molbiol.ru -> развал допамина

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* развал допамина -- или дофамина, если изволите --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

rempel
Постоянный участник

28.06.2007 23:09

URL #1

Ответ на этот вопрос должен быть хорошо известен узким специалистам.
Берём свежий стриатум из мышки, и хотим померить допамин (дофамин) и некоторые киназы (вестерном). Есть два стандарных метода гомогенизации образца - один для допамина, а дргугой для киназ. Для допамина мозг гомогенизируют в 0.1 М НСl а для киназ - в обычном нейтральном буфере с протеазными ингибиторами. Вопрос: нельзя ли схитрить (чтобы уменьшить количество экспериментов) и гомогенизировать образец в чём-нибудь одном, а потом поделить на две части и дальше мерить чего надо.
Скажем в кислоте, я боюсь киназы развалятся, а в нейтральном буфере, вероятно развалится допамин.
Разъясните пожалусйта.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

29.06.2007 10:49

URL #2

Допамин экстрагируют в кислом буфере, чтоб он там был в виде солянокислой соли и хорошо растворялся в воде при этом белки(киназы это тоже белки) в большинстве своем выпадают в осадок. С киназами так поступать нельзя они напрочь потеряют свою активность. Если вы проэкстрагируете материал буфером для киназ, то допамин скорее всего тоже проэкстрагируется , вопрос в количественности такой экстракции. Если вы затем затитруете часть экстракта концентрированной солянкой до рН=1 то ситуация в экстракте будет примерно такая же как с экстракцией солянкой. Но самое забавное в том что разницы особой нет разбить на две части исходный материал или экстракт. Что касается Допамина все еще зависит от того как вы его потом измерять будете.

все что я написал написано из общих соображений, а не на оснавании личного опыта общения с допамином.

Oleg Klychnikov
Постоянный участник
Moscow/Amsterdam->Leiden

29.06.2007 11:33

URL #3

если для вестерна, то все равно какой рН
главное, чтобы держать при низких пэашах недолго - проэкстрагировали,
крутнули, в осадок один кристаллик карбоната натрия, семпл буфер и на вестерн,
супер - на измерение допамина

rempel
Постоянный участник

29.06.2007 14:51

URL #4

(guest: ммм @ 29.06.2007 03:49)

С киназами так поступать нельзя они напрочь потеряют свою активность.

Спасибо, нет, киназы мы не планируем измерять по активности, их будем гонять на вестерне и определять антителами.
Макс

rempel
Постоянный участник

29.06.2007 14:57

URL #5

кристаллик карбоната натрия

Замечательно, спасибо, это сильно упрощает жизнь.
Всё принимается кроме кристаллика. Это очень странный шаг в количественных измерениях.
Хочется чего-нибудь более измеряемого, чем кристаллик. Мне кажется, что если вовсе кристаллик не добавлять, а просто залить обычным буфером - pH окажется той же, что и с кристалликом. Насколько я понимаю, у скажем 5 ul осадка с 0.1 N HCl буферная емкость маленькая, и если его разбавить пятикратным объёмом любого буфера, то буфер победит.
Поправьте, если я ошибаюсь!
Макс

Oleg Klychnikov
Постоянный участник
Moscow/Amsterdam->Leiden

29.06.2007 15:24

URL #6

можно еще сушить на лиофилке - солянка отлетит

в общем, низкий рН - это не есть большая беда, но кристаллик карбоната -
это такой дедовский способ, т.к. с ним никогда не переборщишь
и излишки тоже улетят

про осадок - не забудьте один или два раза взять супер, высушить
и тоже на Вестерн, чтобы просто быть уверенным, что высаживаете
количественно...

по поводу всяких вычислений - наверное Вы правы...
только, вот, на практике - сажаешь 20-30 проб... почти все
хороши, а две или три дают желтую окраску - т.е. образец все еще кислый...
почему так происходит? не знаю... сайнс-сакс

Сообщение было отредактировано Oleg Klychnikov - 29.06.2007 15:28

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

29.06.2007 15:29

URL #7

Макс, привет! Как поживаешь?

Летом будешь в Москве, позвони!

rempel
Постоянный участник

29.06.2007 15:30

URL #8

Кому звонить-то?

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

29.06.2007 15:35

URL #9

(rempel @ 29.06.2007 15:30)

Кому звонить-то?

Да мне, Твердому Знаку! Я же твой мейл знаю, сообщу все. Собираешься в Москву? Давида позовем, посидим..

rempel
Постоянный участник

29.06.2007 15:36

URL #10

(Oleg Klychnikov @ 29.06.2007 08:24)

можно еще сушить на лиофилке - солянка отлетит

спасибо, сегодня будем пробовать, не совсем так, но руководствуясь вышеуказанными соображениями. Попробуем так:
гомогенизировать клетки в 0.1 N HCl, поделить раствор на две аликвоты,
одну нейтрализовать трисом - заранее оттитровав, сколько нужно триса-основания на объём HCl. Можно было бы вычислить, но это высший пилотаж.
Кстати, какая pH у буфера для нанесения на вестерн?
Продолжаю: кислую аликвоту пустим на допамин, а нейтрализованную на вестерн.
И при этом будем надеяться на то, что за время гомогенизации на льду в 0.1 N HCl наши киназы не развалились, и на вестерне будут видны количественно.
Макс

rempel
Постоянный участник

29.06.2007 15:37

URL #11

(Ъ @ 29.06.2007 08:35)

Да мне, Твердому Знаку! Я же твой мейл знаю, сообщу все. Собираешься в Москву? Давида позовем, посидим..

Вот тут-то ты и раскололся! Ты никакой не твёрдый знак, а типичный спамовый робот. Потому как Давид давно уже в Тбилиси!

Oleg Klychnikov
Постоянный участник
Moscow/Amsterdam->Leiden

29.06.2007 15:49

URL #12

обычно 6.8 такая же как и стекинга

http://wolfson.huji.ac.il/purification/Pro...s/Page_SDS.html

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

29.06.2007 15:49

URL #13

(rempel @ 29.06.2007 15:37)

Серъезно!

Я его видел 2 или 3 года назад на Ляпунова на остановке.

Переехал насовсем? Вот судьба-то как распоряжается! Грустно.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

29.06.2007 16:35

URL #14

Для нейтрализации 0.1М HCl потребуется примерно 0.1V 1М раствора трис-оснавания.

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

29.06.2007 21:39

URL #15

Max,

pKb of Dopamine is 8.98. Meaning, that any pH below 7 makes no difference.

rempel
Постоянный участник

29.06.2007 23:02

URL #16

(Yuri K @ 29.06.2007 14:39)

Max,

pKb of Dopamine is 8.98. Meaning, that any pH below 7 makes no difference.

Спасибо Юр. Ты пальцем покажи! Что из этого следует? Что можно не морочить себе голову с кислотой?

rempel
Постоянный участник

29.06.2007 23:13

URL #17

(Yuri K @ 29.06.2007 14:39)

Max,

pKb of Dopamine is 8.98. Meaning, that any pH below 7 makes no difference.

А может кислота добавляется для того, чтобы денатурировать МАО, которая съедает допамин?

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

30.06.2007 00:41

URL #18

(rempel @ 29.06.2007 23:02)

Спасибо Юр. Ты пальцем покажи! Что из этого следует? Что можно не морочить себе голову с кислотой?

Amines such as dopamine are more stable in protonated form (as salts). The pKb of amine equals pH at which the amine is half-protonated. So, 1 pH unit below pKb amine will be like 98% protonated or something. With pKb ~9, dopamine will be 100% protonated at any pH below 7 (i e, 2 pH units below pKb), so it makes no difference, if pH is 7, 4.5 or 2.

However, these guys claim that dopamine is easilly oxidised even at neutal pH

http://www.osti.gov/energycitations/produc...osti_id=7242234

Who the hell knows why?!

On the other hand, these guys kept dopamine in neutral pH. http://jbcs.sbq.org.br/jbcs/2003/v14_n2/17-228-02.pdf

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

30.06.2007 00:42

URL #19

(rempel @ 29.06.2007 23:13)

А может кислота добавляется для того, чтобы денатурировать МАО, которая съедает допамин?

Maybe...

nigoal123
IP-штамп: frAWeMdOsBSXM
гость

21.05.2022 08:31

URL #20

Writing an article takes บาคาร่าออนไลน์ a lot of effort on the slot xo side of the writer. 11hilo Content writers สล็อต freelance writers and 123GOAL copywriters are people

who have mastered the nigoal without which they ลิงค์รับทรัพย์ would not be able to พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง content for social media ราคา บอล make their mark as Hotgraph a writer of any kind.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.