Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Ольга Л. |
Вам нужно порезать 1мкг ПЦР-продукта длиной 1,6kb рестриктазой EcoRI. Для этой рестриктазы в ПЦР-продукте имеется 2 сайта рестрикции. Какое минимальное количество ед. (u) рестриктазы EcoRI вам потребуется для проведения реакции за 1 час? Для справки: 1.Unit Definition One unit is defined as the amount of enzyme required to digest 1µg of lambda DNA in 1 hour at 37°C in 50µl of assay buffer. 2. Длина lambda DNA приблизительно 48 kb 3. Для EcoRI у lambda DNA 5 сайтов рестрикции. Ответ округлите до целых чисел Сообщение было отредактировано Ольга Л. - 23.08.2006 08:46
Сообщение в колонке новостей, раздел "Информация, связанная с нашей профессией" 22.08.2006 11:02 |
AE Постоянный участник |
(Ольга Л. @ 21.08.2006 16:44) Народ вот решает. Некоторые даже получают ответы как у автора. Никто не ругается, что задача не корректная или не правильно решена. Тишь да гладь. А можно я, как чайник в молекулярно-биологической кухне, задам пару провокационных вопросов. 1. Если так сложилось, что я готов ждать не час, а два часа, то могу ли я взять вдвое меньше единиц фермента? 2. Если я запихал тоже самое в 25µl то могу ли я считать, что за 30 минут реакция пройдет полностью. Ответы, если можно, с объяснением.
|
Ольга Л. |
Да, составитель задач из меня никудышний, не зря так долго не решалась ее писать. В ответ на провокационные вопросы 1. Да, Вы можете взять единиц фермента меньше, теоретически даже вдвое. Но, практически, фермент с течением времени, и, соответственно, раундами рестрикции постепенно теряет свою активность. Насколько быстро - вероятно зависит от фермента. 2. Нет, не можете, поскольку количество сайтов рестрикции и количество фермента осталось прежними, только в меньшем объеме. С чего бы рестриктазе вдруг начать работать быстрее? Надеюсь, я ответила на вопросы. |
nas Постоянный участник Москва |
(Ольга Л. @ 23.08.2006 10:17) 2. Нет, не можете, поскольку количество сайтов рестрикции и количество фермента осталось прежними, только в меньшем объеме. С чего бы рестриктазе вдруг начать работать быстрее? То есть, если разбавить смесь до 25 мл (буфером, ну альбумина добавить, чтобы фермент не инактивировался) - то реакция пройдет за то же время??? |
Yeaster |
Что до влияния объема реакционной смеси на скорость ферментативной реакции - то вопрос сложный и теоретически результат, на мой взгляд, непредсказуем. Вдвое скорость, конечно, не возрастет. Но, с одной стороны, вы сокращаете объем вдвое и уменьшаете промежуток времени, необходимый для встречи в растворе ДНК и фермента, но при этом возрастает вязкость раствора и к тому же увеличивается концентрация компонентов буфера, в котором хранится рестриктаза, что может негативно сказаться на скорости реакции. Так что задача вполне понятная. Ну, может быть стоит дополнить ее некоторыми ограничениями, чтобы снять спорные моменты. Еще раз спасибо Ольге.
|
Urrу Постоянный участник |
2. Если я запихал тоже самое в 25µl то могу ли я считать, что за 30 минут реакция пройдет полностью. В обоих случаях нет, т.к. и там и там изменения не дадут линейного отклика на эффективности реакции. В последнем случае, вообще, может произойти снижение эффективности из-за двукратного увеличения вязкости реакционной смеси...
|
AE Постоянный участник |
(Ольга Л. @ 23.08.2006 08:17) Да ладно вам прибеднятся. Очень полезная задача 1. Да, Вы можете взять единиц фермента меньше, теоретически даже вдвое. Но, практически, фермент с течением времени, и, соответственно, раундами рестрикции постепенно теряет свою активность. Насколько быстро - вероятно зависит от фермента. Ну это так, разминка была. Спасибо, что подправили условие. 2. Нет, не можете, поскольку количество сайтов рестрикции и количество фермента осталось прежними, только в меньшем объеме. С чего бы рестриктазе вдруг начать работать быстрее? Количество осталось тем-же, но молярная концентрация сайтов увеличилась. А скорость ферментативной реакции зависит все-таки от концентраци, а не от количества субстрата. Иначе бы в определении единицы не был бы указан объем. Ну и как уже сказала nas, если объем реакции очень сильно увеличить а концентрацию сайтов соответсвенно уменшить, врядле приходится ожидать той-же скорости реакции. |
Ольга Л. |
Я думаю с первым вопросом мы разобрались. Теперь по-поводу второго. Суть вопроса заключалась в том, что если уменьшить объем реакции вдвое, то уменьшится ли время реакции вдвое? Ответ - нет. Соглашусь, объяснение я дала не совсем корректное. Время работы молекулы рестриктазы состоит из следующих этапов: 1. Распознавание сайта рестрикции на молекуле ДНК 2. Присоединение фермента к найденному сайту 3. Разрезание сайта 4. Отсоединение фермента от ДНК. Я полагаю, что 2-4 этапы у нас константные, т.к. состав буфера и температура не меняются. Остается 1-й этап. С одной стороны, если концентрацию сайтов увеличить, то ферменту будет легче найти нужный и времени на это потребуется меньше. С другой стороны, при увеличении количества ДНК повышается вязкость раствора (то, о чем писали Urry и Yeaster), ферменту становится "труднее пробираться" между нитями ДНК, движение молекул в растворе замедляется и время реакции увеличивается. Т.о. если постепенно уменьшать количество реакционной смеси, то вначале мы получим ускорение реакции (но не линейное), потом будет некая точка перегиба (если представить себе график), после чего - снижение скорости реакции. Кроме того, каждая молекула фермента способна провести определенное количество раундов гидролиза, после чего разваливается/инактивируется. Надеюсь, такое объяснение публику устроит больше. Помимо всего прочего, вот одно из определений ед. активности: За одну единицу активности эндонуклеазы рестрикции принимают количество фермента, необходимое для полного гидролиза в течении одного часа одного микрограмма ДНК при оптимальной температуре и в оптимальном реакционном буфере. Заметьте, здесь указано количество субстрата и не указан объем реакционной смеси, т.е. речь не идет о концентрации (можете обвинить авторов в безграмотности ). И вот еще полезное замечание Volume: Viscous DNA solutions inhibit enzyme diffusion and can reduce enzyme activity. DNA concentrations that are too dilute can fall below the Km of the restriction enzyme and also affect enzyme activity. Volume considerations must take into account final ionic strength and must result in glycerol concentrations no higher than 5-10% in order to avoid star activity. Reaction volumes of 10-50µl per microgram of DNA are recommended. Сообщение было отредактировано Ольга Л. - 24.08.2006 09:20
|
AE Постоянный участник |
(Ольга Л. @ 23.08.2006 14:37) Да разобрались. Кстати, если походить вокруг приведенной вами ссылки можно найти интересную табличку из которой узнать сохранность активности некоторых рестриктаз во времени. Для EcoRI линейность ответа сохраняется как минимум от 15минут до 4х часов. Так что на первый мой вопрос ответ Да. Теперь по-поводу второго. Суть вопроса заключалась в том, что если уменьшить объем реакции вдвое, то уменьшится ли время реакции вдвое? Ответ - нет. Соглашусь, объяснение я дала не совсем корректное. ...... Т.о. если постепенно уменьшать количество реакционной смеси, то вначале мы получим ускорение реакции (но не линейное), потом будет некая точка перегиба (если представить себе график), после чего - снижение скорости реакции. ...... Надеюсь, такое объяснение публику устроит больше. Объяснение меня не до конца устроило (про публику не знаю), однако аргументированно с ним спорить у меня не хватает знаний, но практический вывод меня вполне устраивает. Еще раз спасибо за задачу.
|
Gal IP-штамп: frYQ4K.bticsw гость |
|
Guest IP-штамп: frlscERHcuXAs гость |
огромные суммы на ночные клубы в поисках девицы, которая смогла бы скрасить вечер одинокого мужчины |
thomslist IP-штамп: frgSOQ3cPmoKc гость |
|
sex toys IP-штамп: frlPgpOj6xwGc гость |
|
ycz95886 indonesia |
|
bissell vacuum cleaners IP-штамп: frlPgpOj6xwGc гость |
<a href="https://www.bissellvacuumcleaners.com/">bissell vacuum cleaners</a> to carpet deep cleaners, cleaning solutions we’ve formulated ourselves specifically for real messes we all make to pet hair removal products. We’ve got you covered. Each product is designed to help you take care of your favorite spaces and the surfaces in them. After all, what’s the point of having a floor, or a sofa, or a carpet if you can’t play on it? |
Queenswu666 |
|
lopezgalindo2646 |
|
안전놀이 IP-штамп: frCiFXLI5jPVw гость |
I happened to read your article today. It's a very good article, and it must be very helpful. As a token of appreciation, I would like to inform you of information that can help you. I hope you can go here and get some information that will help you. Thank you. I wish you luck. |
메이저놀 IP-штамп: frCiFXLI5jPVw гость |
I happened to read your article today. It's a very good article, and it must be very helpful. As a token of appreciation, I would like to inform you of information that can help you. I hope you can go here and get some information that will help you. Thank you. I wish you luck. |
토토사이 IP-штамп: frCiFXLI5jPVw гость |
|
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
You can increase your blog visitors by having a fan page on facebook. |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Excellent website. Plenty of useful info here. I’m sending it to several friends ans also sharing in delicious. And of course, thanks for your sweat! |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Some times its a pain in the ass to read what website owners wrote but this site is very user friendly! |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
hey all, I used to be just checking out this blog and I actually admire the premise of the article, and don’t have anything to do, so if anybody wish to to have an engrossing convo about it |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Amazing post – Gulvafslibning | Kurt Gulvmand however hey I having a issue we can not seem to be capable of sign up your rss feed |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Quite insightful post. Never believed that it was this simple after all. I had spent a very good deal of my time looking for someone to explain this topic |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Hi there, I found your blog via Google while searching for first aid for a heart attack and your post looks very interesting for me. |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
The difference between the right word and the almost right word is more than just a fine line! it's like the difference between a lightning bug and the lightning! |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Comfortabl y, the post is actually the freshest on this precious topic. I concur with your conclusions and also definitely will eagerly look forward to your future updates. |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
My partner and i still can not quite assume that I could be one of those reading through the important recommendations found on this blog. |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Wow I just adore her! She is so beautiful plus a really good actress. I don’t think the show V is all that good, none the less I watch it anyway just so I can see her. |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
I am only commenting to let you know of the remarkable experience our girl encountered reading the blog. |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
I am only commenting to let you know of the remarkable experience our girl encountered reading the blog. |
Guest IP-штамп: frJKaerpkB5o2 гость |
Do you mind if I quote a couple of your posts as long as I provide credit and sources back to your site? |
먹튀검증 IP-штамп: frPtszR0RQoj2 гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frA2HjgkwydCY гость |
|
Guest IP-штамп: frdmv/zaJVb.U гость |
|
Guest IP-штамп: frdmv/zaJVb.U гость |
|
Guest IP-штамп: frdmv/zaJVb.U гость |
|
Guest IP-штамп: frdmv/zaJVb.U гость |
|
Guest IP-штамп: frdmv/zaJVb.U гость |
|
Guest IP-штамп: frdmv/zaJVb.U гость |
|
« Предыдущая тема · Сборник задач · Следующая тема » |