Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Chertiaka |
Ситуация такая. Нашла на сайте селикса магнитные частицы с покрытием из стрептовидина. Подумала, а почему бы не использовать их для выделения биотинированных фрагментов ДНК, тем более что праймеры с биотином на конце имеются. И все бы хорошо складывалось - специфичность отличная, ПЦР-фрагменты вытаскиваются, да все в одной пробирке, получается, - да вот незадача, как отцепить этот фрагмент от магнитных частиц со стрептовидином, ну, непонятно! Нашла предложения по отмывке в очень жестких условиях: 6 M GuHCl, рН 1.5; вот только не уверена, как подобный раствор повлияет на ДНК и, что главное, чем потом от этого буфера бы ДНК отмыть. Может кто что посоветует? Сразу ответ на вопрос: почему не используем стандартные методы, типа выделения из агарозного геля с разделением и фенол-хлороформная очистка после? Потому что начальинк сказал попытаться отработать менее "опасный" для здоровья и трудоемкий метод. =/ Вот, ищу варианты поэтому. И, пожалуйста, реально нужен совет более опытных именно по решению данной проблемы, но не альтернативные решения. =/ Их я пыталась предлагать, завернули. =( |
MMM Постоянный участник |
Можно 4-8М мочевиной, можно Г-HCl или Г-НSCN концентрации 3-4М хватит. А избавляться гель-фильтрацией, или диализом или ультрафильтрацией. С гуанидиновыми солями можно использовать силку (силикатные колонки). От SDS тоже можно пробовать использовать гель-фильтрацию, диализ, ультрафильтрацию, но не силку, однако SDS этими способами удаляется с большим боем. На что надо обратить внимание: 1)Стрептавидиновые бидсы после этого умрут 2)раскрытый НЕ кольцевой дуплекс ДНК развалится и потом будет ренатурировать после удаления денатуранта. С SDS вроде дуплекс должен сохранятся. Можно смыть лиганд биотином(3-5мМ). Отмыть потом стрептавидин от биотина ооочень сложно. Сам лиганд от биотина чистить можно все теми же способами(переосаждение, диализ,гель-фильтрация, ультрафильтрация). Правда если это биотиновые зонды для гибридизации на тв. субстрате, то можно не избавляться, а просто промыть тв. субстрат SSC, после связывания. И на закуску вкусняшки: Так же есть мнение, что стрептавидин обратимо отпускает биотин при нагреве в воде до 70оС. Так же обратимо регенерирует использование кислого глицина-HCl с рН=2 |
Fury-of-Bury |
В прикрепленной статье подобный вариант описан. 2. Есть варианты с другими хим. в-вами, но тоже в суровых условиях (может для вас они более приемлемы): А фрагменты ПЦР они большие (я не делал ПЦР, не особо разбираюсь)? Если да, то можно подумать про диализ в мешках/центриконах для смены буера. Возможна быстрая обессоливающая хроматография на мелкопористом сефадексе/любом аналоге. Алсо, вы Сообщение было отредактировано Fury-of-Bury - 23.11.2016 16:52 Файл/ы:
|
ship Постоянный участник Moscow |
потому что улучшить "трудоемкость" у вас явно не получается. А менее "вредное" для здоровья - это просто глупость, вред будет если будете пить фенол или дышать его парами. |
Flyamer Постоянный участник Москва |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
И, да. Ок. Вы снесли биотинилированный продукт со стрептавидина. А клонировать что? С биотином на олиге вы там наклонируете. Значит, надо резать. А если нужен биотин на фрагменте то обычный ПЦР клининг кит на 100% работает. А если одна цепь, то только лямбда экзо, всё остальное - шлак. (По секрету) Иногда я вообще ничего не чищу. Просто хорошо отдизайненные праймеры и чистая полоска продукта. И денатурнуть отрезанные концы. И ещё приёмы есть . Для ленивых. Сообщение было отредактировано Veshka - 25.11.2016 01:32 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Биотин-авидиновая техника была придумана для последующих гибридизаационных извратов. А то, что Вы предлагаете это...это...даже не знаю как назвать, пардон. Что Вам нужно то в конечном итоге? Для чего синтезировали биотинилированные праймеры? А про фенол-хлороформную очистку ПЦР продуктов, кстати, впервые слышу. "Реального" совета по этой проблеме, видимо, Вы не услышите. |
Daemonarchestratygos Постоянный участник |
|
criplenie Участник |
|
Chertiaka |
criplenie, вам особенно.) Попробуем) |
MMM Постоянный участник |
(Chertiaka @ 12.01.2017 12:37) (MMM) И на закуску вкусняшки: Так же есть мнение, что стрептавидин обратимо отпускает биотин при нагреве в воде до 70оС. Так же обратимо регенерирует использование кислого глицина-HCl с рН=2 Написано 23 ноября, почти 2 месяца назад, в первом же ответе на ваш вопрос, а вы только сейчас после реплики "Срепления" Обратили внимание на можно сказать ключевую деталь |
Chertiaka |
В любом случае прогрев на 80* не помог пока.. =) |
MMM Постоянный участник |
Глицин, глицин, пробуйте глицин!!!! Сообщение было отредактировано MMM - 12.01.2017 17:05 |
Fury-of-Bury |
Файл/ы:
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |