Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Подбор праймеров для мультиплексной ПЦР -- Подкажите общие правила --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.09.2009 21:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Уважаемые коллеги! Подскажите, пожалуйста, общие правила по подбору праймеров для мультиплексной ПЦР и необходимые для них условия. В чем принципиальное отличие от праймеров для обычной ПЦР. mol.gif
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 08.09.2009 02:40     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Видимо, "общее правило" для 2х пар праймеров заключается в отсутствии взаимного залипания всех 4х праймеров. Для бОльшего числа пар праймеров ИМХО подобрать totally незалипающие праймеры невозможно. Алгоритм, который я успешно использовал для многоплексов был прост: (1) относительно длинные праймеры с Тм около 62 (Primer3 default buffer) в очень небольшой концентрации, около 20 нМ; (2) длинна ампликонов как можно более одинакова (+/- 15 нт).
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 04:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Спасибо, про длину ампликонов это логично, но почему длинные праймеры, ведь чем длиннее праймеры, тем больше взаимодействий между ними?
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 08:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(Yuri K @ 08.09.2009 00:40)
Ссылка на исходное сообщение  Видимо, "общее правило" для 2х пар праймеров заключается в отсутствии взаимного залипания всех 4х праймеров. Для бОльшего числа пар праймеров ИМХО подобрать totally незалипающие праймеры невозможно. Алгоритм, который я успешно использовал для многоплексов был прост: (1) относительно длинные праймеры с Тм около 62 (Primer3 default buffer) в очень небольшой концентрации, около 20 нМ; (2) длинна ампликонов как можно более одинакова (+/- 15 нт).


С концентрацией (0.4 pm/20 мкл) понятно rolleyes.gif . А зачем выравнивать длину ампликонов, да ещё и с высокой точностью (+/- 15 нт) confused.gif ?
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 08.09.2009 09:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(Statin @ 08.09.2009 04:19)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо, про длину ампликонов это логично, но почему длинные праймеры, ведь чем длиннее праймеры, тем больше взаимодействий между ними?

Как ни странно, более длинные праймеры работают более эффективно в мультиплексе чем короткие с той же Т пл. С минимальной концентрацией праймеров, что-то около 0,1 мкМ каждого, тоже не возражаю - по ходу рптимизмции будете только увеличивать их в 2-3 раза для слабых полос.
Дельта G для 5-концевых (3-штрих) нуклеотидов далжна быть максимальной, в пределах от -7,5 до -6.0. (АТ-богатый 3-штрих конец).
Но основное слово, конечно, за остальной ПЦР системой, где оказалось важно добавлять побольше, в 2-3 раза, полимеразы... и т д.
Чё-то Генсек скромничает confused.gif с его-то опытом мультплекс-игр. smile.gif
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 10:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Энергия Гиббса это хороший момент, спасибо, а какое количество димеров между праймерами разных генов допустимо?
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 08.09.2009 11:03     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(Statin @ 08.09.2009 10:07)
Ссылка на исходное сообщение  Энергия Гиббса это хороший момент, спасибо, а какое количество димеров между праймерами разных генов допустимо?

Кто его знает confused.gif Чем меньше. тем лучше. smile.gif
Проблему димеров можно решить добавляя к 5-штрих концу "горбатого" праймера нематричной АТ-бог. последовательности в 8-12 н. При этом размер фрагмента, соответственно, увеличится.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 16:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Ъ @ 08.09.2009 07:53)
Ссылка на исходное сообщение 
Чё-то Генсек скромничает confused.gif  с его-то опытом мультплекс-игр. smile.gif


Некогда мне frown.gif . Платёжки заколебали! wall.gif
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 08.09.2009 18:37     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(Statin @ 08.09.2009 04:19)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо, про длину ампликонов это логично, но почему длинные праймеры, ведь чем длиннее праймеры, тем больше взаимодействий между ними?

Тут такая логика. Раз мы всяко не можем предсказать все залипушки при таком обилии праймеров, мы с залипанием боремся, снижая их концентрацию. Тогда длинна праймеров с точки зрения залипаемости уже роли не играет, т к возможности залипушек определяются числом праймеров, а не их длинной. Но чтобы праймеры при низкой концентрации эффективно липли куда надо, нужно их сделать длиннее.

При таком подходе главной проблемой многоплекса становится не залипание праймеров друг на дружку, а взаимная конкуренция (супрессия)ампликонов, где основной фактор, это длинна ампликона. Т е чтоб свести конкуренцию к минимуму, нужно их максимально выровнять. После 1х проб обычно приходилось корректировать концентрации праймеров. Т е дохлякам повышать до 25 нМ, а наиболее наглым снижать до 15 нМ.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 20:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Это понятно. Но перекосы в "мультовой" амплификации связаны не только с праймерами (что часто можно подправить регулировкой их концентрации). Не менее важно (если не более) торможение полимеразы ампликонными шпильками rolleyes.gif . А с этим как будем бороться? shuffle.gif
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 08.09.2009 20:44     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

А никак :-)) В смысле-подбором. Все-голая эмпирика. На самом деле, у меня наибольшие трудности были с АТ-богатыми последовательностями.
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 20:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Спасибо за ответы. Еще вопрос, если длина ампликона хаускиппера 91 bp, а длина предполагаемых генов мишеней в одной группе 85-95 bp, другой группе 140-157 bp, имеет ли смысл сделать более длинный хаускиппер для второй группы генов.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 22:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(Yuri K @ 08.09.2009 18:44)
Ссылка на исходное сообщение  А никак :-)) В смысле-подбором. Все-голая эмпирика. На самом деле, у меня наибольшие трудности были с АТ-богатыми последовательностями.


На "эмпирику" деньги нужны weep.gif . А если их нет, то приходится побольше теоретизировать и поменьше экспериментировать rolleyes.gif .

Если теоретически, то пора с Taq переходить на Tli, Vent и прочие пирококковые полимеразы и их производные, отличающиеся не только исключительной термостабильностью, но и замещающей активностью, облегчающей преодоление шпилек.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Statin
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.09.2009 22:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Yuri K @ 08.09.2009 18:44)
Ссылка на исходное сообщение  На самом деле, у меня наибольшие трудности были с АТ-богатыми последовательностями.


А вот об этом желательно поподробнее. Недавно наблюдал что-то похожее - АТ-богатые ампликоны размножались явно хуже обычных wall.gif . Будем понижать температуру удлинения, или как?
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 09.09.2009 16:09     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(Statin @ 08.09.2009 20:48)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо за ответы. Еще вопрос, если длина ампликона хаускиппера 91 bp, а длина предполагаемых генов мишеней в одной группе 85-95 bp, другой группе 140-157 bp, имеет ли смысл сделать более длинный хаускиппер для второй группы генов.

Если хаускипер будет тянуть одеяло на себя с более длинными ампликонами, я б сначала попробывал уменьшить концентрацию евонных праймеров, т к это быстрее и дешевле (они у вас уже есть!). Если не поможет, тогда придется удлиннить его ампликон.
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 09.09.2009 16:27     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(genseq @ 08.09.2009 22:29)
Ссылка на исходное сообщение  На "эмпирику" деньги нужны weep.gif . А если их нет, то приходится побольше теоретизировать и поменьше экспериментировать rolleyes.gif .

Если теоретически, то пора с Taq переходить на Tli, Vent и прочие пирококковые полимеразы и их производные, отличающиеся не только исключительной термостабильностью, но и замещающей активностью, облегчающей преодоление шпилек.

Ну не так вс мрачно. На навороченных полимеразах вы потеряете те самые деньги, которые выручите на эмпирике. На самом деле, доводка не столь уж трудоемка, т к бОльшая часть работает с 1го раза. Какое-то время я развлекался, тасуя панельки СНИПов в разных произвольных сочетаниях, и никаких проблем не возникало. Обычно рутина у меня была такая. Сначала смешивал праймеры в равных концентрациях и гнал ПЦР. Обычно на дюжину ампликонов попадался один уродец, который давал высокий фон (я тестировал дальше на Люминексе) за счет случайного залипания ампликона на пробу. Такого уродца приходилось переделывать (в смысле, не его самого, а менять ориентацию пробы на шарике на противопложную). Затем я подгонял концентрации праймеров в соответствии с полученным сигналом и тестировал снова. После этого панелька была практически готова. Иногда оставалась пара СНИПов, которые не работали вообще, но я обычно выбирал СНИПы с запасом, так что сильно по этому поводу не парился. Если было настроение или это были маст рид СНИПы, тогда передизайнил праймеры.

Проблему АТ-богатых в мультиплексе я решить в общем виде не успел, к сожалению (как я сумел решить это с моноплексным Амплифлором). Но следовал своей прежней логике: праймеры могут быть сколь угодно длинными, хоть 45-ки, лишь бы Тм была нужная. Иногда это помогало, иногда нет.

Я должен отметить еще один момент. Для панелек СНИПов задача проще, т к количество копий ДНК-таргета для всех ампликонов одинаково. Для других задач супрессия будет сильно мешать.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Statin
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.09.2009 18:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

"Я должен отметить еще один момент. Для панелек СНИПов задача проще, т к количество копий ДНК-таргета для всех ампликонов одинаково. Для других задач супрессия будет сильно мешать. "

Мне как раз нужна количественная ПЦР (экспрессия генов), поэтому, видимо, придется использовать дорогие полимеры. Мне гораздо важнее сохранить исходный материал, и не изводить его на эксперименты.
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 09.09.2009 21:01     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Причины супрессии малопонятны, и не факт, что альтернативные полимеразы вам в этом деле помогут.
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.09.2009 21:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Я имел в виду проблемы не с АТ-богатыми праймерами, а с АТ-богатыми ампликонами. Твёрдой уверенности пока нет, но зреет ощущение, что уровень их накопления ниже, чем у обычных матриц. Если так, то замена полимеразы вполне может помочь (не обязана. но шанс есть).

Что касается сравнительной дороговизны пирококковых ДНК-полимераз, то для мультиплексов это не самая существенная статья расходов.
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 09.09.2009 22:48     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(genseq @ 09.09.2009 21:58)
Ссылка на исходное сообщение  Я имел в виду проблемы не с АТ-богатыми праймерами, а с АТ-богатыми ампликонами. Твёрдой уверенности пока нет, но зреет ощущение, что уровень их накопления ниже, чем у обычных матриц. Если так, то замена полимеразы вполне может помочь (не обязана. но шанс есть).

Что касается сравнительной дороговизны пирококковых ДНК-полимераз, то для мультиплексов это не самая существенная статья расходов.

(1) Я вас так и понял. Но то и другое чаще всего вместе (2) Почему супрессия может зависеть от ТИПА полимеразы, это выше моего понимания. Но пробуйте, коли желание есть.
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 10.09.2009 09:38     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

(Yuri K @ 09.09.2009 22:48)
Ссылка на исходное сообщение  (1) Я вас так и понял. Но то и другое чаще всего вместе (2) Почему супрессия может зависеть от ТИПА полимеразы, это выше моего понимания. Но пробуйте, коли желание есть.

qPCR и мультиплекс-PCR не очень совместимы, ИМХО. Хотя делают. С экспрессией дальше диплекса (а третий хаускипер) я бы не стал связываться - воспроизводимость будет нулевая.
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 10.09.2009 09:41     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(Yuri K @ 09.09.2009 21:01)
Ссылка на исходное сообщение  Причины супрессии малопонятны, и не факт, что альтернативные полимеразы вам в этом деле помогут.

А альтернативные полимеразы тоже надо "знать в лицо". прежде чем планировать - в статьях все красиво. а на делее... frown.gif
Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость



 прочитанное сообщение 10.09.2009 16:04     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(Ъ @ 10.09.2009 09:41)
Ссылка на исходное сообщение  А альтернативные полимеразы тоже надо "знать в лицо". прежде чем планировать - в статьях все красиво. а на делее... frown.gif

Есть наборы, которые в мультиплесе дают результаты существенно лучше обычного Така, т е супрессия значительно ниже. Но в полимеразе ли там дело, не очень понятно.
Участник оффлайн! Statin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.09.2009 16:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

"qPCR и мультиплекс-PCR не очень совместимы, ИМХО. Хотя делают. С экспрессией дальше диплекса (а третий хаускипер) я бы не стал связываться - воспроизводимость будет нулевая. "

Видимо последую вашему совету, подобрать не пересекающие праймеры (или мало пересекающиеся) оказалось практически не возможно, ну 2 пары, ну 3 , а дальше все плывет...
Участник оффлайн! ffonilmerkon




 прочитанное сообщение 22.04.2021 11:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование
Вопрос
(genseq @ 08.09.2009 21:25)
Ссылка на исходное сообщение  Это понятно. Но перекосы в "мультовой" амплификации связаны не только с праймерами (что часто можно подправить регулировкой их концентрации). Не менее важно (если не более) торможение полимеразы ампликонными шпильками rolleyes.gif . А с этим как будем бороться? shuffle.gif



Добрый день, подскажите пожалуйста - в какой программе лучше смотреть ампликонные шпильки ?
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 25.04.2021 17:18     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

Смотря какой длины ампликон. Если не очень длинные то можно тот же OligoAnalyzer от IDT. Если длинное - то берите что-то для выравнивания РНКи, вроде RNAlifold.
Участник оффлайн! Шаолинь
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.05.2021 07:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(ffonilmerkon @ 22.04.2021 12:38)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день, подскажите пожалуйста - в какой программе лучше смотреть  ампликонные шпильки ?

у Миши Цукера DNAfold
Участник оффлайн! pesigiv519




 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.05.2021 12:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Thanks for the great post you posted. I like the way you describe the unique content. The points you raise are valid and reasonable. I am a tech support expert telling you about.


Paychex Flex Login >> Roadrunner email login >> Bitdefender Login >> Cash App login >> Cash App login >> Cash App login >> aol mail uk login >> aol mail uk login >> www.Amazon.com/mytv >> Amazon.com/mytv >> paypal login >> paypal login >> paypal login >> paypal login >> ebay login >> ebay login >> amazon Login >> www.amazon.com/mytv >> netflix login >> Spectrum email login >>  linksys smart wifi login >> cash app support >> cash app support >> turbotax login >>  Kaspersky login >> Kaspersky login >>  Kaspersky sign in >> Kaspersky sign in >> turbotax login >> netgear router login >> netgear router login  >> router login >> asus router login >> asus router login >> linksys router login >> linksys smart wifi >> cable one email login >> epson printer driver >> 192.168.l.l  >> amazon gift card >> msn login >> hotmail login >> msn hotmail >> hotmail login >> hotmail login >> craigslist phoenix >> skype login >> ourtime login >> godaddy email login >> godaddy email login >> godaddy email login >>epson printer drivers >> paypal customer service >> paypal customer service >> amazon gift card >> amazon gift card >> paypal login >> paypal login >> paypal login >> paypal login >> Netflix login >> how to buy bitcoin   >> spectrum email login   >> roadrunner email  login  >> twc  login   >> twcny.rr.com email   >> webroot login >> Garmin express update >>  Garmin Nuvi map update >>  Magellan gps map update >> Tomtom.com/getstarted >> Paypal login >> paypal goods and services  >> kfc gutscheine >> H und m >> Dominos coupons >> Dominos coupons >> xoom login >> paypal login >> mcafee.com/activate >> garmin connect login >> mcafee.com/activate >> magicjack login >>magicjack login >> mail.aol.com >> target gift card >> target gift card >> itunes gift card >> ebay gift card >> walmart gift card balance >> amazon prime credit card login >> TD Ameritrade login >> TD Ameritrade login >> PNC Online Banking login  >> PNC Online Banking login >> Anytime.com/activate >> pluto.tv/activate >> walmart gift card balance >> Aka.ms/remoteconnect >> Aka.ms/remoteconnect >> twitch.tv/activate >> twitch.tv/activate >> td bank routing number >> AmericanExpress.com/ConfirmCard >>  AmericanExpress.com/ConfirmCard >> paypal credit card login >> paypal mastercard login >> HBOMax.com/tvsignin >> 
HBOMax.com/tvsignin >> HBOMax.com/tvsignin >> Garmin.com/express >> Garmin.com/express >> eBay Einloggen >> Morgan Stanley login >> Bank of America login >> Bank of America login >> Wells Fargo login >> Wells Fargo login >> Chase online login >> skype online >> skype for business >> PayPal Login >> PayPal Login
Участник оффлайн! admin001
Участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.05.2021 09:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

https://is.gd/KJTZ9F
https://is.gd/ervbBt
https://is.gd/VCcOGh
https://is.gd/QRyu8s
https://is.gd/exTYe6
https://tinyurl.com/48uspjpw
https://tinyurl.com/x9y8fs55
https://tinyurl.com/jv4t4k83
https://tinyurl.com/arv9kka
https://tinyurl.com/y6hstx6e
https://tinyurl.com/k84yybrc
https://tinyurl.com/7zsyp4vd
https://tinyurl.com/hwu78f
https://tinyurl.com/yd7yku2v
https://tinyurl.com/75ev9um5
https://tinyurl.com/e8h8x768
https://tinyurl.com/944tw9cw
https://rb.gy/jf6jc9
https://rb.gy/fhhqvw
https://rb.gy/frokaw
https://rb.gy/uyhx1n
https://rb.gy/udjumw
https://rb.gy/32amgp
https://rb.gy/lpu6zu
https://rb.gy/3l6iea
https://rb.gy/xyfztk
https://rb.gy/5h2s6d
https://rb.gy/xax6qy
https://rb.gy/8zvgqt
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  01.06.2021 05:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  25.09.2021 06:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

http://replicarolexwatches.simpsite.nl/
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches
https://pastebin.pl/view/ab0e458a
https://mix.com/watcheshutukcom
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html
https://share.naturalnews.com/posts/3904099
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8
https://flipboard.com/@replicarolex24
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch
nigoal123
IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.02.2022 11:03     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

You can post an article 123สล็อต on LinkedIn with the platform's คาสิโนออนไลน์ article publishing tool dreamgaming where you're able to write แทงบอล and publish your own article เซ็กซี่บาคาร่า to share in-depth expertise

with your network. SA Gaming If the article publishing tool is หวย and contact information to engage with their readers QR Code available in your area สล็อตออนไลน์ here's what you'll need to nigoal123 do to post your own article on the platform.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 18:13
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft