 , тем более 24 часа нтому назад. - это нонсенс. СНИЖАЕТСЯ ВЫХОД. ИДУТ СЕЛЕКТИВНЫЕ ПОТЕРИ. ИЗМЕНЯЕТСЯ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ. ВООБЩЕМ ЧУДЕС НЕ БЫВАЕТ - РАБОТАЙТЕ СО СВЕЖЕПОЛУЧЕННОЙ КРОВЬЮ ВСЕГДА! [quote]Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо! [/quote] только так и делаем, очень просто и удобно Мо-лод-цы!! Но для новеньких это сложно, пока научаться. Пусть помнят, когда кровь при наслаивание "пробивает границу" это не профессионально и приводит к снижению эфеективности выделения и селективным потерям! [quote]Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки.[/quote] а сколько их там? у вас есть личная статистика? могу сказать по cord blood - 0.1-0.9% CD34+ в MNC [quote] ... Личной статистики, сколько шампиньонов на кв.м. обочины Рублевского шоссе у меня нет!. Как Вы себе представляете, мои исследования в этом направлении, а...? Где бы я сейчас был? Что касается сод.С34+ в пуповинке, мне кажется что маловато, но ямогу ошибаться, надо посмотреть публикации гематологов. Все, кажется. Пойду выпью минералки или травяного чая! Всем удачи. Solo/ |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
[quote]Короче - ЭДТА технологичней и воспроизводимей[/quote] не зря же моя любимая компания BD выпустила Vacutainer (куча разных вакумных пробирок со всеми возможными антикоагулянтами - каждая для своей цели) разница - конечно! к сожалению мои знания по этому вопросу ничтожны. знаю, что например если нужны чистые красивые моноциты (шоб дендритные например из них сгенерить),гепарин никак не катит, тромбоциты прилипнут к моноцитам и п-ц! только ЭДТА разводить и мыть - [quote]PBS! да пожалуйста! Но всетаки сбалансированный солевой раствор типа Хенкса или Эрла для культуральщика, это как чистите зубы утром и вечером! [/quote] да наверное круче HBSS-CMF нет, согласен но если я в день трачу 1-2 литра PBS, то готовить HBSS просто заколебусь, а текнишн просто не поймёт... [quote]ИСПОЛЬЗОВАТЬ КРОВЬ, КОТОРАЯ ПОЛУЧЕНА 8-12 , тем более 24 часа нтому назад. - это нонсенс. СНИЖАЕТСЯ ВЫХОД. ИДУТ СЕЛЕКТИВНЫЕ ПОТЕРИ. ИЗМЕНЯЕТСЯ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ. [/quote] АБСАЛЮТНА! [quote]ЧТО КАСАЕТСЯ СРОКОВ ХРАНЕНИЯ КРОВИ ДО ВЫДЕЛЕНИЯ, НЕ БОЛЕЕ "-; ЧАСОВ при +4!!! [/quote] да, но иногда пролежит в госпитале сутки, а выбрасывать жалко, тогда - развожу побольше, но интерфаза всегда контаминирована эритроцитами, приходится добавлять лизис, после всего - содержание СD34+ практически не меняется.. но если интерфазы просто нет (часто бывает в суточной крови), то только выкидывать... [quote]Что касается сод.С34+ в пуповинке, мне кажется что маловато, но ямогу ошибаться, надо посмотреть публикации гематологов. [/quote] верьте мне, я с этим работаю, по литературе схожие данные... |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Верим, верим, верим...! Аlex! А что известно про удельную плавучую плотность ГСК несущих СD4+ вообще, и в частности, - если они из пунктат костного мозга взрослого человека получены, или из пер-кой крови путем мобилизации нейпогеном, или из пуповины новорожденного??? Кто нибудь гонял их через Percoll параллельно с индикаторами плотности и последующим фенотипированием. Помнится, когда впервые Максимов поделился со мною своими предположениями о едином гемопэтическом предшественнике, он сразу сказал, что они: "ОЧЕНЬ ТЯЖЕЛЫЕ КЛЕТКИ!" Solo. P.S.Те же вопросы и в отношении так.наз. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ. |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
конкретно их плавучую плотность не знаю, думаю да -тяжёлые, но не очень, ведь все они остаются в интерфазе на фиколле, по размерам - да крупняк, ядра много, вообще очень похожи на молодые лимфоциты. а из какого они источника - разницы думаю почти никакой, опубликовано около 10 хороших исследований, сравнивающих свойства HSC костного мозга, мобилизированной крови (это вообще одни и те же клетки) и пуповинной крови. Находят разницу только по силе экспрессии различных генов (если прогнать на 1000-2000 генов на microarray), так что я думаю принципиально глобальной разницы - никакой (CD34+ они и в Африке...), но это только по чистым HSC, а не про клеточный состав вообще... лично я фиколл с перколлом не сравнивал, но с перколлом работал для других целей, думаю люди посравнивали уже и решили - фиколлить! думаю что для выделения чистой фракции MNC пока ничего лучше нет (но может я не всё знаю...), не считая потерь клеток |
solo IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Спасибо коллега, что поняли о чем речь, действительно CD34+/ Но мой вопрос был в другом, а именно: Понятно, когда выделяют ГСК для целей трансплантации, здесь количество CD34+ является главным и единственным ( кроме ест. жизнеспособности) параметром оценки выделения клеток. Если не ошибаюсь. нужно 2-3 млн на кг веса реципиента. И бог с потерями. в т.ч. и селективными - набрал количество влил? получил клинический эффект и слава богу. Но если идет ресерч цели и задачи то другие, эдесь должнf быть полная ясность что теряшь, чего модифицируешь, чего амплифицируешь и т.д. и т.п. Потому что как не крути КМ ГСК, как впрочем и другие "СК", вещь весьма гетерогенная, как по своему естеству, так и по своим характеристикам на основе которых мы их дрючим (я это правильно по русски?, а то отвык за последнюю неделю). В том числе и по удельной плавучей плотности. В принципе это всем давно известно, но для подтверждения сошлюсь на последний док. дисер в Институте биологии развития. Есть женщины в русских селеньях! Так вот там прямо указывается что попул КМ ГСК состоит как минмум из двух субпопулов. Поэтому я и спросил про Перколл, но Ваш ответ меня ввел в некоторе сумление т.сказать, что Вы имеет в виду под термином "перколлить"? Как следует из Вашего ответа Вы или кто то пытались выделять МНК пуповинной крови на Перколле? Я правильно понял? Можно уточнить, как и для каких целей, что делали с клетками после выделенных на перколе. Прошу извинить меня за назойливость и приставучесть, но вопрос крайне интересный и важный с практической стороны для меня. А хорошо все таки дома! Вот у нас в загороднем отделении больницы им. Кащенко больных зовут на обед. Да, наш персонал дормантным не назовешь! Solo. |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Абсолютно! + T-cells depletion [quote]Но если идет ресерч цели и задачи то другие, эдесь должнf быть полная ясность что теряшь, чего модифицируешь, чего амплифицируешь и т.д. и т.п. Потому что как не крути КМ ГСК, как впрочем и другие "СК", вещь весьма гетерогенная, как по своему естеству, так и по своим характеристикам на основе которых мы их дрючим (я это правильно по русски?, а то отвык за последнюю неделю). В том числе и по удельной плавучей плотности.[/quote] Абсолютно! но я её не знаю, эту плавучую плотность тёмен [quote]Так вот там прямо указывается что попул КМ ГСК состоит как минмум из двух субпопулов. [/quote] как минимум больше, это вопрос активно изучаемый и controversial (СD34+, СВ34-, CD133, Lin (-), Thy-1+, дормантные = HSC в G-0 фазе, aденилатДГ-аза+, side population.... - всё это ГСК!!!!) так что же такое ГСК? давайте дисскутировать, но в разделе "клеточная биология" [quote]Как следует из Вашего ответа Вы или кто то пытались выделять МНК пуповинной крови на Перколле? Я правильно понял? [/quote] нет не разу не пробовал, а перколлил совершенно другие клетки и то так - побаловаться, с кровью на перколле не работал хотя интересно конечно сравнить, как впрочем ещё и много всего другого, кто-то наверняка уже сравнил (тот же Боюм), просто надо порыть pubmed и выбрали фиколл!!! |
Marzhan IP-штамп: fracVKlWZ9PJY гость |
|
Guest IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2) Разведение всегда было законо 1:3 для венозной крови, если только это не кровь б-х лимфопролиферативными заболеваниями. А для крови и костного мозга больных лимфопролиферативными заболеваниями? |
Katushka Участник |
|
Lynx.rufa |
(Marzhan @ 30.04.2009 12:52) Здравствуйте! Временной разрыв между нашими сообщениями, конечно, огромный, но не могли бы вы подсказать - в какой именно пропорции вы наслаивали кровь на фикол в пробирках на 50 мл? Примерно 11 мл фикола на 32 мл разбавленной крови (8 мл цельной венозной+24 мл сср Хэнкса)? Заранее спасибо за ответ. |
Annabel Участник Бостон, США |
Кровь к PBS 1:4, 10 ml фикола и 40 мл разведенной крови или меньше (сколько есть). |
Lynx.rufa |
(Annabel @ 02.12.2017 00:40) Я тоже обычно наслаиваю в 50 мл. Кровь к PBS 1:4, 10 ml фикола и 40 мл разведенной крови или меньше (сколько есть). Спасибо за совет! |
Blackberry |
Подскажите, пожалуйста, возможно у кого-то есть протокол покраски и подсчёта именно мононуклеарных клеток. В каком соотношении нужно добавлять трипановый синий, и можно ди применять для определения всего количества МКПК стандартные формули для рассчёта количества лейкоцитов после подсчёта в камере Горяева. Благодарю!) |
yousuf Постоянный участник |
|
yousuf Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |