Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
1% НП-40, 0.1%СДС, 0.5% дезоксихолат натрия, соли 0.15М и ингибиторры заварен на трисе 50 мМ, ph 7.5. Почему-то после инкубации 2ч с антителами и два с бидцами и отмывок в рипе 5 раз, мало чего остаётся на бiдсах. есть подозрения, что это СДС с дезоксихолатом активничают так, буфер без них работает лучше , но с коил-коил богатыми белками лезет неспецифика. Что-делать ? ( Chernyshevskii, copyright) [Текст переведён с транслита] |
Remez Постоянный участник Москва |
Для лизиса я обычно использую описанный Вами буфер (c NP-40 и деоксихолатом), но без SDS, а для отмывки беру буфер с NP-40 и SDS. RIPA у меня идет, но только для 50% антител. Мое впечатление, что если конкретное антитело не преципитирует, то сколько ни варьируй буфер и детергенты, успеха не будет. Как говорят физики, сколько поле не квантуй, все равно получишь ... волны. |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
Если кто работал с коил-коил содержашими белками, может посоветуете хорошии буфер для ИП? |
Remez Постоянный участник Москва |
Если моно, то я бы в первую очередь попробовал перейти на другое антитело. |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
ладно, есчио недельку помучаюсь, а потом шеф приедет и может чего подскажет есчио. Anyway, thanks. |
слоненок Участник Москва |
Автор - J: Что именно странно??? Моноклоны, но к тагу и причем одни из них 9Е10, что вообшем странно. ладно, есчио недельку помучаюсь, а потом шеф приедет и может чего подскажет есчио. Anyway, thanks. Не пугайтесь неспецифики в IP - она очень часто бывает - это нормально. Ставьте контроль обязательно с какими-нибудь другими АТ, желательно того же подтипа Ig. А то иммуноглобулины тоже любят на себя брать... SDS - очень жестко, зачем? Если неспецифика, должно отмываться за 5 раз и без SDS. NP-40 достаточно. А что собственно сoil-coiled? Главное чтобы белок растворимый был, в осадок не падал и чтобы АТ его узнавали в нативном виде. Если что-то из этого не так, то IP не выйдет. Еще в RIPA часто сыпят ингибиторы фосфатаз. Но это зависит от цели. Вы о цели кстати не пишете. |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
наверно дело было в СДС. [Текст переведён с транслита] |
слоненок Участник Москва |
Автор - J: Кооверэкспрессию Hsp90/70 можно попробовать шапероны - это правильно!цель - показать взаимодеиствия разных белков между собои в зависимости от различных условии. [Текст переведён с транслита] Но на самом деле, Biacore, surface plasmon resonance - вот Ваш метод!!! Если, конечно, имеются чистые рек-белки и возможности. |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
[Текст переведён с транслита] |
слоненок Участник Москва |
Дык, понятно, что всё не просто, иначе бы не интересно было. |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
[Текст переведён с транслита] |
слоненок Участник Москва |
|
Remez Постоянный участник Москва |
|
J Постоянный участник Цитадель Рос |
[Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
ладнои, делаю вывод, потом сообшу чего вышло. [Текст переведён с транслита] |
Tom1 Постоянный участник |
2.Может тогда стоит расфракционировать клетки на цитоплазматический экстракт и ядерный? 3. и прогнать гель-фильтрацию чтоб уйти ( возможно) от агрегатов? [Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
2. Комплексы 0.6- 1.2 МДа плус крупные аггрегаты встречаются иногда в клетках, степень аггрегированности у мутантов точечных отличается, что усложняет картину. 3. гель филтрация надо сцале уже другои тогда, а я скринирую мутантов и разные условия, с неи тогда вообше запарюсь. попробую как-нить без этого. если бы всё с ендогенными белками делать - одно, а понять механиzм, приходится ектопически експрессировать, тут и проблемы начинаются. Буду долго и нудно подбирать условия для каждого белочка, видать. [Текст переведён с транслита] |
Tom1 Постоянный участник |
и еще поигрался бы солью уже после получения экстрактов.... [Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
[Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
Значит, так всё сделал по методе, которую обнаружил в десятке статеи. Лизис буфер 0.15 М соль, 1% НП-40 , 20 мМ трис, ph 7.9-8.0 (изоелектрическая точка белка 5.5). Им промывал 1 раз, затем 2 раза им же, но с 0.65 М солью. затем ечшо раз с 0.15 М. После блота увидел, что мои белочек - НЕМО- крепко сидит на контрольном сорбенте и в опытном ( с преципитируемым белком), хотя другои белок - BclXl -взятыи для контроля и експрессируюшиися в таких же количествах и с таким же тагом - не липнет на сорбент. У других людеи судя по статьям всё работает. Подозрение пало на сорбент. Я использую анти-моусеIg агаросе бидс от Сигма ( old sorbent they sold me ?), а люди в статьях ПротеинЖ-сефарозе, может ли это быть изза сорбента? У кого какие соображения. я следуюшим этапом попробую белокЖ, но терпения моего болше нет. Есчио я попробую ультрацентрифугировать лизаты на 100000 g, хотя другие люди делают 15 мин на 10000 тысячах. Да, этото метод работает для некоторых белков, но с коил-коилд постоянно проблема. [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] |
слоненок Участник Москва |
У меня была похожая байда - один из белков тупо залипал на PrA и сидел крепко гад. Но солью 0.65 M смывался однозначно, но вместе со всеми интересными мне интэрэкшэнами (Вы этого, кстати, не опасаетесь?). Раз Ваш белок не смывается такой солью можно предположить, что он аггрегирует, (иначе как он так специфично налипает на носитель?). Два варианта: или он аггрегирует на бидсах (тяжелый случай) или выпадает в виде взвеси. В виде взвеси тоже плохо, потому что в этой взвеси могут оказаться все интересные Вам взаимодействия. И сколько от неё не отмывайся, она все равно будет садиться вместе с бидсами. Но от этой взвеси все-таки можно попробовать избавиться хитрыми центрифугированиями - бидсы садятся быстрее. рН у Вас правильный, но от аггрегации не поможет, это не изоэлектрическое осаждение. 100,000g это, конечно, немало, но через три часа маринования там столько всего еще навыпадает, что смысл теряется. Если белок аггрегирует, поможет ли Вам смена сорбента? Но всё в Ваших руках. Соображения: контролировать агрегацию белков, чтобы понимать, что вообще происходит, добавить гицеринчику 1-5% во все буферы, уменьшить время маринования. И принципиально другой вариант: сварить аффинную колоночку сефарозную (1-3 мл) с антителами и на неё ловить свои комплексы. Смысл в том, что всякая тупая неспецифика и аггрегаты на колонке и останутся, а Вы будете в элюате наблюдать только то, что реально растворимо. |
Коля2 Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
я бы тоже колонку попробовал бы сварить и то что раньше писал по поводу фракционирования екстракта... и как последнее средство перед гильетиной это сахарозный градиент... [Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
1. Про оверекспрессию - у меня ЛТР ,а у них ЦМВ промотор, которыи намного силнее, так что у меня не сильная оверекспрессия i 24 часа. 2. Они лизируют клетки (10000000 cells) в 0.5 мл буфера, а я намного разбавляю клеток (2 миллиона) в 0.5 мл. 3. Инкубирую 2 часа с антителом первым и 2 часа с сорбентом. Почему-то мне кажется , что замени я сорбент или проультрацентрифугируи и всё будет получше. К сожалению, если я последую протоkолу с гельфилтрациеи, я не смогу это провести на своеи системе - так как я смотрю взаимодеиствия более десятка мутантов своего белка. Дороговато выидет и екстенсивно. Про колонку, это много их надо будет на каждыи мутант. меня просто мучает вопрос как у других людеи получаются с ним преципитации, а у меня всё липнет. Вот и грешу пока на сорбент. Хотя опять же этот еффеkт толико с коил-коил белками лиш. Попробую глицерин, конечно. Опыт отложил пока на неделю, потом дам знать чего вышло. Спасибо за помошь. [Текст переведён с транслита] |
Коля2 Постоянный участник |
|
Tom1 Постоянный участник |
может преинкубировать сорбент с каким нибудь БСА???? и я бы еще попробовал бы задрать соль до 0.2-0.3М и пропустил бы через q-сефарозу.... или через P-11 Da i ec'e mozhet byt' 2-Meo pomozhet s agregatami??? qdak 5mM...???? [Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
[Текст переведён с транслита] |
Tom1 Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
Система белков в 293 клетках - А-мик и Б-ау1 или Б-ау1 белок толико. Лизирую в 1% НП-40, 150 мМ соль и 5% глицерин. Откручиваю лизаты на 10000 g 15 мин. Супер инкубирую для преклиринга с агарозои без антител 1 час. Осаждаю сорбент, супер использую дальше , инкубирую или не инкубирую с первичными антителами к белку А-мик ( 9Е10) 2 часа, откручиваю 5 мин на 10000 g от возможного преципитата, если таковои образуется. Затем добавлаю к сорбенту: 1. анти-маус. 2. антимаус, забитыи 3% БСА 2 часа 3. Г-белок агароза. 2 часа в холоднои шеикерю. Отмывка - лизис буфером, затем с солью 0.65 мМ, затем опять лизис-буфером. После блота реzултат: Чистыи блот на G-бидс, В остальных случаях с анти-маус бидс на блоте полоса Б-Ау1 белка visible лиш в случае лизата клеток, експрессируюших лиш белок Б, а не в случае Б-АУ1 и А-myc вместе. Интенсивность полосы B-AU1 самая сильная в случае сорбента без забивки с добавлением первых антител, 2 раза слабее с забивкои с добавлением первых антител , в 2 раза слабее с сорбентом без забивки и без первых антител. Выводы: 1. Налицо неспецфическое связывание белка Б-ау1 с анти-моус , но не с G-бидс. 2. Первое антитела улучшают связывание белка Б с сорбентом, но все же это не позволяет увидеть специфичныи сигнал на дорожке , где А и Б kо-экспрессированы ???!!! 3. Забивка ухудшает неспецифическое связывание Б к сорбенту, но не полностью ( в 2 раза лиш). Вопрос: Стоит ли далше переити на другои сорбент как G-беадс, ведь там нет неспецифики, хота специфики тоже не было, увеличив количество преципитируемого белка больше лизата и мягче отмывать. Какие будут советы??? [Текст переведён с транслита] |
слоненок Участник Москва |
0.65 мМ или все-таки 0.65 М? Анти-маус агарозу в холодильник на дальнюю полку однозначно. Вопрос: А белки (и тот и другой) в экстракте-то вообще есть после всех преклинингов? Блот по этому поводу поставлен? И в сравнимых ли количествах в лизатах клеток, експрессируюших лиш белок Б, и в случае Б-АУ1 и А-myc вместе (опять же после преклинингов? А то может Вы с первичными антителами-то трясете, а у Вас белки все на агарозу сели, или их разное количество . А там где чистый блот на G-бидс, антитела-то видно специпитированные (по Понсо хотя бы)? Если нет, то это 0.65 М соль все смыла вместе с антителами. Следовательно, исключайте стадию с 0.65 М солью или уж снижаете конц-ю . Сами видите, неспецифики с G-бидс меньше. Главная ерунда у Вас пока ещё не вышла. Главная ерунда выйдет, когда Вы специфично и аккуратно спреципитируете А-мик и не увидите полосу B-AU1. А пока я бы на Вашем месте еще светился надеждами (и варил аффинную колонку с антителами к А-мик ). Телеграфируйте, удачи. |
АНК Участник Moscow |
|
J Постоянный участник Цитадель Рос |
Соль - 0.65 М ес-но Лизаты инкубировал, преклеарил и даже потом инкубировал с аффиным сорбентом (ето контроль сорбент без антитела) и на последнеи стадии перед промывкои сорбента, я этот лизат сохранял, наносил на блот и все белочки там, jирненькие полоски как надо и у А и у Б. так что преkлиринг ничего с ними не делает. Насчиот хорошести преципитации, надо прогнать гель, так как изначально я преципитировал мышиными, а красил кролочьими, ну покрашу мышиными конечно. Насчиот главнои ерунды, в 5-ти статьях показано, что эти белки взаимодеиствуют, мне нужно подобрать условия для них, так как потом я буду тестировать мутанты белка Б. 2 АНК Саша, у него изоелеkтрическая точка 5.5, смерти моеи хочеш, и вообше, где в клетке ( cytosol) ph 10? 8.0 должно работать - у других работает, по краине имере. [Текст переведён с транслита] |
АНК Участник Moscow |
2. Есть классный сорбент - Anti-c-MYC agarose conjugate, Sigma, A-7470, даже варить ничего не надо. 3. А буфер с другим детергентом, без СДС, так и не сработал? 4. Да, бывают грустные вещи - сам знаю лабу, где белок в контроле тщательно удалялся с помощью фотошопа...ну это, конечно, самое грустное... |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
2.Саша, я юзал анти-маус от Сигмы. 3. Нет не сработал. 4. Ну это , ты понимаеш уже не наука, это они от бедности видать делали, вот и верь после этого чужим статьям. Ладно, скоро свидемся, там и обсудим. [Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
[Текст переведён с транслита] |
АНК Участник Moscow |
|
слоненок Участник Москва |
Зачем гель прогонять, возьмите эту самую мембрану и плюньте на нее антимышиного конъюгата. и смотрите. А вообще спреципитированные АТ должно быть видно по Ponceau. |
Tom1 Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
[Текст переведён с транслита] |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
У меня закралось подозрение, где враг сидит. Но сначала. Провел блот преципитатов, понсёи ничего кроме лизатов не увидел, видимо чувствительность не та. Покрасил блоты маусами , специфичными к тагам и анти-маусами вторыми. На блотах толико там где добавлял к преципитатам первичное антитело, есть нормальные полоски иммуноглобулинов тяжелых и легких цепеи, легкие цепи видны очень и очень слабо. Г-агароза гораздо лучше преципитирует антитела и к мик и к ау1. Вижу, что белок Б-ау1 преципитируется на своё антитело случае обоих сорбентов, хотя слабо очень, а белок А - нет ( на своё антитело), то есть почему=то 9Е10 не сработали в ИП совсем. Я в последние 2 месяца добавляю в буфер НЕМ 0.5 мМ для устранения дэ-убиквитинирования, может это многовато и угнетает иммунопреципитацию? Хотя в тагах цистеинов нет, они могут быть в активных центрах антител, 9Е10 скажем. Вообшем, преципитация антител первых идет, но они почему-то плохо работают, я вот решил по совету местных людеи, поиграюся с % Тритона от 1 до 0.1, трис на хепес заменю, НЕМ пока выброшу. А какие есчио будут советы? [Текст переведён с транслита] |
слоненок Участник Москва |
|
слоненок Участник Москва |
Если NEM боитесь, поикубируйте с ним лизат (крутите с ним что б время зря не пропадало), а потом плюньте 5 мМ цистеинчику. Уж он-то не помешает? |
J Постоянный участник Цитадель Рос |
Спасибо, цистеин учту. Но сделаю через месяц, я на каникулы ухожу. [Текст переведён с транслита] |
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |