Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Statin Постоянный участник |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
Statin Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
(Yuri K @ 08.09.2009 00:40) Видимо, "общее правило" для 2х пар праймеров заключается в отсутствии взаимного залипания всех 4х праймеров. Для бОльшего числа пар праймеров ИМХО подобрать totally незалипающие праймеры невозможно. Алгоритм, который я успешно использовал для многоплексов был прост: (1) относительно длинные праймеры с Тм около 62 (Primer3 default buffer) в очень небольшой концентрации, около 20 нМ; (2) длинна ампликонов как можно более одинакова (+/- 15 нт). С концентрацией (0.4 pm/20 мкл) понятно . А зачем выравнивать длину ампликонов, да ещё и с высокой точностью (+/- 15 нт) ? |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Statin @ 08.09.2009 04:19) Спасибо, про длину ампликонов это логично, но почему длинные праймеры, ведь чем длиннее праймеры, тем больше взаимодействий между ними? Как ни странно, более длинные праймеры работают более эффективно в мультиплексе чем короткие с той же Т пл. С минимальной концентрацией праймеров, что-то около 0,1 мкМ каждого, тоже не возражаю - по ходу рптимизмции будете только увеличивать их в 2-3 раза для слабых полос. Дельта G для 5-концевых (3-штрих) нуклеотидов далжна быть максимальной, в пределах от -7,5 до -6.0. (АТ-богатый 3-штрих конец). Но основное слово, конечно, за остальной ПЦР системой, где оказалось важно добавлять побольше, в 2-3 раза, полимеразы... и т д. Чё-то Генсек скромничает с его-то опытом мультплекс-игр. |
Statin Постоянный участник |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Statin @ 08.09.2009 10:07) Энергия Гиббса это хороший момент, спасибо, а какое количество димеров между праймерами разных генов допустимо? Кто его знает Чем меньше. тем лучше. Проблему димеров можно решить добавляя к 5-штрих концу "горбатого" праймера нематричной АТ-бог. последовательности в 8-12 н. При этом размер фрагмента, соответственно, увеличится. |
genseq Постоянный участник |
(Ъ @ 08.09.2009 07:53) Некогда мне . Платёжки заколебали! |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Statin @ 08.09.2009 04:19) Спасибо, про длину ампликонов это логично, но почему длинные праймеры, ведь чем длиннее праймеры, тем больше взаимодействий между ними? Тут такая логика. Раз мы всяко не можем предсказать все залипушки при таком обилии праймеров, мы с залипанием боремся, снижая их концентрацию. Тогда длинна праймеров с точки зрения залипаемости уже роли не играет, т к возможности залипушек определяются числом праймеров, а не их длинной. Но чтобы праймеры при низкой концентрации эффективно липли куда надо, нужно их сделать длиннее. При таком подходе главной проблемой многоплекса становится не залипание праймеров друг на дружку, а взаимная конкуренция (супрессия)ампликонов, где основной фактор, это длинна ампликона. Т е чтоб свести конкуренцию к минимуму, нужно их максимально выровнять. После 1х проб обычно приходилось корректировать концентрации праймеров. Т е дохлякам повышать до 25 нМ, а наиболее наглым снижать до 15 нМ. |
genseq Постоянный участник |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
Statin Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
(Yuri K @ 08.09.2009 18:44) А никак :-)) В смысле-подбором. Все-голая эмпирика. На самом деле, у меня наибольшие трудности были с АТ-богатыми последовательностями. На "эмпирику" деньги нужны . А если их нет, то приходится побольше теоретизировать и поменьше экспериментировать . Если теоретически, то пора с Taq переходить на Tli, Vent и прочие пирококковые полимеразы и их производные, отличающиеся не только исключительной термостабильностью, но и замещающей активностью, облегчающей преодоление шпилек.
|
genseq Постоянный участник |
(Yuri K @ 08.09.2009 18:44) А вот об этом желательно поподробнее. Недавно наблюдал что-то похожее - АТ-богатые ампликоны размножались явно хуже обычных . Будем понижать температуру удлинения, или как? |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Statin @ 08.09.2009 20:48) Спасибо за ответы. Еще вопрос, если длина ампликона хаускиппера 91 bp, а длина предполагаемых генов мишеней в одной группе 85-95 bp, другой группе 140-157 bp, имеет ли смысл сделать более длинный хаускиппер для второй группы генов. Если хаускипер будет тянуть одеяло на себя с более длинными ампликонами, я б сначала попробывал уменьшить концентрацию евонных праймеров, т к это быстрее и дешевле (они у вас уже есть!). Если не поможет, тогда придется удлиннить его ампликон. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(genseq @ 08.09.2009 22:29) На "эмпирику" деньги нужны . А если их нет, то приходится побольше теоретизировать и поменьше экспериментировать . Если теоретически, то пора с Taq переходить на Tli, Vent и прочие пирококковые полимеразы и их производные, отличающиеся не только исключительной термостабильностью, но и замещающей активностью, облегчающей преодоление шпилек. Ну не так вс мрачно. На навороченных полимеразах вы потеряете те самые деньги, которые выручите на эмпирике. На самом деле, доводка не столь уж трудоемка, т к бОльшая часть работает с 1го раза. Какое-то время я развлекался, тасуя панельки СНИПов в разных произвольных сочетаниях, и никаких проблем не возникало. Обычно рутина у меня была такая. Сначала смешивал праймеры в равных концентрациях и гнал ПЦР. Обычно на дюжину ампликонов попадался один уродец, который давал высокий фон (я тестировал дальше на Люминексе) за счет случайного залипания ампликона на пробу. Такого уродца приходилось переделывать (в смысле, не его самого, а менять ориентацию пробы на шарике на противопложную). Затем я подгонял концентрации праймеров в соответствии с полученным сигналом и тестировал снова. После этого панелька была практически готова. Иногда оставалась пара СНИПов, которые не работали вообще, но я обычно выбирал СНИПы с запасом, так что сильно по этому поводу не парился. Если было настроение или это были маст рид СНИПы, тогда передизайнил праймеры. Проблему АТ-богатых в мультиплексе я решить в общем виде не успел, к сожалению (как я сумел решить это с моноплексным Амплифлором). Но следовал своей прежней логике: праймеры могут быть сколь угодно длинными, хоть 45-ки, лишь бы Тм была нужная. Иногда это помогало, иногда нет. Я должен отметить еще один момент. Для панелек СНИПов задача проще, т к количество копий ДНК-таргета для всех ампликонов одинаково. Для других задач супрессия будет сильно мешать.
|
Statin Постоянный участник |
Мне как раз нужна количественная ПЦР (экспрессия генов), поэтому, видимо, придется использовать дорогие полимеры. Мне гораздо важнее сохранить исходный материал, и не изводить его на эксперименты. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
genseq Постоянный участник |
Что касается сравнительной дороговизны пирококковых ДНК-полимераз, то для мультиплексов это не самая существенная статья расходов. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(genseq @ 09.09.2009 21:58) Я имел в виду проблемы не с АТ-богатыми праймерами, а с АТ-богатыми ампликонами. Твёрдой уверенности пока нет, но зреет ощущение, что уровень их накопления ниже, чем у обычных матриц. Если так, то замена полимеразы вполне может помочь (не обязана. но шанс есть). Что касается сравнительной дороговизны пирококковых ДНК-полимераз, то для мультиплексов это не самая существенная статья расходов. (1) Я вас так и понял. Но то и другое чаще всего вместе (2) Почему супрессия может зависеть от ТИПА полимеразы, это выше моего понимания. Но пробуйте, коли желание есть. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Yuri K @ 09.09.2009 22:48) (1) Я вас так и понял. Но то и другое чаще всего вместе (2) Почему супрессия может зависеть от ТИПА полимеразы, это выше моего понимания. Но пробуйте, коли желание есть. qPCR и мультиплекс-PCR не очень совместимы, ИМХО. Хотя делают. С экспрессией дальше диплекса (а третий хаускипер) я бы не стал связываться - воспроизводимость будет нулевая. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Yuri K @ 09.09.2009 21:01) А альтернативные полимеразы тоже надо "знать в лицо". прежде чем планировать - в статьях все красиво. а на делее... |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Ъ @ 10.09.2009 09:41) А альтернативные полимеразы тоже надо "знать в лицо". прежде чем планировать - в статьях все красиво. а на делее... Есть наборы, которые в мультиплесе дают результаты существенно лучше обычного Така, т е супрессия значительно ниже. Но в полимеразе ли там дело, не очень понятно. |
Statin Постоянный участник |
Видимо последую вашему совету, подобрать не пересекающие праймеры (или мало пересекающиеся) оказалось практически не возможно, ну 2 пары, ну 3 , а дальше все плывет... |
ffonilmerkon |
(genseq @ 08.09.2009 21:25) Это понятно. Но перекосы в "мультовой" амплификации связаны не только с праймерами (что часто можно подправить регулировкой их концентрации). Не менее важно (если не более) торможение полимеразы ампликонными шпильками . А с этим как будем бороться? Добрый день, подскажите пожалуйста - в какой программе лучше смотреть ампликонные шпильки ? |
dk Постоянный участник Россия |
|
Шаолинь Постоянный участник |
(ffonilmerkon @ 22.04.2021 12:38) у Миши Цукера DNAfold |
admin001 Участник |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
watchesbiz Постоянный участник |
|
nigoal123 IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
with your network. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |