Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Отодрать биотин от стрептовидина - как? -- очень нужен совет --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Chertiaka




 прочитанное сообщение 23.11.2016 15:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добра, коллеги.

Ситуация такая.
Нашла на сайте селикса магнитные частицы с покрытием из стрептовидина. Подумала, а почему бы не использовать их для выделения биотинированных фрагментов ДНК, тем более что праймеры с биотином на конце имеются.
И все бы хорошо складывалось - специфичность отличная, ПЦР-фрагменты вытаскиваются, да все в одной пробирке, получается, - да вот незадача, как отцепить этот фрагмент от магнитных частиц со стрептовидином, ну, непонятно!

Нашла предложения по отмывке в очень жестких условиях: 6 M GuHCl, рН 1.5; вот только не уверена, как подобный раствор повлияет на ДНК и, что главное, чем потом от этого буфера бы ДНК отмыть.

Может кто что посоветует?

Сразу ответ на вопрос: почему не используем стандартные методы, типа выделения из агарозного геля с разделением и фенол-хлороформная очистка после?
Потому что начальинк сказал попытаться отработать менее "опасный" для здоровья и трудоемкий метод. =/ Вот, ищу варианты поэтому.

И, пожалуйста, реально нужен совет более опытных именно по решению данной проблемы, но не альтернативные решения. =/ Их я пыталась предлагать, завернули. =(
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.11.2016 16:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

0,3% -0,5% SDS хватит, но от него избавляться проще всего переосаждением, а это я думаю вам не понравится.

Можно 4-8М мочевиной, можно Г-HCl или Г-НSCN концентрации 3-4М хватит. А избавляться гель-фильтрацией, или диализом или ультрафильтрацией. С гуанидиновыми солями можно использовать силку (силикатные колонки). От SDS тоже можно пробовать использовать гель-фильтрацию, диализ, ультрафильтрацию, но не силку, однако SDS этими способами удаляется с большим боем.

На что надо обратить внимание:
1)Стрептавидиновые бидсы после этого умрут
2)раскрытый НЕ кольцевой дуплекс ДНК развалится и потом будет ренатурировать после удаления денатуранта. С SDS вроде дуплекс должен сохранятся.

Можно смыть лиганд биотином(3-5мМ). Отмыть потом стрептавидин от биотина ооочень сложно. Сам лиганд от биотина чистить можно все теми же способами(переосаждение, диализ,гель-фильтрация, ультрафильтрация). Правда если это биотиновые зонды для гибридизации на тв. субстрате, то можно не избавляться, а просто промыть тв. субстрат SSC, после связывания.

И на закуску вкусняшки:
Так же есть мнение, что стрептавидин обратимо отпускает биотин при нагреве в воде до 70оС. Так же обратимо регенерирует использование кислого глицина-HCl с рН=2
Участник оффлайн! Fury-of-Bury




 прочитанное сообщение 23.11.2016 16:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

1. Возможно конкурентная элюция свободным биотином/инертным биотинилированным агентом -она будет происходить при комнатной температуре и нейтральном буфере, вопрос в скорости процесса и концентрациях.
В прикрепленной статье подобный вариант описан.
2. Есть варианты с другими хим. в-вами, но тоже в суровых условиях (может для вас они более приемлемы):
https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/bra...reptavidin.html

А фрагменты ПЦР они большие (я не делал ПЦР, не особо разбираюсь)? Если да, то можно подумать про диализ в мешках/центриконах для смены буера. Возможна быстрая обессоливающая хроматография на мелкопористом сефадексе/любом аналоге.

Алсо, вы тут можете просмотреть. Проблема распространенная на самом деле.

Сообщение было отредактировано Fury-of-Bury - 23.11.2016 16:52

Файл/ы:

скачать файл parrott2003.pdf
размер: 760.97к
кол-во скачиваний: 93


Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 23.11.2016 17:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Лучше все таки сформулируйте цель вашей работы. зачем выделять ПЦР продукты и что хотите с ними делать?

потому что улучшить "трудоемкость" у вас явно не получается. А менее "вредное" для здоровья - это просто глупость, вред будет если будете пить фенол или дышать его парами.
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 23.11.2016 17:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Проще и надежнее всего, думаю, протеиназой просто. Нагрев в чистой воде, вроде, тоже должен работать, но эффективность неясно какая будет...
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 25.11.2016 01:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Глупость вообще. Так и скажите своему начальнегу. А вообще - бегите нафек от таких ночальнегов. ПЦР-продукты чистятся на китах, очень эффективно. Идеально - на квиагеновских, на других тоже нормально. вдцать пять лет назад я тоже из агарозы чистил, кстати агароза тогда была намного чище. Не сейчас фсё, поезд давно ушёл. Все эти вырезания и отстрептавидинивания драматически снижаю эффективность клонирования.

И, да. Ок. Вы снесли биотинилированный продукт со стрептавидина. А клонировать что? С биотином на олиге вы там наклонируете. Значит, надо резать. А если нужен биотин на фрагменте то обычный ПЦР клининг кит на 100% работает. А если одна цепь, то только лямбда экзо, всё остальное - шлак.

(По секрету) Иногда я вообще ничего не чищу. Просто хорошо отдизайненные праймеры и чистая полоска продукта. И денатурнуть отрезанные концы. И ещё приёмы есть smile.gif. Для ленивых.

Сообщение было отредактировано Veshka - 25.11.2016 01:32
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 25.11.2016 12:00     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Такие начальники - такие времена-с... frown.gif Ну кто же в наше время с фенолом работает!
Биотин-авидиновая техника была придумана для последующих гибридизаационных извратов.
А то, что Вы предлагаете это...это...даже не знаю как назвать, пардон. confused.gif
Что Вам нужно то в конечном итоге?
Для чего синтезировали биотинилированные праймеры?
А про фенол-хлороформную очистку ПЦР продуктов, кстати, впервые слышу.
"Реального" совета по этой проблеме, видимо, Вы не услышите.
Участник оффлайн! Daemonarchestratygos
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.12.2016 04:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Наша практика показала, что 95% формамид с 10мМ ЭДТА (см. ссылку в сообщении Fury-of-Bury) действительно эффективно элюирует биотинилированные олиги со стрептавидиновых сорбентов при 65°C в течение нескольких минут. Далее биотинилированную ДНК можно осадить-промыть-подсушить-растворить (либо использовать центрифугируемую миниколонку, уравновешенную целевым буфером).
Участник оффлайн! criplenie
Участник



 прочитанное сообщение 28.12.2016 14:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Holmberg (2005) "The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures" - вот тут пишут что достаточно нагреть в воде до 70 градусов. Отлетает настолько хорошо что бусы можно использовать повторно.
Участник оффлайн! Chertiaka




 прочитанное сообщение 12.01.2017 11:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Большое спасибо за ответы.
criplenie, вам особенно.) Попробуем)
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.01.2017 13:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Chertiaka @ 12.01.2017 12:37)
Ссылка на исходное сообщение  Большое спасибо за ответы.
criplenie, вам особенно.) Попробуем)

(MMM)
И на закуску вкусняшки:
Так же есть мнение, что стрептавидин обратимо отпускает биотин при нагреве в воде до 70оС. Так же обратимо регенерирует использование кислого глицина-HCl с рН=2

Написано 23 ноября, почти 2 месяца назад, в первом же ответе на ваш вопрос, а вы только сейчас после реплики "Срепления" Обратили внимание на можно сказать ключевую деталь
Участник оффлайн! Chertiaka




 прочитанное сообщение 12.01.2017 16:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

MMM, хорошо, вам в первую очередь.
В любом случае прогрев на 80* не помог пока.. =)
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.01.2017 17:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Да, мне ничего не нужно. Меня просто удивляет ваш подход. Вы, когда вам отвечают, вообще слушаете? И для чего задаете вопросы? Ответы вас видимо не очень интересуют.

Глицин, глицин, пробуйте глицин!!!!

Сообщение было отредактировано MMM - 12.01.2017 17:05
Участник оффлайн! Fury-of-Bury




 прочитанное сообщение 22.02.2017 15:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Еще вот например

Файл/ы:

скачать файл BP_Magnetic_Beads_Immobilization.pdf
размер: 494.65к
кол-во скачиваний: 263



*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 24.02.20 05:00
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft