Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Alexei L Участник |
Итак, мне нужно воспроизвести этот опыт с имеющимся у меня оборудованием Что имеют авторы статьи: 1) платиновые электроды 2) нерв 3) маркер DiI 4) Блок питания для электрофореза EC-400 5) масло В статье они прикладывали электроды непосредственно к нерву по обеим сторонам, и давали напряжение (оптимум до 48V/см). Нерв был помещен в масло (изолятор), таким образом ток шел только через нерв. Смысл был в том что DiI (флуоресцентный липид) это катион и под действием электрического поля он будет двигаться от анода (+) к катоду (-) по мембране, если маркер DiI помещен у анода. В статье есть ньюанс - силу тока авторы в амперах не указали (и не контролировали?!!! как мне автор статьи написал), но их блок питания дает максимум 200мА. Что я имею в наличии: 1) Стальные электроды 2) образцы мышиного мозга 3) маркер DiI 4) Блок питания 0-5А (шаг 10мА), 0-30V (шаг 10мV), сила тока регулируется, напряжение регулируется 5) масло Я попробовал воспроизвести опыт прямо как в статье, но со стальными электродами (платиновых нет и не будет), но мозг расплавился уже на 10мА (минимальная сила тока). Я модифицировал схему, сделал как классический электрофорез, т.е взял две ванночки, залил физраствором, поместил туда стальные электроды, сделал мостик из агар-агара с мозгом внутри (агар-агаровый блок), и по бокам блока прикрепил фильтровалку, которая одним концом контактирует с агар-агаром, а другим с физраствором (замкнул цепь). На значениях 10мА вроде мозг не плавится, хотя электролиз в растворе идет что парит. но есть проблемы - я электрофорез сам никогда не делал, и не уверен что у меня все правильно собрано, все мои знания о нем книжные. Хотел бы мнения спецов об своей схеме эксперимента, какие подводные камни и т.п. может и исходную схему авторов можно поправить под мои условия? Меня парит вот что - напряжение на фильтровалке по краям блока (мерил тестером) выходит почти нулевое, хотя в растворе 30V, и сила тока не увеличивается регулятором (10мА), но увеличивается до 50-70мА если я почти вплотную вручную приближаю мозг к стальным электродам. Так что я даже не уверен идет у меня ток через мозг или нет. может агаровый блок и не нужен, может напрямую фильтровалку к срезам мозга приложить что бы ток не гасился агар-агаром? все это надо проверять конечно но я уже 5 образцов потерял, и как то больше бы не хотелось. В общем жду мнений, советов, вопросов. Файл/ы:
|
Alexei L Участник |
|
LaBord Монреаль |
Кстати, имел опыт попыток повторения некоторых работ (из солидных изданий от авторитетных лабораторий) - как в оригинальных (описанных в статьях), так и осмысленно модифицированных (порой - многократно) вариантах. Воспроизводимость составила 0. В паре случаев довел до доказательного обоснования невозможности получения заявленных результатов при описанных объектах, методах и условиях. Где взять серебряные электроды? Подсказка шага 1 : покупается серебряная монета или ложечка... |
ksm Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
(ksm @ 19.04.2018 09:32) вот вот и непременно освясчается в ближайшей церкви.... |
Alexei L Участник |
|
LaBord Монреаль |
Сообщение было отредактировано LaBord - 20.04.2018 05:06 |
Alexei L Участник |
1) проводник агар-агар на физрастворе, контактирует с электродом и со срезом мозга 2) мозг с обрубленными концами, заключенный в агар-агар на дистилляете (изолятор), ток пойдет только через мозг в теории) 3) проводник агар-агар на физрастворе, контактирует с электродом и со срезом мозга У меня вопрос - мне кажется у агар-агара на физрастворе все таки хорошее сопротивление, может кто знает альтарнативу? |
ECH Участник |
|
Alexei L Участник |
"А смысл всего этого, да еще и на мыше?" - смысла нет вообще ни в чем (Виктор Пелевин). Вопрос был не о смысле, смысла нет в 99% научных работ которые чаще всего невоспроизводимы. Но это лирика. Смысл того о чем я спрашивал - разгон маркера электрическим полем, важно проверить принципиальную возможность этого, потому что по статье эта возможность неясна. По фото которые приведены в статье я не скажу что у них получилось, но сама задумка хорошая и ее надо проверить. "DiI использовали за неимением лучшего, и то как правильно написано в статье - для отслеживания периферических нервов" - ? DiI используют как маркер выявляющий тело нейрона со всеми нервными окончаниями, что не так? Метите нужное ядро мозга и смотрите в каких структурах выявились тела нейрнонов. Нерв просто использовали как удобный линейный объект, но возможности DiI гораздо шире, и DiI можно нанести в любую структуру мозга, а не ограничиватся периферийными нервами. " Для отслеживаний внутри ЦНС либо rabies используют, либо экспрессию флуоресцентного белка под специфическим промотором ядра или проецирующей структуры, если уж структура известна, причем это делают уже лет 15 как" - сразу видно писал молекулярщик))) - вирусы это стереотаксис, экспрессия генов под промотором - трансгенные мыши. Стереотаксису как методу инъекций в ядра мозга специфичных маркеров (в том числе и вирусов как варианта маркера) в целом не 15 лет а 50. На выходе как ни крути одно - выявить тела нейронов после инъекции в нужную структуру мозга. А теперь сравните стоимость стереотаксиса (нейрохирургическая операция), стоимость создания трансгенных мышей с флуоресцентным белком (хотя обычно используют инъекции HRP, PHAL, Fluoro-Gold и т.п но с помощью того же стереотаксиса), стоимость вирусных инъекций - и стоимость инъекции DiI в нужную структуру, и заодно можете поинтересоватся кпд всех этих методов. DiI это недорого и это его главное преимущество. "Курсовая работа с исходными DiI и срезом мозга? И пытаемся натянуть это на нерв в изоляторе т.е. сову на глобус?" - непонятное предложение. Мышиный мозг и метка в известную структуру с хорошо описанными связями - идеальный объект для проверки работоспособности метода. Или предлагаете проверять на структурах чьи связи не описанны? У меня есть объект который я хорошо знаю - мышиный мозг - на нем я и буду тестировать. Что не так? Вы можете что то посоветовать по поводу их методики, или предложите модификацию? Может вы сможете дать критику этой статьи по существу? Может вы можете что то сказать по поводу того какую силу тока и напряжение нужно подавать на объект что бы он не расплавился на электродах? Или посоветуете проводник вместо агар-агара на физрастворе? Я буду рад выслушать)) |
Stepan2 |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |