Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* RIPA against antibody ?
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 20.06.2004 01:23     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Тут решил сменить условия для IP, решил попрбовать РИПА следуюшего состава -
1% НП-40, 0.1%СДС, 0.5% дезоксихолат натрия, соли 0.15М и ингибиторры заварен на трисе 50 мМ, ph 7.5.
Почему-то после инкубации 2ч с антителами и два с бидцами и отмывок в рипе 5 раз, мало чего остаётся на бiдсах. есть подозрения, что это СДС с дезоксихолатом активничают так, буфер без них работает лучше , но с коил-коил богатыми белками лезет неспецифика.
Что-делать ? ( Chernyshevskii, copyright)

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! Remez
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.06.2004 23:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Правильно ли я понял. что на старом буфере RIPA все было хорошо, а теперь плохо. Но в чем разница между старым буфером и новым?Только ли присутствие SDS?

Для лизиса я обычно использую описанный Вами буфер (c NP-40 и деоксихолатом), но без SDS, а для отмывки беру буфер с NP-40 и SDS. RIPA у меня идет, но только для 50% антител. Мое впечатление, что если конкретное антитело не преципитирует, то сколько ни варьируй буфер и детергенты, успеха не будет. Как говорят физики, сколько поле не квантуй, все равно получишь ... волны.
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 21.06.2004 00:23     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Старыи буфер был не рипа, а простои без сдс и холата, с такои же сoлью , но с коил-коилд белками он давал неспецифику. Вот я и решил его заменить, наверно стоит сдс убрать вообше. Буду подбирать условия.
Если кто работал с коил-коил содержашими белками, может посоветуете хорошии буфер для ИП?
Участник оффлайн! Remez
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.06.2004 01:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

А что за антитела используются, моно или поликлональные?
Если моно, то я бы в первую очередь попробовал перейти на другое антитело.
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 21.06.2004 01:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Моноклоны, но к тагу и причем одни из них 9Е10, что вообшем странно.
ладно, есчио недельку помучаюсь, а потом шеф приедет и может чего подскажет есчио.
Anyway, thanks. smile.gif
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.06.2004 16:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Автор - J:
Моноклоны, но к тагу и причем одни из них 9Е10, что вообшем странно.
ладно, есчио недельку помучаюсь, а потом шеф приедет и может чего подскажет есчио.
Anyway, thanks.   smile.gif 
Что именно странно??? confused.gif
Не пугайтесь неспецифики в IP - она очень часто бывает - это нормально. Ставьте контроль обязательно с какими-нибудь другими АТ, желательно того же подтипа Ig. А то иммуноглобулины тоже любят на себя брать...
SDS - очень жестко, зачем? Если неспецифика, должно отмываться за 5 раз и без SDS. NP-40 достаточно.
А что собственно сoil-coiled? Главное чтобы белок растворимый был, в осадок не падал и чтобы АТ его узнавали в нативном виде. Если что-то из этого не так, то IP не выйдет.
Еще в RIPA часто сыпят ингибиторы фосфатаз. Но это зависит от цели. Вы о цели кстати не пишете.
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 21.06.2004 18:54     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

цель - показать взаимодеиствия разных белков между собои в зависимости от различных условии. Сначала я оверекспрессирую нужные мне гены, а потом смотрю как они взаимодеиствуют при добавлении третьего лица. Но беда с коил-коилами, под микроскопом видно что при оверекспрессии они аггрегируют, а без нее я не могу - для моих белков нет антител, а во вторых - я смотрю какие домены за что отвечают, поетому без оверекспрессии никуда. Промотор у меня слабенькии - ЛТР, по сравнению с ЦМВ, но всё равно проблемы с аггрегациеи. Ладно, попробую без СДС, а если не получится, то есчио что-нить попробую. Да инхибиторов я добавляю кучу, так что здесь всё ОК.
наверно дело было в СДС.

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.06.2004 19:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Автор - J:
цель - показать взаимодеиствия разных белков между собои в зависимости от различных условии.
[Текст переведён с транслита]
Кооверэкспрессию Hsp90/70 можно попробовать shuffle.gif шапероны - это правильно!
Но на самом деле, Biacore, surface plasmon resonance - вот Ваш метод!!! Если, конечно, имеются чистые рек-белки и возможности.
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 21.06.2004 19:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

нет, мне нельзя плазмонку, мне нужно знать влияние убиквитилирования. А с шаперонами - это вы зря, они тоже взаимодеиствуют с комплексом, которыи я изучаю и их оверекспрессия приводит к ингибировамию киназ внутри комплекса. Нет здесь всё не так просто, слишком много разных НО.

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.06.2004 19:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Ну, Hsp90 и Hsc70 - это не что-то такое чего в клетке нет. И может это киназы слишком активны в отсутствии шаперонов?
Дык, понятно, что всё не просто, иначе бы не интересно было.
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 21.06.2004 19:54     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Нет дело в том, эти шапероны аасоциированы с моим комплексом и он находится в негативном состоянии, при сигнале шапероны диссоциируют и возможна активация комплекса, механизм не известен, но тут и без шаперонов хватает проблем. Просто если я есчио и шапероны класть начну то вообше полныи гнездец начнётся. нетужки, мне нужны мои киназки активными. smile.gif

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.06.2004 20:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Напишите, если выйдет какой-нибудь варьянт с IP, интересно :-)
Участник оффлайн! Remez
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.06.2004 20:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

А Вы пробовали убрать неспецифику путем preclearing лизата на сорбенте с посторонними антителами (лучше трехкратную)?
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 21.06.2004 22:12     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

нет, я прецkлеаринг делаю один раз, 1 час при 4 градусах ---а что помогает?

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 21.06.2004 22:24     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Я вот думаю, что мне в копеечку обоидётся преклеаринг с посторонними антителами, так как придется тратить 100 мкл сорбента на точку (3 раза по 25 мкл на преклиринг и 25 мкл на преципитацию после первых антител), поетому шеф мне сказал делать преклиринг 4% агарозои. Если бы он не бы таким жадинои, то биш економным, может у меня проблем бы таких и не было. К тому же в МРЦи сеичас вводят другую систему заказов , она он-лаин, но до сих пор висит, и люди себе почт ничего заказать не могут, принимают только срочные заказы за подписью зав. департамента, вообше полныи гнездец. Так бы я себе давно купил бы сорбента по-больше. frown.gif
ладнои, делаю вывод, потом сообшу чего вышло.

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.06.2004 23:18     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

1.а клеточную локализацию что-то известно??? типа цитоплазма, ядро и т.д.???
2.Может тогда стоит расфракционировать клетки на цитоплазматический экстракт и ядерный?
3. и прогнать гель-фильтрацию чтоб уйти ( возможно) от агрегатов?

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 23.06.2004 02:10     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

1. Цитоплазма судя по микроскопии.
2. Комплексы 0.6- 1.2 МДа плус крупные аггрегаты встречаются иногда в клетках, степень аггрегированности у мутантов точечных отличается, что усложняет картину. frown.gif
3. гель филтрация надо сцале уже другои тогда, а я скринирую мутантов и разные условия, с неи тогда вообше запарюсь. попробую как-нить без этого.

если бы всё с ендогенными белками делать - одно, а понять механиzм, приходится ектопически експрессировать, тут и проблемы начинаются.
Буду долго и нудно подбирать условия для каждого белочка, видать.

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.06.2004 02:50     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

ну тогда я бы для начала точно попробовал бы сделать цитоплазменный экстракт и ядерный отдельно...
и еще поигрался бы солью уже после получения экстрактов....

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 23.06.2004 12:33     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

да, я так и делаю цитоплазменныи екстраkт, сегодня буду с солью играть, послезавтра узнаю до чего доигрался.

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 29.06.2004 21:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Не сработало! frown.gif
Значит, так всё сделал по методе, которую обнаружил в десятке статеи. Лизис буфер 0.15 М соль, 1% НП-40 , 20 мМ трис, ph 7.9-8.0 (изоелектрическая точка белка 5.5). Им промывал 1 раз, затем 2 раза им же, но с 0.65 М солью. затем ечшо раз с 0.15 М. После блота увидел, что мои белочек - НЕМО- крепко сидит на контрольном сорбенте и в опытном ( с преципитируемым белком), хотя другои белок - BclXl -взятыи для контроля и експрессируюшиися в таких же количествах и с таким же тагом - не липнет на сорбент.
У других людеи судя по статьям всё работает. Подозрение пало на сорбент. Я использую анти-моусеIg агаросе бидс от Сигма ( old sorbent they sold me ?), а люди в статьях ПротеинЖ-сефарозе, может ли это быть изза сорбента?
У кого какие соображения.
я следуюшим этапом попробую белокЖ, но терпения моего болше нет.
Есчио я попробую ультрацентрифугировать лизаты на 100000 g, хотя другие люди делают 15 мин на 10000 тысячах. Да, этото метод работает для некоторых белков, но с коил-коилд постоянно проблема.

[Текст переведён с транслита]

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 30.06.2004 16:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Печально, опять получили волны (квантуя)... Много антимышьIg-агарозы извели? Жалко? Но терпение - это в нашем деле главное, я вот тоже, преципитировал, копреципитировал, а потом забил и сделал SPR. Вам это не катит, я помню.

У меня была похожая байда - один из белков тупо залипал на PrA и сидел крепко гад. Но солью 0.65 M смывался однозначно, но вместе со всеми интересными мне интэрэкшэнами (Вы этого, кстати, не опасаетесь?). Раз Ваш белок не смывается такой солью можно предположить, что он аггрегирует, (иначе как он так специфично налипает на носитель?).

Два варианта: или он аггрегирует на бидсах (тяжелый случай) или выпадает в виде взвеси. В виде взвеси тоже плохо, потому что в этой взвеси могут оказаться все интересные Вам взаимодействия. И сколько от неё не отмывайся, она все равно будет садиться вместе с бидсами. Но от этой взвеси все-таки можно попробовать избавиться хитрыми центрифугированиями - бидсы садятся быстрее.

рН у Вас правильный, но от аггрегации не поможет, это не изоэлектрическое осаждение.

100,000g это, конечно, немало, но через три часа маринования там столько всего еще навыпадает, что смысл теряется.

Если белок аггрегирует, поможет ли Вам смена сорбента? Но всё в Ваших руках.

Соображения: контролировать агрегацию белков, чтобы понимать, что вообще происходит, добавить гицеринчику 1-5% во все буферы, уменьшить время маринования.

И принципиально другой вариант: сварить аффинную колоночку сефарозную (1-3 мл) с антителами и на неё ловить свои комплексы. Смысл в том, что всякая тупая неспецифика и аггрегаты на колонке и останутся, а Вы будете в элюате наблюдать только то, что реально растворимо.
Участник оффлайн! Коля2
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 30.06.2004 16:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

ИМХО оверэкспрессии без агрегации не бывает. Поскольку проблема только в очистке растворимого белка, то агрегаты надо тупо отбросить, а если весь белок в них уйдет - менять условия оверэкспрессии. Тогда наилучший выход предложил Том - поставить колонку с сефарозой 2В или 4В, на которой агрегаты будут отделены по молмассе. Агрегацию в ходе выделения и эксперимента потом контролировать глицерином.
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 30.06.2004 16:53     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Сл-ок а что тут еще скажешь ...
я бы тоже колонку попробовал бы сварить и то что раньше писал по поводу фракционирования екстракта...
и как последнее средство перед гильетиной это сахарозный градиент...

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 30.06.2004 18:13     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

Спасибо за вышеописанные советы, но я повторю что белком этим есчио сто лаб занято, по статьям они рутинно такие же преципитации с ним делали.
1. Про оверекспрессию - у меня ЛТР ,а у них ЦМВ промотор, которыи намного силнее, так что у меня не сильная оверекспрессия i 24 часа.
2. Они лизируют клетки (10000000 cells) в 0.5 мл буфера, а я намного разбавляю клеток (2 миллиона) в 0.5 мл.
3. Инкубирую 2 часа с антителом первым и 2 часа с сорбентом. Почему-то мне кажется , что замени я сорбент или проультрацентрифугируи и всё будет получше.
К сожалению, если я последую протоkолу с гельфилтрациеи, я не смогу это провести на своеи системе - так как я смотрю взаимодеиствия более десятка мутантов своего белка. Дороговато выидет и екстенсивно. Про колонку, это много их надо будет на каждыи мутант.
меня просто мучает вопрос как у других людеи получаются с ним преципитации, а у меня всё липнет. Вот и грешу пока на сорбент. Хотя опять же этот еффеkт толико с коил-коил белками лиш.
Попробую глицерин, конечно.
Опыт отложил пока на неделю, потом дам знать чего вышло.
Спасибо за помошь.


[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! Коля2
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 30.06.2004 18:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

У других и оверекспрессия другая. К тому же есть такая практика, не описывать "несущественные" предварительные стадии, как то озвучивание или осветление экстракта, чтоб конкурент не догадался. А набить пастеровскую пипетку сефарозой - стоит не более чем сама сефароза.
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 30.06.2004 18:44     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

с г/ф ясно что много возни...
может преинкубировать сорбент с каким нибудь БСА????
и я бы еще попробовал бы задрать соль до 0.2-0.3М и пропустил бы через q-сефарозу.... или через P-11
Da i ec'e mozhet byt' 2-Meo pomozhet s agregatami??? qdak 5mM...????


[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 30.06.2004 21:28     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

ДА, Я ПОМНЮ КАК-ТО МНЕ ЗАБИВКА С БСА ПОМОГЛА С ОДНИМ БЕЛКОМ, НАДО ПОПРОБОВАТь. УХ, БУДУ ПРОБОВАТь ДОЛГО, ЗНАЧИТ. frown.gif

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 01.07.2004 04:31     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

да и последнее наверное поставь IP с не иммунной сывороткой или не иммуными антителами....

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 07.07.2004 17:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Ну всё очереднои раз ерунда вышла. weep.gif weep.gif weep.gif
Система белков в 293 клетках - А-мик и Б-ау1 или Б-ау1 белок толико.
Лизирую в 1% НП-40, 150 мМ соль и 5% глицерин. Откручиваю лизаты на 10000 g 15 мин. Супер инкубирую для преклиринга с агарозои без антител 1 час. Осаждаю сорбент, супер использую дальше , инкубирую или не инкубирую с первичными антителами к белку А-мик ( 9Е10) 2 часа, откручиваю 5 мин на 10000 g от возможного преципитата, если таковои образуется.
Затем добавлаю к сорбенту: 1. анти-маус. 2. антимаус, забитыи 3% БСА 2 часа 3. Г-белок агароза. 2 часа в холоднои шеикерю. Отмывка - лизис буфером, затем с солью 0.65 мМ, затем опять лизис-буфером.
После блота реzултат:
Чистыи блот на G-бидс,
В остальных случаях с анти-маус бидс на блоте полоса Б-Ау1 белка visible лиш в случае лизата клеток, експрессируюших лиш белок Б, а не в случае Б-АУ1 и А-myc вместе. Интенсивность полосы B-AU1 самая сильная в случае сорбента без забивки с добавлением первых антител, 2 раза слабее с забивкои с добавлением первых антител , в 2 раза слабее с сорбентом без забивки и без первых антител.

Выводы:
1. Налицо неспецфическое связывание белка Б-ау1 с анти-моус , но не с G-бидс.
2. Первое антитела улучшают связывание белка Б с сорбентом, но все же это не позволяет увидеть специфичныи сигнал на дорожке , где А и Б kо-экспрессированы ???!!!
3. Забивка ухудшает неспецифическое связывание Б к сорбенту, но не полностью ( в 2 раза лиш).

Вопрос:
Стоит ли далше переити на другои сорбент как G-беадс, ведь там нет неспецифики, хота специфики тоже не было, увеличив количество преципитируемого белка больше лизата и мягче отмывать.

Какие будут советы???


[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 07.07.2004 19:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

Да, фигня.
0.65 мМ или все-таки 0.65 М?
Анти-маус агарозу в холодильник на дальнюю полку однозначно.
Вопрос: А белки (и тот и другой) в экстракте-то вообще есть после всех преклинингов? Блот по этому поводу поставлен? И в сравнимых ли количествах в лизатах клеток, експрессируюших лиш белок Б, и в случае Б-АУ1 и А-myc вместе (опять же после преклинингов? А то может Вы с первичными антителами-то трясете, а у Вас белки все на агарозу сели, или их разное количество shuffle.gif .

А там где чистый блот на G-бидс, антитела-то видно специпитированные (по Понсо хотя бы)? Если нет, то это 0.65 М соль все смыла вместе с антителами. Следовательно, исключайте стадию с 0.65 М солью или уж снижаете конц-ю umnik.gif . Сами видите, неспецифики с G-бидс меньше.

Главная ерунда у Вас пока ещё не вышла. Главная ерунда выйдет, когда Вы специфично и аккуратно спреципитируете А-мик и не увидите полосу B-AU1. А пока я бы на Вашем месте еще светился надеждами (и варил аффинную колонку с антителами к А-мик tongue.gif ).

Телеграфируйте, удачи.
Участник оффлайн! АНК
Участник
Moscow



 прочитанное сообщение 07.07.2004 19:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Привет! А Ты рН менял? Нам-то помогло ведь! smile.gif Так что если шеф попробует зажать G-beads, то можно еще включить одну промежуточную отмывку любым щелочным (9-10) или слабокислым (5-6) буфером - у нас это сработало, вся неспецифика свалилась. Почему так (заряд белка или гидрофобка), незнаю...
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 07.07.2004 20:14     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

2 Слоненок
Соль - 0.65 М ес-но
Лизаты инкубировал, преклеарил и даже потом инкубировал с аффиным сорбентом (ето контроль сорбент без антитела) и на последнеи стадии перед промывкои сорбента, я этот лизат сохранял, наносил на блот и все белочки там, jирненькие полоски как надо и у А и у Б. так что преkлиринг ничего с ними не делает.
Насчиот хорошести преципитации, надо прогнать гель, так как изначально я преципитировал мышиными, а красил кролочьими, ну покрашу мышиными конечно.
Насчиот главнои ерунды, в 5-ти статьях показано, что эти белки взаимодеиствуют, мне нужно подобрать условия для них, так как потом я буду тестировать мутанты белка Б.

2 АНК
Саша, у него изоелеkтрическая точка 5.5, смерти моеи хочеш, и вообше, где в клетке ( cytosol) ph 10? 8.0 должно работать - у других работает, по краине имере.

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! АНК
Участник
Moscow



 прочитанное сообщение 07.07.2004 20:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

1. Хорошо, не очень понятно, как PI будет влиять на неспецифическое связывание с сорбентом - это, помоему, зачастую, чисто эмпирические штуки..а вот перезарядка белка может его смыть, это просто одна дополнительная отмывка, перед элюцией белков (когда уже сложно говорить о нативности условий, когда та самая cytosol) уже давно отмыта.
2. Есть классный сорбент - Anti-c-MYC agarose conjugate, Sigma, A-7470, даже варить ничего не надо.
3. А буфер с другим детергентом, без СДС, так и не сработал?
4. Да, бывают грустные вещи - сам знаю лабу, где белок в контроле тщательно удалялся с помощью фотошопа...ну это, конечно, самое грустное...
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 07.07.2004 20:44     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

1. С ph9.0 надо попробовать в отмывке тогда.
2.Саша, я юзал анти-маус от Сигмы. frown.gif
3. Нет не сработал.
4. Ну это , ты понимаеш уже не наука, это они от бедности видать делали, вот и верь после этого чужим статьям. smile.gif
Ладно, скоро свидемся, там и обсудим.


[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 07.07.2004 20:54     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

На Г-бидс уже получил апрувал, шеф на неделю смотался, устрою тотальныи преципитец smile.gif

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! АНК
Участник
Moscow



 прочитанное сообщение 07.07.2004 21:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

Мы тут готовим список нужных реактивов smile.gif )) На самом деле, если будут интересные коммерческие плазмиды (например, для фьюженов с чем-нить зеленым или желтым smile.gif , привези, пожалуйста, аликвотки, на всякий случай smile.gif . До встречи!
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.07.2004 17:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

J: "Насчиот хорошести преципитации, надо прогнать гель, так как изначально я преципитировал мышиными, а красил кролочьими, ну покрашу мышиными конечно"

Зачем гель прогонять, возьмите эту самую мембрану и плюньте на нее антимышиного конъюгата. и смотрите. А вообще спреципитированные АТ должно быть видно по Ponceau.
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.07.2004 18:37     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

слоненок прав если нормально прошло по на понсо очень хорошо видно тяжелые цепи....


[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 08.07.2004 20:11     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

мембранки уже давно выкинул, так что гель прогонюсь снова, нот а биг дил smile.gif

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 10.07.2004 17:31     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

weep.gif

У меня закралось подозрение, где враг сидит.
Но сначала. Провел блот преципитатов, понсёи ничего кроме лизатов не увидел, видимо чувствительность не та. Покрасил блоты маусами , специфичными к тагам и анти-маусами вторыми.
На блотах толико там где добавлял к преципитатам первичное антитело, есть нормальные полоски иммуноглобулинов тяжелых и легких цепеи, легкие цепи видны очень и очень слабо. Г-агароза гораздо лучше преципитирует антитела и к мик и к ау1. Вижу, что белок Б-ау1 преципитируется на своё антитело случае обоих сорбентов, хотя слабо очень, а белок А - нет ( на своё антитело), то есть почему=то 9Е10 не сработали в ИП совсем. weep.gif
Я в последние 2 месяца добавляю в буфер НЕМ 0.5 мМ для устранения дэ-убиквитинирования, может это многовато и угнетает иммунопреципитацию?
Хотя в тагах цистеинов нет, они могут быть в активных центрах антител, 9Е10 скажем.
Вообшем, преципитация антител первых идет, но они почему-то плохо работают, я вот решил по совету местных людеи, поиграюся с % Тритона от 1 до 0.1, трис на хепес заменю, НЕМ пока выброшу.
А какие есчио будут советы? confused.gif

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.07.2004 16:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

Что за НЕМ такой, просветите. И выбросте для пробы хотя бы стадию с 0.65 М солью, а ту у Вас с водой и ребенок...
Участник оффлайн! слоненок
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.07.2004 16:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

А, млин, NEM, доперло, а я читаю ХЕМ, думаю что за байда!! насмешили!
Если NEM боитесь, поикубируйте с ним лизат (крутите с ним что б время зря не пропадало), а потом плюньте 5 мМ цистеинчику. Уж он-то не помешает?
Участник оффлайн! J
Постоянный участник
Цитадель Рос



 прочитанное сообщение 12.07.2004 17:12     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

2 Слоненок
Спасибо, цистеин учту. Но сделаю через месяц, я на каникулы ухожу.

[Текст переведён с транслита]
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.10.2022 01:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

Таким образом сложившаяся ситуация ни коим образом не создает все необходимые предпосылки для утверждения новейших вариантов поиска решений. https://www.espacosilvestre.org.br/profile/bogdan19n/profile
Участник оффлайн! vadimchik152a
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.03.2023 11:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

Таким образом новая модель организационной деятельности укрепляет нас, в нашем стремлении улучшения идей по выходу из сложившейся ситуации. https://theventurecation.com/author/slava50b/

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 12:30
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft