molbiol.ru -> Как выделить ДНК для ПЦР скрининга из небольшого числа клеток

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Как выделить ДНК для ПЦР скрининга из небольшого числа клеток

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

AnnaF

17.03.2010 12:19

URL #1

Нужен совет. Необходимо выделить ДНК для ПЦР скрининга из небольшого числа культивируемых клеток. Ячеек много, так что чем проще метод, тем лучше.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 12:27

URL #2

Из небольшого количества клеток ДНК для ПЦР-скрининга можно не выделять. Просто перенесите клетки в ПЦР смесь и вперед-вверх...

Поблагодарили (1): Atropos

RJ Dio
Постоянный участник

17.03.2010 12:29

URL #3

не, сначала их надо собрать, убрав культуральную среду, а потом ресуспендировав в мин. объеме, аликвоту этого объема- в ПЦР напрямую

Noom
Постоянный участник

17.03.2010 12:34

URL #4

Деньги на наборы есть? Если есть инвитрогеном выделяйте - у них есть весьма забавные схемы выделения днк для пцр. Первая с магнитными частицами, вторая с сорбционным слоем в пцр стрипах. Там даже ничего крутить не надо - закапал в стрип пробу порушил, промыл носиком, и капаешь туда мастермикс.
Если денег нет то в лоб лизируйте с протеиназой К и детергентами (Np40 + Tritonx100 в TE) в соотношении по объему проба-лиз.буфер не более чем 1:10.

AnnaF

17.03.2010 12:34

URL #5

клетки эукариотические...

Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург

17.03.2010 12:38

URL #6

Обсуждали уже. Поищите по темам.
Лично я делаю так:
К осадку клеток добавляем 50мкл 5% Chelex 100 (BioRad)
Вортекс 10 сек
Инкубируем 20мин - 95градусов. Периодически делаем вортекс.
Крутим 3000g 5 мин
Отбираем супер в новую пробирку.

Из 2мкл супера ПЦР идет ОК. Минимальное количество клеток, которое я брал на ПЦР - 1000 штук. Если еще поколдовать, то можно довести и до 100 клеток, но вам это скорее всего не нужно т.к. в лунке обычно можно нарастить до 0,2 - 0,5млн клеток.

Поблагодарили (1): -Ъ-

Noom
Постоянный участник

17.03.2010 12:38

URL #7

2Анна: и?

Сообщение было отредактировано Noom - 17.03.2010 12:40

AnnaF

17.03.2010 12:45

URL #8

это я забыла добавить в самом начале

AnnaF

17.03.2010 12:48

URL #9

у нас вариант "если денег нет"
можете подробнее написать?

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 12:54

URL #10

(Noom @ 17.03.2010 13:34)

Действительно, забавные киты, особенно с сорбционным слоем. Я бы не купил, денег жалко...

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 12:56

URL #11

Делайте по прописи Demyanov - успех гарантирован. А клеток сколько?

Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург

17.03.2010 12:57

URL #12

Кстати, вот многие рекомендуют ПЦРить прямо с клеток. С эукариотами такой вариант у меня ни разу не получился.

AnnaF

17.03.2010 12:58

URL #13

проблема в 5% Chelex 100 (BioRad). у нас такого нет.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 12:59

URL #14

(Demyanov @ 17.03.2010 13:57)

Чуствительные к ингибированию ПЦР смеси - БСА введите.

Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург

17.03.2010 12:59

URL #15

Если вы в Питере, то могу дать.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 13:01

URL #16

(AnnaF @ 17.03.2010 13:58)

проблема в 5% Chelex 100 (BioRad). у нас такого нет.

Пишите мне в личку.

Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург

17.03.2010 13:03

URL #17

(-Ъ- @ 17.03.2010 10:59)

Чуствительные к ингибированию ПЦР смеси - БСА введите.

Дело в том, что даже намека на фрагмент нет. Мне кажется, что БСА врядли сможет так уж сильно улучшить ситуацию. Еще недавно пробовал кипятить в калийном ПЦР буфере вместо Хелекса. Тоже не получилось. Вобщем хелекс для меня - метод выбора.

RJ Dio
Постоянный участник

17.03.2010 13:16

URL #18

(Demyanov @ 17.03.2010 13:57)

если взять микс для ПЦР с крови, то должно получиться- ингибиторы одни и те же

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 13:18

URL #19

(Demyanov @ 17.03.2010 14:03)

БСА нужно много, очень много, до 5 мг/ мл.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 13:24

URL #20

(RJ Dio @ 17.03.2010 14:16)

если взять микс для ПЦР с крови, то должно получиться- ингибиторы одни и те же

http://www.evrogen.ru/products/PCR-kits/InBlood.shtml

AnnaF

17.03.2010 13:29

URL #21

выделение ДНК из фибробластов

Noom
Постоянный участник

17.03.2010 13:33

URL #22

Лениво % считать:

На 200 мл

Tris буфер 1М pH 8,3 - 4 мл
ЭДТА 0,5М - 0,8 мл
Triton 100 - 1 мл
NP40 (NONIDET P40) - 1 мл

Протеиназа К (100x=10 мг/мл в 50% глицерине) добавляете перед лизисом из расчета 1:100.

Полтора часа при 55 раз в 20-30 минут перемешивайте на вортексе,
потом 15 минут при 95.

Потом на 12000 rpm открутите (это для микроцентрифуги примерно 10000+g) и супернатант в ПЦР (1 к 6 нормально должно работать). Метод кондовый - недостаток в приличном разведении образца (примерно 1 к 10 чтобы ваш буфер в котором вы культивировали не помешал ПЦР и лизису).
После обработки образец достаточно уверенно стоит при +4 около недели (поскольку в буфере ЭДТА он зарастать у вас не должен). Если будете на хранение убирать лучше отобрать супер и далее либо морозить на -20 супер либо переосадить ДНК спиртом, промыть и хранить очищенную днк.

Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург

17.03.2010 13:36

URL #23

http://www.evrogen.ru/products/PCR-kits/InBlood.shtml

Если пришлете пробник, то обязуюсь попробовать его на кале (очень много ингибиторов).

Сообщение было отредактировано Demyanov - 17.03.2010 13:37

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 13:55

URL #24

(Demyanov @ 17.03.2010 14:36)

Если пришлете пробник, то обязуюсь попробовать его на кале (очень много ингибиторов).

будет классное испытание, но вопрос к RJ Dio. Я не знаю, в состоянии ли Евроген.

выдать пробник.

RJ Dio
Постоянный участник

17.03.2010 13:58

URL #25

не вопрос

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

17.03.2010 14:03

URL #26

Сделайте ченч -вы им ПЦР, а они вам - цитокин-микроколонки. Все будут довольны, а участники форума получат ценную информацию о продукции Еврогена.

RJ Dio
Постоянный участник

17.03.2010 14:06

URL #27

контакты имеются, при наличии интереса можно абс. все

Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург

17.03.2010 14:13

URL #28

(-Ъ- @ 17.03.2010 11:55)

будет классное испытание, но вопрос к RJ Dio. Я не знаю, в состоянии ли Евроген.

выдать пробник.

А я думал вы тоже оттуда. Сорри.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

18.03.2010 13:41

URL #29

(Demyanov @ 17.03.2010 15:13)

А я думал вы тоже оттуда. Сорри.

Я не оттуда, но уважаю... Просто заметил что, RJ Dio боится сослаться на Евроген

решил помочь человеку. Я считаю это нормально и никакая не реклама.

nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость

07.12.2021 11:28

URL #30

there are so many objectives แทงบอล of Article Writing on various สล็อต123 topics like society, nigoal123 persons, locations 123game rising-issues. คาสิโนออนไลน์ and technical developments.

It influences some readers. หวย and some may fail in audience เว็บ 123 perception because of messiness เว็บ 123 to least important. แทงบอลออนไลน์ in your article writing. สล็อต123 So, following the correct format of writing

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.