Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Регулируемая димеризация белков -- можно ли посмотреть Вестерн блотом? --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 26.10.2016 19:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Коллеги, нужна подсказка по сабжу. Суть такова - есть клонтековский кит (http://www.clontech.com/IT/Products/Inducible_Systems/Protein-Protein_Interactions/Heterodimer?sitex=10023:22372:US), с помощью которого сделано 2 белковых конструкции с разными доменами (DmrA и DmrC), отвечающими за гетеродимеризацию в присутствии аналога рапамицина (AP21967). Все это засовывается в клетки.
Нужно посмотреть димеризацию на Вестерне, что пока никак не удается - ни в лизате, ни после иммунопреципитации комплекса не видно, детектируются лишь 2 исходных белка по отдельности.
Не могу понять, димеризация тупо не происходит, или комплекс разваливается при лизисе (в буфере с Тритоном 1%), или в процессе фореза.
В общем, прошу совета, как это можно посмотреть.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 26.10.2016 20:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А вы надеетесь увидеть нековалентный и ничем не кросс-сшитый димер после фореза с СДС или все таки форез нативный?
Вообще для этого не нужны киты. На один белок FLAG, на другой myc - и делаете ИП. можно ИП в обе стороны, и за myc и за ФЛАГ.
в целом, 1% Тритон может быть многовато.
Guest
IP-штамп: frf8MN7DG8LAQ
гость



 прочитанное сообщение 26.10.2016 21:28     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Да про ИП это все понятно, тут дело в другом. Нужна индуцированная димеризация.
Да, в идеале комплекс должен быть виден и с СДС на блоте. По крайней мере, одну такую статью я видел, там был обычный форез по Лэммли.
Тем не менее, форез я пробовал псевдо-нативный, т.е. по Лэммли, но без СДС. Вообще ничего не видно...
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 27.10.2016 01:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

тут контроль значит нужен, то что точно индуцируемо димеризууется и видно комлекс в тех условиях фореза, что вы делаете. в ките нет такого контроля случайно? или из статей взять.
и я бы все таки попробовал обычно ИП, так как лишнее подтвреждение в случае чего не помешает.
ну и тритон может все таки снизить? но тут надо и солюбилизацию белков проверить при снижении тритона
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.10.2016 07:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Если мне не изменяет память.В условиях SDS фореза разваливаются такие даже не димеры, а комплексы как: антиген-антитело, стрептавидин-биотин, и даже прионные амилоиды. Трудно представить себе не ковалентный белковый димер, который выдержит Лэмли форез. Хотелось бы почитать об этом. Ссылочку или саму статью обнародуйте.

Сообщение было отредактировано MMM - 27.10.2016 07:10
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.10.2016 09:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

"Да, в идеале комплекс должен быть виден и с СДС на блоте. По крайней мере, одну такую статью я видел, там был обычный форез по Лэммли." - скорее всего там ставили два направления: нативный, затем Лэммли - в таком отлично видны комплексы белковые и их компоненты
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 27.10.2016 16:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(MMM @ 27.10.2016 05:09)
Ссылка на исходное сообщение  Если мне не изменяет память.В условиях СДС фореза разваливаются такие даже не димеры, а  комплексы как:  антиген-антитело, стрептавидин-биотин, и даже прионные амилоиды. Трудно представить себе не ковалентный белковый димер, который выдержит Лэмли форез. Хотелось бы почитать об этом. Ссылочку или саму статью обнародуйте.


Статья вот. Рисунок 1Б.
Там использовался другой лиганд, для гомодимеризации, но принцип тот же.

Файл/ы:

скачать файл Marciniak_06.pdf
размер: 3.74мб
кол-во скачиваний: 65


Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 27.10.2016 17:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

нет там никакого комплекса димеров на блоте. смысл в том что, лиганд индуцирует димеризацию, а в димере киназа активна и трансфосфосфорилирует другой мономер, за счет чего появляется сдвиг полосы на Вестерне. и сдвиг там не особо большой, что тоже видно.
Вообщем на блоте виден шифт фосфорилированной киназы за счет фосфорилирования. А димера там нет.
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 27.10.2016 18:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

2 ship:
Да, вы правы. Все гораздо проще оказалось. Спасибо, что обьяснили.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 27.10.2016 19:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

пожалуста! в кои то веки вопрос интересный, а не про кривые рилтайм ПЦР
я раньше тоже пытался смотреть димеризацию киназы одной, так толком ничего и не вышло.
использовал ИП и двухгибридку.
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 27.10.2016 20:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

У меня задача на данный момент несколько сложнее.
Есть 2 белка, которые в принципе взаимодействуют. Один из них мембранный. ИП я уже делал после его оверекспрессии с флаг-тагом, второй белок потом нормально видно на блоте.
Странная идея начальства состоит в том, чтобы взять нокаутные по обоим белкам клетки (их уже тоже сделал) и засовать в них описанные выше конструкты с доменами для индуцированной димеризации. Чтобы, значит, по щучьему велению, т.е. при добавлении лиганда, все эти конструкты гетеродимеризовались.
И вся загвоздка в том, как эту димеризацию увидеть малой кровью, т.е. на Вестерне.
Видимо, надо делать нормальный нативный форез, типа BN-PAGE...
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.10.2016 21:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

А вопрос такой. Какой порядок константы связывания лиганда с комплексом? И лиганд как в клетку попадает из среды? Он сквозь клеточную мембрану проходит или он связывается с внеклеточным доменом одного из белков комплекса? Если один из белков комплекса без лиганда имеет не мембранную локализацию, а другой всегда в мембране, может в микроскоп тупо посмотреть добавили лиганд и ваш фьюжн с GFP тут же приплыл на мембрану. Можно собственно и второй белок тоже с каким нибудь другим флуоресцентным сфьжить или АТ покрасить, что бы показать колокализацию.

Сообщение было отредактировано MMM - 27.10.2016 21:44
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 27.10.2016 22:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Лиганд в клетку через мембрану свободно проходит. Константа для рапамицина порядка 0,5 нМ, для его аналогов должна быть близкой. Мембранный белок, о котором речь, он в мембране ЭР вообще.
С флуоресцентными тагами - да, должно работать. Более того, я это уже опробовал с другой парой белков. Но конкретно к этим флуотаги пока лепить не хочется в силу особенностей эксперимента.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 27.10.2016 22:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

мне кажется вам FRET подойдет. без лиганда по нулям, а налили индуцирующий лиганд - белки провзаимодейтвовали, и, опа, перенос энергии. и главное это еще и количественно можно померять, даже дозозависимо.
только надо конструкции под ФРЕТ переделывать.

с форезом и вестреном- мне кажется вам будет тяжело одновременно и солюбилизовать мембранный белок, и при этом еще и видеть комплекс.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 27.10.2016 23:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

А какая примерно концеентрация лиганда внутри клетки или хотябы в среде в условиях эксперимента?
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 27.10.2016 23:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

В среде от 10 нМ до 1 мкМ, по мануалу. Я пробовал от 250 нм до 1 мкМ.
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 28.10.2016 04:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Можно еще split TEV.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=split+tev+protease
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.10.2016 13:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Просто если вы возьмете низкую концентрацию лиганда в среде типа 10нм, то понятно, что в клетках больше 10нм вы не получите. Соответственно потом, когда вы будете делать лизат, вы еще все это разбавите и комплекс распадется сам собой. Поможет ли в этом случае увеличение концентрации в среде, гарантировать нельзя, до какой-то степени может помочь. Так же не очень понятно насколько на прочность комплекса повлияет электрофорез как меняется удельный заряд в комплексе относительно его компонентов? Но попробовать можно. Все ж довольно просто: берёте отовсюду убираете SDS, ничего не кипятите и пробу делаете мягким лизисом в гипотоническом буфере с 0,1-0,3% тритона в одном случае с добавлением лиганда в другом без и смотрите по двум антителам(или тагам, что там увас) окраску.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 29.10.2016 04:07     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Если белок мембранный, то при условии формирования димера, второй компонент должен ассоциироваться с мембранной фракцией в присутствии рапамицина и не ассоциироваться - в отсутствии.
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 04.11.2016 20:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Спасибо всем за комменты.
Продолжение истории такое - попробовал впервые в жизни поставить BN-PAGE, получил какую-то фигню.
По всем протоколам кол-во Coomassie G-250 в катодном буфере должно быть 0,02%. Однако, при такой концентрации сей буфер имеет насыщенный темно-синий цвет. Гель, соответственно, после фореза тоже был синий, и после мокрого переноса ожидаемо получилась равномерно синяя мембрана, с которой дальнейшие манипуляции проводить кажется бессмысленным.
Вопрос классический - что я делаю не так?
Мембрана, если это важно, нитроцеллюлозная.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.11.2016 17:19     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

(Serpent @ 04.11.2016 18:23)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо всем за комменты.
которой дальнейшие манипуляции проводить кажется бессмысленным.
Вопрос классический - что я делаю не так?
Мембрана, если это важно, нитроцеллюлозная.


А фиг его знает. Методика BN муторная, с кучей всяких предостережений, мне когда-то сразу не понравилась. Возьмите SYPO Ruby. Очень просто и эффективно.
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 14.11.2016 18:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Не совсем понял - для чего использовать SYPRO Ruby? Вместо кумасей для придания заряда белкам?

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 22.02.20 13:21
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft