 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Affinity chromatography of DNA binding proteins -- пара вопросов --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 petrПостоянный участник  |
 25.03.2010 22:07
Есть пара вопросов по посадке ds-олига на CNBr сефарозу. В разных методиках делают олиг на спейсере, делают несколько повторов binding сайта, видел методику где делают олиг (правда трудно его уже олигом назвать) self prime PCR^ом и получают под сотню binding сайтов. Собственно вопрос как лучше сделать, т.е. сколько повторов на нем лучше. И как лучше пришивать его? |
|
Shadow Постоянный участник Минск |
26.03.2010 01:27
 Но если Вы выбрали CNBr сефарозу, то надо следовать общим принципам. Бромциан-активированная сефароза достаточно быстро разваливается в условиях конъюгирования, поэтому либо Вы льете на нее высокую концентрацию ампликона, содержащего одну аминогруппу, либо повышаете эту концентрацию за счет множественного введения метки. Выбор за Вами 
|
|
ElenaHrapova Участник |
27.03.2010 15:08
|
|
petr Постоянный участник |
27.03.2010 19:03
Я, честно говоря, этим никогда не занимался, а тут похоже встала такая задача. Есть потенциальная область куда садится мой фактор (показано Gel Shift^ом и репортерным ассеем). Пробивал по программам - есть около десятка потенциальных факторов, но покупать десяток антител с десятком siRNA дороговато, да и не факт, что поможет. Думается что самое простое вытащить все что сядет на эту область и отдать на масспек. |
|
petr Постоянный участник |
27.03.2010 19:11
(ElenaHrapova @ 27.03.2010 13:08)  в свое время мы почистили один транскрипционный фактор таким образом. Сам олиг (ds) длиной 25 нуклеотидов, мультимеризовали лигированием overnight, а в лигазную смесь еще добавляли и pnk. получались хорошие мультимеры вплоть до 1000 нуклотидов. Смотреть мультимеры на утро нужно в агарозном геле. Потом и шейте их на смолу. Все получится... если есть еще вопросы - пишите..Вы у олига делали липкие концы или тупые? PNK вроде работает на 37оС, Вы сначала обрабатывали PNK, а потом добавляли лигазу и ставили на ночь, или прямо в лигазную смесь капали PNK? А огромный олиг не "запутается" на сорбенте? И собстввенно на что и как пришивали? Я тут читал методику, где берут oligo(dT) целлюлозу, олиг с поли-А хвостом на нее отжигают, потом полимеразой достраивают. И еще вопрос, можно ли не затеваться с колонкой, а все проделать на бидсах, их отмыть, а потом снять трансфак высокой солью? Сообщение было отредактировано petr - 27.03.2010 19:13 |
|
guest: ммм IP-штамп: frTTCS0/dAHf2 гость |
27.03.2010 22:02
Можно, если хватит материала на масспек. Самый простой вариант стрептавидиновые бидсы и меченный биотином фрагмент.
|
|
petr Постоянный участник |
27.03.2010 22:45
А насколько прочно будет держаться длинный олиг? Короткие, боюсь не подойдут. |
|
Shadow Постоянный участник Минск |
27.03.2010 23:49
|
|
Guest IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
31.03.2010 13:56
Олиги мы делали липкие. Киназа будет работать медленно, но долго- overnight. Лигируйте на 12-14 градусах. Остаточной активности киназы вполне будет достаточно. Можно и другими лигазами, которые за час на 37.. Тогда и лигирования и кинирование пойдет эффективно. Киназу- прямо в лигазную смесь. Мультимеризованный олиг шили на активированну BrCn сефарозу. Получалось хорошо... Шили около 400 мкг мультимеризованного олига... Потом эту смолу можно использовать и для batch и для колонки. Не забудьте про полиДиДс... хоршо забивает неспецифику. При этом получите массу белков, которая свяжет однонитевые разрывы и концы... Мы так точно вытащили помимо своего фактора еще и PARP. Желательно до эксперимента узнать мол массу Вашего фактора. Для этого есть масса методов. Если что- пишите.
|
|
Guest IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
31.03.2010 13:57
|
|
Тяни-толкай Постоянный участник |
31.03.2010 14:20
|
|
Тяни-толкай Постоянный участник |
04.04.2010 11:39
|
|
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
 07.12.2021 11:26
It influences some readers. and some may fail in audience perception because of messiness to least important. in your article writing. So, following the correct format of writing |
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.