Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Выделение мононуклеарных клеток крови в градиенте плотности
Компания Biocommerce - официальный дистрибьютер продукции компаний Miltenyi Biotec GmbH (Германия) и RanD S.r.l. (Италия).
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 16.09.2004 05:31     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Материалы
- 1.077 g/ml Ficoll-Hypaque (Pharmacia) или Histopaque-1077 (Sigma)
- кровь (обычная, мобилизированная, пуповинная, костный мозг) в пробирках или контейнерах с антикоагулянтом (гепарин, ЭДТА, ACD)
- PBS (phosphat-buffered saline)
- любая культуральная среда с 5-10% сыворотки.
- центрифужные пробирки (на 15- и/или 50 мл.)
- центрифуга

Методика
1. Разбавить кровь PBS 11-2, пуповинную кровь 12-4, костный мозг 12-5
2. В пустые 50-мл. центрифужные пробирки разлить Ficoll из расчёта 1 мл. 1 мл. крови (допустимо 21, 11.5), в зависимости от общего объёма разбавленной крови
3. Нежно и медленно(!) нанести развбавленную кровь на Ficoll, используя 25 мл. пипетку
4. Центрифугировать в режиме 1800 или 2000 rpm 30-40 мин. при комнатной температуре, brake off (медленный разгон и торможение)
5. Нежно собрать клетки интерфазы (слой между плазмой - вверху и собственно фиколлом и осадком - внизу) пипеткой в пробирку с небольшим объёмом среды, ресуспендировать
6. Заполнить пробирку PBS, центрифугировать 800 или 1000 rpm 8-10 мин.
7. Отмывка. Аспирировать надосадок, ресуспендировать осадок в среде или PBS, заполнить пробирку PBS, повторно центрифугировать 800 (1000) rpm 8-10 мин.
8. Аспирировать надосадок, осадок ресуспендировать в среде, подсчитать количество клеток.


---------
ссылки
Boyum A. Scand J Clin Lab Invest 1968 sup. 21 77-89
Boyum A. Lymphology 1977; 10 71-76
модификации
Master@Work
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 26.09.2004 15:34     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Alex, считаешь ли ты это на самом деле оправданным?
Потеря мононуклеаров даже при соблюдении всех правил достаточно велика.
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 27.09.2004 03:51     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

да, безусловно потери большие, но от этого никуда.
градиентное центрифугирование остаётся самым простым и распространённым в мире методом для выделения мононуклеаров.
Альтернативы хависят от целей - нужны ли тебе все мононуклеары или только гемопоэтик, или мононуклеары обогащённые гемопоэтиком и/или + Т-клеточная деплеция??? Всё зависит от целей
не думаю, что только лизис без градиента лучше - мы делаем градиент, потом пре-плэтинг, потом лизис - получается очень красиво и без "мусора".
если же тебе нужны только CD34+, lin(-) чистые или обогащённые ими мононуклеары, то можно без градиента - есть аппараты типа Isolex (Baxter) или специальные киты от Stem Cells Technologies - там работа с цельной кровью, без предварительного градиента в фиколле.
picarus
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 27.09.2004 20:19     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

вообще, градиент стоит применять при исходно большом количестве материала. однозначно да - для человеческого материала. для крыс и мышей - вопрос спорный.
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 28.09.2004 06:08     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

да, конечно речь идёт только об объёмах крови больше 10 мл., поэтому на лаб. животных можно ограничиваться лизисом, т.к. если вы будете крутить маленький объём крови, то в интерфазе ничего не насобираете.
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.02.2005 04:11     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

вопрос к работающим руками:
кто-нибудь замечал разницу по выходу (количеству клеток) MNC при фиколл-градиенте крови в 50-мл. и 15-мл. пробирках???
говорят в 50-мл. потери гораздо больше?
может кто подсчитывал?? а то самому экспериментировать неохота...

спасибо
picarus
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.02.2005 12:32     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Мне кажется, что чем больше объем фиколла в пробирке, тем больше потери, т.к. часть клеток "застревает" в нем или "проваливается" в него. Но это умозрительно, я сам не работал много с фиколлом.
Art
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.02.2005 13:11     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

А по мне лучше полиглюкина ничего нет lol.gif
Лучше только чача. :partyman:
picarus
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.02.2005 14:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(\"Art\")
А по мне лучше полиглюкина ничего нет  lol.gif 
Лучше только чача. :partyman:

По количеству глюков - это да lol.gif
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 23.03.2005 01:29     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(\"Art\")
lol.gif 
Лучше только чача. :partyman:


Мимо носа носят чачу, мимо рота алычу!

А у меня перерыв между курсом аминазина и сульфазина! Ага!

Так вот о Шурике (который Боюм).

Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта: гепарин или натрий 2-ЭДТА каждый дает свою собственную селективную потерю при выделении МНК и влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет. Механизм антикоагуляционный разный, это надо потом учитывать при отмывке собранных с интерфазы (чем мыть!)
Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как красиво звучит, однако) раствора. В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу), если в протоку то забуференный PBSом физ. р-р, ну а если в культуру - то ничего лучше нет чем СБАОАНСИРОВАННЫЙ СОЛЕВОЙ РАСТВОР (например - Тироде ) без Са++ и Мg++.

Разведенку наслаивают из расчета з мл фиколла-гипака + 9 мл разведенки. Это классика!!!! И она характерна для стандартных стеклянных химических пробирок на 20,0 мл. Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты. Кому надо, поищите!

Наслаивают как, ничего не имею против, да действительно gentle/
Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо! Кто начинает лучше шприцом с длинной иглой и хорошо скользящим поршнем, а нет, так пастерочкой - по капельке, по капельке..., да по стеночке пробирки , по стеночке... Главное фиколл не проломить!

Центрифугировать в бакете при ускорении 400 G, число оборотов по формуле или номограмме (???). Время центрифугирования - 20 -40 мин.

Отсасываем 2/3 над интерфазой и плюем это в чашку чая ближайшего СНСа (подождите, пока он(а) отвернется)!

Оставшуюся 1/3 над интерфазой собираем вместе с интерфазой, держа пастерку или иглу шприца НАД последней, круговыми движениями, по- стеночке пробирки..

Собранную клеточную суспензию отмывают опять же ССР без Са и Mg , а чтобы клеткам лучше и больше их было к отмывочному раствору добавьте 5% ЭТС (ээ-ээ- тут вот Varki на ночь глядя вспомнил), можно и пулированную сыворотку IVAВ группы от 8-12 доноров (инактивированную и проверенную на ВИЧ и Гепатит).

Если мыть Са-содержащими растворами, имеется опасность, что гигантское ко-во тромбоцитов в собранной с интерфазы кл. суспензии выкинет фибрин - получим в пробирке желе.

Да, при использовании гепарина это бывает редко, но его надо тогда использовать в больших кон-ях свыше 100 Ед на мл крови, а это опять для функции кл не есть хорошо.

Выделили? Ну вот и молодцы!

А что и сколько?

Для того, что бы знать это надо в цельной крови , с учетом разведения объемом антикоагулянта подсчитать кол-во яс клеток/мл и Х на объем крови, потом сделать мазок (с усиками!), высушить, зафикировать, покрасить, промыть, высушить и под иммерсией просчитать формулу ( да! да! с моноцитами, эозинофилами, Пя ит.д.)

Вот и получим абс. число МНК (среди которых CD34+ шастают), и число моноцитов и др кл. в нашем обрзце. ЭТО НАЗЫВАЕТСЯ "ВХОД"!!!

А потом посчитаем что на "ВЫХОДЕ": кол-во МНК/мл х N мл полученной кл. суспензии. А затем из нее мазок надо сделать - тоненькой-тоненькой пастеркой кл. суспензия переносится в микроцентрифужные пробирки ок. 0,5 мл (на заказ стеклодувы делают где то за Соколом, напротив Строгино) туда добавлюят сыворотку КРС пипетируют и центрифугируют -сыворотку отсасывают почти всю ( ну и термины у меня!) а в остатке ресуспендируют клеточный осадок и капельку ( ну типа -Gutten Morgen) наносят на предм. стекло и делают мазок зашлиф. стеклышком. Сушат, фиксируют, красят, моют, сушат и под иммерсию - опять формулу.

Вот когда все это сделаешь то и будешь знать, что такое эффективность выделения. что такое чистота выделения и какие сколько клеток выделил и что такое воспроизводимость метода.

И тогда понимаешь, почему Alexander Bojum писал в эпоху хрущевской оттепели, что эффективность выделения МНК из периферической крови человек составляет всего около 55%, а чистота выделения колеблется от 60 до 75 %, нейтрофилов от 10-15-25%, а то и выше да еще и моноцитов до 7-8%.

Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки.

Art! Что касаемо, выделения клеток на полиглюкине, да было и такое, и на 30% сахарозе выделяли, и на чистом верографине с d=1.077 - по бедности, апофигизму и незнанию канонов! Но это неправильно.

И еще о братьях наших меньших: автор метода зучал возможность его применения для выделения лимфоцитов у кроликов, и мышей.
У кролика еще туда-сюда, но уже нужна другая плотность. А вот у мышей и других грызунов, это метод МНК не пошел и грамотными людьми не применялся. Но тогда еще никто не знал про дорманантные СК!

Все пошел спать, хотя как тут заснеш из "лесная сказка" такой шум, такой шум - понаехали на черных бумерах вованы с черепно-мозговой травмой и до утра теперь не успокоятся.

Solo

P.S. Чуть не забыл, еще жинеспосбность на "выходе" посчитать желательно...
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2005 04:29     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

to Solo:
спасибо за подробный коммент!
у меня ряд вопросов:
Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта

а какая всё-таки разница? где потери больше как по общему к-ву так и по отдельным фракциям? кто-нибудь проводил отдельное исследование??
а как по поводу цитрата? а цитрат+декстран?
каждый влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет.

абсолютно!
а как?
Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как  красиво звучит, однако) раствора.

а корд блад? а bone marrow??
я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2)
В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу)

PBS!
Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты.

я думаю почти весь мир работает с кровью в 50-мл. фальконах, стандарты однако колеблются - 1 мл. фикола на 1-2 мл. разведённой крови.
а вот на мой вопрос: зависимость количественного выхода MNC от диаметра пробирки (50 мл., 15 мл) никто не ответил конкретно frown.gif(((
неужели личного опыта нет ни у кого? может у Solo?
Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо!

только так и делаем, очень просто и удобно
Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки.

а сколько их там? у вас есть личная статистика?
могу сказать по cord blood - 0.1-0.9% CD34+ в MNC
Но тогда еще никто не знал про дорманантные СК!

а вот это отдельная очень интересная тема,
предлагаю обсудить в разделе "клеточная биология"
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2005 08:34     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(\"Alex\")
to Solo:
спасибо за подробный коммент!
у меня ряд вопросов:
Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта

а какая всё-таки разница? где потери больше как по общему к-ву так и по отдельным фракциям? кто-нибудь проводил отдельное исследование??
а как по поводу цитрата? а цитрат+декстран?
каждый влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет.

абсолютно!
а как?
Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как  красиво звучит, однако) раствора.

а корд блад? а bone marrow??
я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2)
В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу)

PBS!
Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты.

я думаю почти весь мир работает с кровью в 50-мл. фальконах, стандарты однако колеблются - 1 мл. фикола на 1-2 мл. разведённой крови.
а вот на мой вопрос: зависимость количественного выхода MNC от диаметра пробирки (50 мл., 15 мл) никто не ответил конкретно frown.gif(((
неужели личного опыта нет ни у кого? может у Solo?
Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо!

только так и делаем, очень просто и удобно
Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки.

а сколько их там? у вас есть личная статистика?
могу сказать по cord blood - 0.1-0.9% CD34+ в MNC
Но тогда еще никто не знал про дорманантные СК!

а вот это отдельная очень интересная тема,
предлагаю обсудить в разделе "клеточная биология"


Доброе утро Alex!

сейчас бегу на завтрак, а потом на целый день на побережье ( 20 км до моря), так что подробно вечером , после вечерних коктейлей!

Кстати в этоом дюбайском отеле отменная кухня, даже несмотря на пост есть что поесть! Особенно хороша кольраби в панировке под фисташковым соусом!

Но тем не менее - цитрат НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ - ОН ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ ИЛИ ТРОМБОЦИТАРНЕОЙ МАСС ПРИДУМАН БЫЛ!!!!!
А НЕ ДЛЯ ЖИВЧИКОВ МНК!

Насчет расчтвора ТИРОДЕ, я пошутил - хотел вставить смайлик, но он куда то провалился - конечно Хэнкс.

Об осталдьном вечером.

Solo.

P.S. Alex, а может не будем дорминантные обусждать, а ..? А то в Шереметьево вернусь, а там - " двое в синем, две в штатском, синий воронок.."
Роман
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2005 21:55     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

ДормАнантные-дормИнантные СК, что это такое, с чем их едят??? - Кольраби в сухарях???
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2005 00:23     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(\"Роман\")
ДормАнантные-дормИнантные СК, что это такое, с чем их едят??? - Кольраби в сухарях???


Ассалям-алейкум многоуважаемый Роиман!
Во-первых я уже Вам отписался!
А во-вторых - кольраби в панировочных сухарях, поджарена на оливковом масле и полита фисташковым соусом! Вот что это значит! А на тарелку рядом с ней кладется фиолетовый физалис и ломтик ярок-оранжевой спелой и сочной папайи, а не того Го...а, которое продается в в "Седьмом континете" в Белокаменной.

А с чем едят дорманантные или дорминантьные, это надо спросить у отцов-основателей сайта. Мне с моимм куцым умишкой это до сих пор не ясно!

В сое время я лечился в Смоленской областной, так у нас там чувак был в соседней палате - он открыл новый тип иммунокомпетентных клеток и назвал их "лохмацитами"! И начал изучать их функции.....

Solo.
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2005 00:26     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

[quote="solo"][quote="Роман"][/quote]

РОМАН! Прошу простить меня за опечатку! Сегодня их будет много!


Solo/
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2005 00:35     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Ustas (pardon, Solo) Alex'u: Centr ochchen interesuetsjay dormantnymi Stem Cells! Privlekite Pastor, Arta i Master@Work dlya polucheniya svegeyi i dostovernoyi informacii. Privet s rodiny, u nas taet sneg i is krana idet gryaznaya i vonuchaya voda!

Solo
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2005 01:48     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

[quote="Alex"]to Solo:
у меня ряд вопросов:
[quote]Если берете кровь, думайте, что брать в качестве антикоагулянта[/quote]
а какая всё-таки разница? где потери больше как по общему к-ву так и по отдельным фракциям? кто-нибудь проводил отдельное исследование??
а как по поводу цитрата? а цитрат+декстран?
[quote]каждый влияет каждый по своему на функциональную активоность выделенных клеток, - не сильно, но влияет. [/quote]
абсолютно!
а как?

1.Гепарин. С ним много мороки. Во-первых, использовать официнальный нельзя. Гепарин в растворе очень быстро разрушается и все фармпроизводители во всем мире стабилизируют его добавляя производноые бензола. Бензольные кольца очень плохи для пролиферации и дифференцировки клеток.

Самому готовить гепарин - мутота. Надо знать его удельную активность в ЕД/мг. Взвесь, раствори, простерилизуй через 0,22, а через 2-3 дня в мойку, так как активность уже та.

Затем дозировка. Гепарин можно использовать в диапазоне 25-150 ЕД/мл крови. Соредняя доза около 50 ЕД/мл крови. Высокие доы 100-150 уже влияют ...

Особый вопрос индивидуальная чувствительность образца крови от дааного донора. У одного донора свой статус сверт/противосвертывающей ситемы, у другого другой. А в результате при использовании гепарина высок риск образования микротромбов, в которых нужные нам клетки и мы их теряем! Это вопрос изучался и значим - отвечаю!
Поэтому -то при заборе крови надо смочить стенки пробирки сод. в ней антикоагулянтом и при заборе аккуратно помещивать. Сразу после забора тщательно перемешать содержимое пробирки переворачивая ее 2-3- раза. БЬЕМСЯ ЗА ВЫХОД!!!

2. Альтернатив Na2-ЭДТА. Готовим 10- 20- кратный концентрат 2.7% раствора с рН=7,2 (нужен рН-метр, 0,1 М р-р NaOH для доведения рН - 2-3 раза каждый день, воронка фильтровальная бумага для предварительной фильтрации и стерилизуем на 0,22.
Ставим в холодильник и до очередного трудового отпуска!

Естествеено , что кровь надо при этом разводить р-ром Хенкса без Са++ и Мг++, и отмывать клетки 3 раза собранные с интерфазы этим же ра-ром.

Я уже писал, что цитрат придуман был для забора крови - цель эритроциты, ну и тромбоциты. Для МНК не годится . ОДНОЗНАЧНО!

С чем больше ВЫХОД, и где меньше потери, в т.ч. селективные..

Работы такие были, старые. западные, разница была, но не приципиальная. Оценивали по имеющимся тогда возможностям - маркеры Т- и Б-клеток - Е-РОК, ЕАС-РОК. Общее заключение, такое тогда было сделано: разница есть, но она не принципиальная - используй всегда один и тото же метод и ВАК тебе судья!

Новые работы с МАБами - не следил.

Разница в функциональной активности тоже старье -. что тогда могли сделать - пролиферацию, вроде была разница, но не принципиальная.

Короче - ЭДТА технологичней и воспроизводимей. Вернусь в Москву спрошу еще у аксакалов!

[quote]Во-вторых, кровь перед наслаиванием на фиколлушку разводят в соотношении 1:3 - 1 часть крови + 2 части разводящего ( как красиво звучит, однако) раствора.[/quote]
а корд блад? а bone marrow??
я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2)

Разведение всегда было законо 1:3 для венозной крови, если только это не кровь б-х лимфопролиферативными заболеваниями.

Да, разводили и 1:1 и 1:2, но это от бедности и жадности . Фиколл и сейчас не дешев: 500г около 550 долларов пол каталагу Сигмы +++++++... ( У нас на факультет в мужском туалете долго дацзыбао висела: "Мальчик на улице доллар нашел, с долларом эти в Березку пошел, долго папаша звонил в Комитет, доллар вернули, а мальика нет!").

Идеология разведения крови перед наслаиванием на интерфазу:
1. Уменьшить кунцентрацию клеточных эленментов, чтобы им было легче седементировать в плазме до фиколла (интерфазы).
2. УМЕНЬШИТЬ КОНЦЕНТРАЦИЮ МНК, ЧТОБЫ ОНИ НЕ ЗАБИВАЛИ ПОЛВЕХНОСТЬ ИНТЕРФАЗЫ И ДАВАЛИ ВОЗМОЖНОСТЬ ПОДОЙТИ К НЕЙ ДРУГИМ КЛЕТКАМ - ЭРИТРОЦИТАМ (КОТОРЫЕ НА ИНТЕРФАЗЕ ПОД ФЛИЯНИЕМ фИКОЛЛА 400, ОБРАЗУЮТ МОНЕТНЫЕ СТОЛБИКИ И ПРОВАЛИВАЮТСЯ ПОД ИНТЕРФАЗУ, НЕЙТРОФИЛАМ иИ ДРУГИМ ДИССЕИДЕНТАМ.
3. Уменьшить гидродинамитческое давление столба плазмы, за счет снижения её удельной плотности путем разведения, на интерфазу - 400 как-никак!

В результат всего этого и повышается эффективность выделения МНК!

[quote]В качестве разводящего можно использовать физ-р (если потом клетки в раковину или в соседнюю лабу)[/quote]
PBS!

да пожалуйста! Но всетаки сбалансированный солевой раствор типа Хенкса или Эрла для культуральщика, это как чистите зубы утром и вечером!

[quote]Для 50 мл пластиковых с коническим дном, давным давно были отработан свои стандарты. [/quote]
я думаю почти весь мир работает с кровью в 50-мл. фальконах, стандарты однако колеблются - 1 мл. фикола на 1-2 мл. разведённой крови.
а вот на мой вопрос: зависимость количественного выхода MNC от диаметра пробирки (50 мл., 15 мл) никто не ответил конкретно frown.gif(((
неужели личного опыта нет ни у кого? может у Solo?

В свое время, на семингаре фирмы Фармация (Швеция) этот вопрос обсуждалсся -выделение МНК из больших объемлв крови. Разницы нет никакой. Вопрос только в количестве фиоклл-гипака: стандартно 3 мл фиколл-гипака выдерживают столбик крови разведенной 1:3 высотой 9 мл. Следовательно для 50,0 мл пробирки надо взять 12 мл фиколл-гипака (верографина, уротраста ит.д.) и наслоить 36 мл разведенной 1:3 крови. Ну возьмите для спокойствия 14 мл фикоол-гипака.

ЧТО КАСАЕТСЯ СРОКОВ ХРАНЕНИЯ КРОВИ ДО ВЫДЕЛЕНИЯ,
НЕ БОЛЕЕ "-; ЧАСОВ при +4!!!
ИСПОЛЬЗОВАТЬ КРОВЬ, КОТОРАЯ ПОЛУЧЕНА 8-12 , тем более 24 часа нтому назад. - это нонсенс. СНИЖАЕТСЯ ВЫХОД. ИДУТ СЕЛЕКТИВНЫЕ ПОТЕРИ. ИЗМЕНЯЕТСЯ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ.

ВООБЩЕМ ЧУДЕС НЕ БЫВАЕТ - РАБОТАЙТЕ СО СВЕЖЕПОЛУЧЕННОЙ КРОВЬЮ ВСЕГДА!

[quote]Только вот 25 мл в пипетке - это уметь надо! [/quote]
только так и делаем, очень просто и удобно
Мо-лод-цы!! Но для новеньких это сложно, пока научаться. Пусть помнят, когда кровь при наслаивание "пробивает границу" это не профессионально и приводит к снижению эфеективности выделения и селективным потерям!

[quote]Конешно он бедный не знал тогда еще, что СD34+ и Мезенхимальных СК ПК там навалом, ну а что касаемо дорманантных СК - то их там как шампиньонов на обочинах Рублевки.[/quote]
а сколько их там? у вас есть личная статистика?
могу сказать по cord blood - 0.1-0.9% CD34+ в MNC
[quote]

... Личной статистики, сколько шампиньонов на кв.м. обочины Рублевского шоссе у меня нет!. Как Вы себе представляете, мои исследования в этом направлении, а...? Где бы я сейчас был?

Что касается сод.С34+ в пуповинке, мне кажется что маловато, но ямогу ошибаться, надо посмотреть публикации гематологов.

Все, кажется. Пойду выпью минералки или травяного чая!
Всем удачи.

Solo/
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2005 07:54     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

какой антикоагулянт?
[quote]Короче - ЭДТА технологичней и воспроизводимей[/quote]
не зря же моя любимая компания BD выпустила Vacutainer (куча разных вакумных пробирок со всеми возможными антикоагулянтами - каждая для своей цели)
http://www.bd.com/vacutainer/
разница - конечно!
к сожалению мои знания по этому вопросу ничтожны.
знаю, что например если нужны чистые красивые моноциты (шоб дендритные например из них сгенерить),гепарин никак не катит, тромбоциты прилипнут к моноцитам и п-ц! только ЭДТА

разводить и мыть -

[quote]PBS!
да пожалуйста! Но всетаки сбалансированный солевой раствор типа Хенкса или Эрла для культуральщика, это как чистите зубы утром и вечером! [/quote]
да наверное круче HBSS-CMF нет, согласен
но если я в день трачу 1-2 литра PBS, то готовить HBSS просто заколебусь, а текнишн просто не поймёт...

[quote]ИСПОЛЬЗОВАТЬ КРОВЬ, КОТОРАЯ ПОЛУЧЕНА 8-12 , тем более 24 часа нтому назад. - это нонсенс. СНИЖАЕТСЯ ВЫХОД. ИДУТ СЕЛЕКТИВНЫЕ ПОТЕРИ. ИЗМЕНЯЕТСЯ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ. [/quote]
АБСАЛЮТНА! rolleyes.gif
[quote]ЧТО КАСАЕТСЯ СРОКОВ ХРАНЕНИЯ КРОВИ ДО ВЫДЕЛЕНИЯ,
НЕ БОЛЕЕ "-; ЧАСОВ при +4!!! [/quote]
да, но иногда пролежит в госпитале сутки, а выбрасывать жалко, тогда - развожу побольше, но интерфаза всегда контаминирована эритроцитами, приходится добавлять лизис, после всего - содержание СD34+ практически не меняется..
но если интерфазы просто нет (часто бывает в суточной крови), то только выкидывать... weep.gif
[quote]Что касается сод.С34+ в пуповинке, мне кажется что маловато, но ямогу ошибаться, надо посмотреть публикации гематологов. [/quote]
верьте мне, я с этим работаю, по литературе схожие данные...
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2005 10:14     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

[/quote] верьте мне, я с этим работаю, по литературе схожие данные...[/quote]

Верим, верим, верим...!

Аlex!
А что известно про удельную плавучую плотность ГСК несущих СD4+ вообще, и в частности, - если они из пунктат костного мозга взрослого человека получены, или из пер-кой крови путем мобилизации нейпогеном, или из пуповины новорожденного???

Кто нибудь гонял их через Percoll параллельно с индикаторами плотности и последующим фенотипированием.

Помнится, когда впервые Максимов поделился со мною своими предположениями о едином гемопэтическом предшественнике, он сразу сказал, что они: "ОЧЕНЬ ТЯЖЕЛЫЕ КЛЕТКИ!"

Solo.

P.S.Те же вопросы и в отношении так.наз. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ.
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2005 22:49     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

вы наверное имели в виду не CD4+ a СD34+ ?
конкретно их плавучую плотность не знаю, думаю да -тяжёлые, но не очень,
ведь все они остаются в интерфазе на фиколле, по размерам - да крупняк, ядра много, вообще очень похожи на молодые лимфоциты.
а из какого они источника - разницы думаю почти никакой, опубликовано около 10 хороших исследований, сравнивающих свойства HSC костного мозга, мобилизированной крови (это вообще одни и те же клетки) и пуповинной крови. Находят разницу только по силе экспрессии различных генов (если прогнать на 1000-2000 генов на microarray), так что я думаю принципиально глобальной разницы - никакой (CD34+ они и в Африке...), но это только по чистым HSC, а не про клеточный состав вообще...

лично я фиколл с перколлом не сравнивал, но с перколлом работал для других целей, думаю люди посравнивали уже и решили - фиколлить!
думаю что для выделения чистой фракции MNC пока ничего лучше нет (но может я не всё знаю...), не считая потерь клеток wink.gif
solo
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 28.03.2005 12:24     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

[quote="Alex"] [/quote]

Спасибо коллега, что поняли о чем речь, действительно CD34+/

Но мой вопрос был в другом, а именно:

Понятно, когда выделяют ГСК для целей трансплантации, здесь количество CD34+ является главным и единственным ( кроме ест. жизнеспособности) параметром оценки выделения клеток. Если не ошибаюсь. нужно 2-3 млн на кг веса реципиента. И бог с потерями. в т.ч. и селективными - набрал количество влил? получил клинический эффект и слава богу.

Но если идет ресерч цели и задачи то другие, эдесь должнf быть полная ясность что теряшь, чего модифицируешь, чего амплифицируешь и т.д. и т.п.
Потому что как не крути КМ ГСК, как впрочем и другие "СК", вещь весьма гетерогенная, как по своему естеству, так и по своим характеристикам на основе которых мы их дрючим (я это правильно по русски?, а то отвык за последнюю неделю). В том числе и по удельной плавучей плотности.

В принципе это всем давно известно, но для подтверждения сошлюсь на последний док. дисер в Институте биологии развития. Есть женщины в русских селеньях! Так вот там прямо указывается что попул КМ ГСК состоит как минмум из двух субпопулов.

Поэтому я и спросил про Перколл, но Ваш ответ меня ввел в некоторе сумление т.сказать, что Вы имеет в виду под термином "перколлить"? Как следует из Вашего ответа Вы или кто то пытались выделять МНК пуповинной крови на Перколле? Я правильно понял? Можно уточнить, как и для каких целей, что делали с клетками после выделенных на перколе.

Прошу извинить меня за назойливость и приставучесть, но вопрос крайне интересный и важный с практической стороны для меня.

А хорошо все таки дома! Вот у нас в загороднем отделении больницы им. Кащенко больных зовут на обед. Да, наш персонал дормантным не назовешь!

Solo.
Alex
IP-штамп: friYUXApcTu9A
гость



 прочитанное сообщение 29.03.2005 05:48     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

[quote]Понятно, когда выделяют ГСК для целей трансплантации, здесь количество CD34+ является главным и единственным ( кроме ест. жизнеспособности) параметром оценки выделения клеток. Если не ошибаюсь. нужно 2-3 млн на кг веса реципиента. И бог с потерями. в т.ч. и селективными - набрал количество влил? получил клинический эффект и слава богу. [/quote]
Абсолютно! + T-cells depletion
[quote]Но если идет ресерч цели и задачи то другие, эдесь должнf быть полная ясность что теряшь, чего модифицируешь, чего амплифицируешь и т.д. и т.п.
Потому что как не крути КМ ГСК, как впрочем и другие "СК", вещь весьма гетерогенная, как по своему естеству, так и по своим характеристикам на основе которых мы их дрючим (я это правильно по русски?, а то отвык за последнюю неделю). В том числе и по удельной плавучей плотности.[/quote]
Абсолютно!
но я её не знаю, эту плавучую плотность frown.gif тёмен
[quote]Так вот там прямо указывается что попул КМ ГСК состоит как минмум из двух субпопулов. [/quote]
как минимум больше, это вопрос активно изучаемый и controversial (СD34+, СВ34-, CD133, Lin (-), Thy-1+, дормантные = HSC в G-0 фазе, aденилатДГ-аза+, side population.... - всё это ГСК!!!!)
так что же такое ГСК? давайте дисскутировать, но в разделе "клеточная биология"
[quote]Как следует из Вашего ответа Вы или кто то пытались выделять МНК пуповинной крови на Перколле? Я правильно понял? [/quote]
нет не разу не пробовал, а перколлил совершенно другие клетки и то так - побаловаться, с кровью на перколле не работал frown.gif
хотя интересно конечно сравнить, как впрочем ещё и много всего другого,
кто-то наверняка уже сравнил (тот же Боюм), просто надо порыть pubmed
и выбрали фиколл!!!
Marzhan
IP-штамп: fracVKlWZ9PJY
гость



 прочитанное сообщение 30.04.2009 10:52     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Я думаю все зависит от цели работы, если вы хотите криоконсервировать кровь, то можно использовать р-р желатина или полиглюкина. В этом случае выход составляет 40-60% и малые потери при криоконсервации. Для культивирования желательно использовать лизис или разделение в градиенте фикола. После обрабоки лизирующим раствором клетки хуже прикрепляются к подложке. Поэтому обработку лизирующим раствором я применяю только для костного мозга животных. Это дешево и сердито. Монослой обычно образуется на 5-7 сутки культивирования. При поступлении в лабораторию костного мозга человека я использую разделение в градиенте фикола. В этом случае происходит меньшее повреждение клеток, чем при лизисе и монослой образуется где на 6-8 сутки. Разделение на фиколе я провожу всегда в 50 мл пробирках.
Guest
IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c
гость



 прочитанное сообщение 11.11.2010 07:43     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

а корд блад? а bone marrow??
я развожу cord blood 1: 1-2-3 (зависит от свежести, если свежак 1:1, полдня -сутки 1:2)
Разведение всегда было законо 1:3 для венозной крови, если только это не кровь б-х лимфопролиферативными заболеваниями.

А для крови и костного мозга больных лимфопролиферативными заболеваниями?
Участник оффлайн! Katushka
Участник



 прочитанное сообщение 07.12.2010 18:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Помогите, есть проблема по данной тематике! у некоторых доноров кровь как-то специфически разделяется в градиенте фиколла, под кольцом мнк пласт эритроцитов, потом пусто и на дне эритроциты. за счет чего может быть такое? очень мешает выделять и выход соответственно..хоть плачь. это претензии к самой крови (берется свежая с донорского пункта) или к внешним условиям (низкая температура при транспортировке), или может еще что-то?
Участник оффлайн! Lynx.rufa




 прочитанное сообщение 21.11.2017 11:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(Marzhan @ 30.04.2009 12:52)
Ссылка на исходное сообщение  Разделение на фиколе я провожу всегда в 50 мл пробирках.

Здравствуйте!
Временной разрыв между нашими сообщениями, конечно, огромный, но не могли бы вы подсказать - в какой именно пропорции вы наслаивали кровь на фикол в пробирках на 50 мл? Примерно 11 мл фикола на 32 мл разбавленной крови (8 мл цельной венозной+24 мл сср Хэнкса)?
Заранее спасибо за ответ.
Участник оффлайн! Annabel
Участник
Бостон, США



 прочитанное сообщение 01.12.2017 22:40     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

Я тоже обычно наслаиваю в 50 мл.
Кровь к PBS 1:4, 10 ml фикола и 40 мл разведенной крови или меньше (сколько есть).
Участник оффлайн! Lynx.rufa




 прочитанное сообщение 23.01.2018 11:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

(Annabel @ 02.12.2017 00:40)
Ссылка на исходное сообщение  Я тоже обычно наслаиваю в 50 мл.
Кровь к PBS 1:4, 10 ml фикола и 40 мл разведенной крови или меньше (сколько есть).

Спасибо за совет!
Участник оффлайн! Blackberry




 прочитанное сообщение 12.04.2021 18:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Здравствуйте, сейчас начала заниматься выделением мононуклеаров ПК. Возник вопрос определения жизнеспособности этих клеток. Я планирую делать это с помощью покраски 0,4% трипановым синим и подсчёте в камере Горяева.
Подскажите, пожалуйста, возможно у кого-то есть протокол покраски и подсчёта именно мононуклеарных клеток. В каком соотношении нужно добавлять трипановый синий, и можно ди применять для определения всего количества МКПК стандартные формули для рассчёта количества лейкоцитов после подсчёта в камере Горяева.
Благодарю!)
Участник оффлайн! yousuf
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.09.2022 14:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

I will tell your friends to visit this site. .Thanks for the article. 메이저놀이터
Участник оффлайн! yousuf
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.09.2022 14:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

With havin so much content and articles do you ever run into any issues of plagorism or copyright violation? My site has a lot of unique content I’ve either created myself or outsourced but it appears a lot of it is popping it up all over the internet without my agreement. Do you know any ways to help protect against content from being ripped off? I’d certainly appreciate it. 메이저놀이터

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 10:19
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft