Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* секвенирование ПЦР фрагментов
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
guest: Ольга
IP-штамп: frRsKmfNXTjbw
гость



 прочитанное сообщение 24.10.2016 16:15     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование
Вопрос
Подскажите пожалуйста можно ли для секвенирования использовать те же праймеры что и для получения ПЦР фрагмента? Необходимо секвенировать фрагменты хлоропластной ДНК. Нашли в литературе праймеры, при ПЦР с этими праймерами образуются у всех образцов ампликоны пример 550 bp. ПЦР фрагменты вырезали из геля и почистили на колонке. Хотели все уже отправить на секвенирование, но решили с полученными ПЦР фрагментами и теми же праймерами поставить повторное ПЦР. Но оказалось что ПЦР не прошел. После очистки ПЦР-фрагментов на колонках, делали проверку электрофорезом, все ОК.
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 24.10.2016 16:53     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

При ПЦР с ПЦР-продукта следует брать на порядок меньше матрицы. Может быть из-за этого у Вас не пошла реакция. А для чего Вы таким сложным путём пошли - вырезали гель и чистили продукт? Простое переосаждение "в мягких условиях" не проще ли было? Может, после очистки какие-то ингибиторы полимеразы остались.
А вообще сдайте пару образцов на сиквенс да посмотрите. Но если продукт гомогенный, а праймеры специфичные и не очень вырожденные - то всё должно отлично читаться (там всего-то 0,5 kb).

Сообщение было отредактировано dk - 24.10.2016 16:56
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 24.10.2016 16:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

В моем опыте это в принципе работает, но ненадежно - иногда сиквенс не очень чистый, а иногда вообще не срабатывает. При этом если взять праймеры внутри ПЦР продукта, то работает 100%.
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 24.10.2016 17:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Обычно работает без проблем. И всегда проще проверить, а вот если не сработает - тогда уже теории разводить smile.gif
Участник оффлайн! Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 24.10.2016 19:12     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Ольга,

1. разбавьте ПЦР продукт в 1000 раз и поставьте ПЦР,
2. Как правило сиквенс хорошо идет с исходных праймеров для получения сиквенируемого амплификата, но в ряде случаев сиквенс идет не хорошо, тогда достаточно сдвинуть праймер во внутрь на 1-2 буквы, это ваш случай, так как внутренние области могут не содержать консервативных участков для подбора праймеров. Проверяйте также температуру отжига праймеров в соответствии с требованиями производителя сиквенационного набора.

Сообщение было отредактировано Star - 24.10.2016 19:17
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 24.10.2016 19:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Может да, а может и нет. Все от праймеров зависит.
Для сиквенса требования для праймеров более жесткие чем обычно для ПЦР.
Посмотрите, например протоколы Колд Спринг Харбор для баркодирования.
Эти протоколы спецально для школьников разрабатывались. Для чайников.
Для баркодирования в ПЦР берут смесь длинных вырожденных праймеров, подходящих практически для всех растений. У всех прямых праймеров на 5' конце последовательность M13 Dir. А у всех обратных праймеров M13 Rev. После ПЦР на геномной ДНК выделяют нужную полосу из геля и шлют на сиквенс с M13 (Dir/rev).
Школьники так и растения и животных и инсектов баркодируют. История даже попала в прессу после того как эти тимуровцы прошлись по рыбным ресторанам Нью-Йорка и выявили жульничество с заменой дорогой рыбы на дешовые сорта. lol.gif
Участник оффлайн! Star
Постоянный участник
Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 24.10.2016 19:19     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(guest: Ольга @ 24.10.2016 17:15)
Ссылка на исходное сообщение  Подскажите пожалуйста можно ли для секвенирования использовать те же праймеры что и для получения ПЦР фрагмента? Необходимо секвенировать фрагменты хлоропластной ДНК. Нашли в литературе праймеры, при ПЦР с этими праймерами образуются у всех образцов ампликоны пример 550 bp. ПЦР фрагменты вырезали из геля и почистили на колонке. Хотели все уже отправить на секвенирование, но решили с полученными ПЦР фрагментами и теми же праймерами поставить повторное ПЦР. Но оказалось что ПЦР не прошел. После очистки ПЦР-фрагментов на колонках, делали проверку электрофорезом, все ОК.


кстати, еще метод - клонировать в Т-вектор, сиквенирвоать по стандартным (внешним) праймерам, очень хорошо работает для разных трудных случаев
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 24.10.2016 19:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

кстати, еще метод - клонировать в Т-вектор, сиквенирвоать по стандартным (внешним) праймерам, очень хорошо работает для разных трудных случаев

Если образцов десятки-сотни трудоемкость разко возрастает. В топку.
Guest
IP-штамп: frRsKmfNXTjbw
гость



 прочитанное сообщение 25.10.2016 08:54     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Спасибо большое. Пока попробуем поставить пробную ПЦР с разведенным ПЦР-продуктом и переосаждение в мягких условиях.
Участник оффлайн! nit




 прочитанное сообщение 25.10.2016 12:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Все зависит от последовательности и праймеров.
Хлоропластная ДНК АТ-богатая, с АТ трактами, с нее вообще может плохо ПЦР идти. Бигдай вообще может ерунду выдать на сиквенсе.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 22.02.20 13:14
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft