Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Закладка сайта рестрикции в праймер -- нужен совет --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 11.10.2016 10:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день.
Посоветуйте пожалуйста где можно посмотреть информацию (или подскажите принципы) о том сколько нужно заложить дистальных нуклеотидов в праймере для конкретных (если я правильно понимаю есть различия) рестриктаз.
Заранее благодарен за помощь.
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  11.10.2016 10:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

NEB catalog

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 11.10.2016 10:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Правильно ли я понял что прибавлять надо 6 нуклеотидов? Спрашиваю потому что мне казалось что меньше, не хотелось бы делать праймер излишне длинным.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.10.2016 11:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Я 3 закладывал и работало. Образно говоря не меньше 2. На самом деле есть шанс и без них обойтись, но выход сильно снижается.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.10.2016 11:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

нет, вы неправильно поняли. для каждой рестриктазы - по разному. эта же инфа есть и в каталоге ферментас.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): borigv, dk
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.10.2016 11:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(MMM @ 11.10.2016 09:49)
Ссылка на исходное сообщение   На самом деле есть шанс и без них обойтись, но выход сильно снижается.

на надо вводить людей в заблуждение, а то из экономии не будут добавлять буквы и угробят потом кучу сил времени на клонирование.
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.10.2016 12:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(ship @ 11.10.2016 09:51)
Ссылка на исходное сообщение  нет, вы неправильно поняли. для каждой рестриктазы - по разному. эта же инфа есть  и в каталоге ферментас.

Нет уже давно такой фирмы Ферментас. Продались с потрохами Thermo Scientific.
Участник онлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 11.10.2016 13:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Я добавляю 3. Для некоторых рестриктаз написано, что необходимо больше, тогда больше.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 11.10.2016 14:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Спасибо за ответы, когда определюсь с выбором рестриктазы - буду более конкретно искать. Насчет 6 нуклеотидов - вывод сделал из ролика на сайте NEB, вероятно что-то не понял.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.10.2016 14:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(borigv @ 11.10.2016 12:32)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо за ответы, когда определюсь с выбором рестриктазы - буду более конкретно искать. Насчет 6 нуклеотидов - вывод сделал из ролика на сайте NEB, вероятно что-то не понял.

если вешать 6, ну тогда просто сайт рестриктазы два раза. типа gaattcgaattc
но это перебор конечно. пустая трата букв при синтезе.

если вы бы еще написали то, что вы хотите сделать (цель работы), то может еще какие полезные советы появятся.
я например все ПЦР продукты клонирую в тупые вектора, а уже оттуда - переклонирую в конечные. плюсы - не надо вешать букв дополнительных, удобно секвенировать, всегда есть источник этог фрагмента в виде пплазмиды, можно добавить 2-3 сайта рестиркктаз - потом клонировать фрагмент в кучу разных векторов.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): dk, NMR-guy
Участник оффлайн! Tuco Ramires
Постоянный участник
Rio Grande



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  11.10.2016 15:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

https://www.neb.com/tools-and-resources/usa...f-dna-fragments

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 11.10.2016 15:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Уважаемый ship, в интересующем меня векторе имеется один сайт для PstI в удобном для меня положении, мне нужно вставить в этот сайт фрагмент около 800 (пока не посмотрел фланкирующих праймеров). Вот в принципе и вся задача.
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 11.10.2016 15:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Уважаемый Tuco Ramires, Вы, как обычно, отвечаете максимально полно, доходчиво и полезно. smile.gif Огромное Вам спасибо.

Сообщение было отредактировано borigv - 11.10.2016 15:34

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Tuco Ramires
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.10.2016 16:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(borigv @ 11.10.2016 13:33)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемый ship, в интересующем меня векторе имеется один сайт для PstI в удобном для меня положении, мне нужно вставить в этот сайт фрагмент около 800 (пока не посмотрел фланкирующих праймеров). Вот в принципе и вся задача.

то есть в обоих праймерах будет PstI? и клонировать будете по одному сайту? а с плазмидой что потом делать будете?
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.10.2016 17:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

а я никогда не парился и закладывал независимо от фермента 3 дополнительных буквы. это позволяет вести одноэтапное клонирование с обработкой ПЦР-продукта напрямую. если забудете добавить буквы, то заклонируете в два этапа, как пишет ship. но в вашем случае нужно еще будет проверить ориентацию вставки в векторе, если вам для экспрессии.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 12.10.2016 09:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Уважаемый ship, Вы все верно поняли, в обоих праймерах предполагается сайты рестрикции. Внутри клонируемого фрагмента ген Т7-полимеразы под lac-промотором. В нужный момент надеюсь запустить экспрессию.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 12.10.2016 14:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

ну по клонированию все понятно. не понятно только почему по одному сайту.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.10.2016 19:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

более того "внутри клонируемого фрагмента ген Т7 промотора и лак-полимеразы..." ложусь в дур-дом
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 12.10.2016 20:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

а я 9 добавляла всегда, именно чтобы не париться
3 бакса за 20 пар, а за 30 - 4, но зато никаких сомнений, что порезалось

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 13.10.2016 15:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Уважаемый ksm - Вы кончно же правы, описка, простите - гриппую и плохо соображаю.
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 13.10.2016 16:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Уважаемый ship, а какие "засады" могут ожидать в случае клонирования по одному сайту? Выбор был сделан по банальной причине - я сейчас выполняю эту работу не в генетической лабе и ограничен в выборе реактивов, не хочется покупать еще вторую рестриктазу ради двух реакций, хотел проскочить по дешевле.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.10.2016 17:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Ну, у вас фрагмент может как бы немного задом наперед вставиться

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 13.10.2016 17:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(borigv @ 13.10.2016 14:01)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемый ship, а какие "засады" могут ожидать в случае клонирования по одному сайту? Выбор был сделан по банальной причине - я сейчас выполняю эту работу не в генетической лабе и ограничен в выборе реактивов, не хочется покупать еще вторую рестриктазу ради двух реакций, хотел проскочить по дешевле.

ну вот ммм выше написал.
не знаю что у вас за вектор, как расположены генетические элементы и прочее, но обычно вставку клонируют все таки в каком то определенном направлении. если это конечно не просто заклонировать пцр продукт.
вам соответственно потом надо будет еще и ориентацию вставки ппроверять, для чего еще будут нужны телодвижения и дополнительные рестриктазы.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.10.2016 18:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

...либо дополнительный праймер "внешний", тогда ПиСиАром можно проверить

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 14.10.2016 10:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Спасибо,все вышеперечисленное я себе представляю. В моем случае и промотор и целевой ген находятся в клонируемом фрагменте. Я подумал что в таком случае не имеет большого значения направление фрагмента в векторе. Если я не прав - напишите мне пожалуйста, мне придется кое-что переиграть пока не поздно.
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 14.10.2016 11:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

Насколько все же полезно общаться с умными людьми! Подумал я над вашими словами и решил что действительно лучше взять два сайта рестрикции разными рестриктазами. Вы все были абсолютно правы, колупаться выбраковывая ложноположительных еще та морока.
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.10.2016 13:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

в принципе, вы правы, в вашем случае не имеет. но лучше следить, чтобы транскрипты на векторе и во вставке не "пересекались", а то РНК димеры появятся.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.10.2016 20:54     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

За много лет выяснилось, что NEB не всегда суперправ. В большинстве случаев для полилинкерных рестриктаз достаточно 6-7 нуклеотидов. Меньше - снижается эффективность. EcoRI жрёт и с одним, а может и без хвоста - но это уж не знаю. Но есть особо мерзкие ферменты - Nde I, Spe I, некоторые GC-шестёрки типа Apa I, которым этого мало и для них хорошо иметь оверхэнг в 12. Это же касается и большинства восьмёрок. Вообще rule of thumb - видите, что рестриктаза "странная" (ну, например, Nae I) - вешайте немного побольше, чем 6-10.

Почему в полилинкерах рестриктазы часто стоят ближе и всё работает - хороший вопрос. Может даже тема для изучения smile.gif Возможно, потому, что в таких случаях разрезание происходит стохастически, и если порезалась сначала "плохая" рестриктаза, то клонирование проходит, а если "хорошая", то плохая не режет, но мы этого не видим, потому что снижение эффективности на 50% в рутинном клонировании никак не заметить. А может, липкие концы, которые оставляет большинство рестриктаз, могут быть короче, чем тупые. В общем, простор для фантазии lol.gif

Сообщение было отредактировано Veshka - 14.10.2016 21:03

Всего благодарностей: 3Поблагодарили (3): borigv, dk, NMR-guy
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 15.10.2016 04:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

для SalI и NotI тоже надо вешать больше, чем заявляют каталоги, так для инфы.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 15.10.2016 15:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

на роль рестриктаз предполагается пригласить EcoRI и HindIII, надеюсь от них подвоха ждать не стоит.
Участник оффлайн! NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 15.10.2016 20:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

(ship @ 11.10.2016 16:40)
Ссылка на исходное сообщение  то есть в обоих праймерах будет PstI? и клонировать будете по одному сайту? а с плазмидой что потом делать будете?

Еще одну тему заведет что с ней делать. Хотя если концы тупые - то можно и по одному фигачить, с проверкой ориентации вставки ПЦР праймерами плазмида-вставка. Это самый дешевый и простой способ с первого раза что-то получить и не маяться оптимизацией отношений вставка-плазмида при лигировании. Если вырастет сотня колоний, из 20-30 на скрининге 2-3 будут всегда с залигированным инсертом в правильной ориентации. По крайней мере - у меня так было всегда.

Если по теме - если повесите мало - рестриктаза заингибируется этими сайтами и все вывалится из раствора. Или вообще не порежется. Советую лепить не менее 10 дистальнее сайта рестрикции.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 24.10.2016 19:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

ужас. стоко букв. В смысле, написано. По-русски. Надо было в разговор влезть раньше. Короче, так. Инфа в NEB по поводу, скоко букв вешать, относительно полезная- они на олиго-дуплексах тестили, что совершенно не одно и то же, что длинная ДНК- один конец типа бесконечный, другой короткий. Поэтому все работет не совсем так, как пишут. Всегда в последние лет дцать взял себе за правило- ВСЕГДА 4 буквы- безотносительно рестриктазы. ВСЕГДА работает, и в ПЦР-продуктах, и в синтетических дуплексах, тем более в векторах. Не надо тут огород городить

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 18.02.20 18:51
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft