Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
AlexanderLopbio |
Посоветуйте пожалуйста DNAse с минимальной (без нее) RNAse активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей rtPCR. Спасибо. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Сообщение было отредактировано -Ъ- - 19.02.2013 09:56 |
Prefix |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
AlexanderLopbio |
PureLink® RNA Mini Kit (Ambion®). Попробую с ними. У меня еще пара вопросов появилась. Можно ли считать, что в mQ воде нет RNAse, либо необходима DEPC обработка в любом случае? У какого производителя в Москве посоветуете заказывать праймеры и пробы? Спасибо! |
xenopus Постоянный участник Moscow |
(AlexanderLopbio @ 19.02.2013 11:53) Можно ли считать, что в mQ воде нет RNAse? Можно, нету. Но это не значит, что РНКаз нет на руках, сэмплерах, эппах и проч... |
AlexanderLopbio |
|
kloun IP-штамп: frDDJret4PE4A гость |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(kloun @ 20.02.2013 11:19) |
Guest IP-штамп: fr2FbKna871ww гость |
(Prefix @ 19.02.2013 11:19) - судя по названию кита, BioMaxi предназначается для выделения РНК из крови. Или этот кит может использоваться и для других источников?
|
ASDF Постоянный участник |
ДназаТурбо реально мощная, но на колонке если просто РНК клеанАп делать не чистится. Ее обязательно прогреть надо. Если прогревать РНК не хочется (с добавлением ЭДТА конечно) к Турбе прилагается специальная смола. ПурЛинк должен достаточно чисто выделять. Можно добавить один степ и ДНазить прямо на колонке во время выделения. Ваша Дназа ферментас вполне подойдет. |
ship Постоянный участник Moscow |
все отлично работает, ДНКазой быстро и удобно обрабатывать тк на колонке все делается. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(ASDF @ 28.02.2013 12:38) Ъ , если что то у кого то где то не работает, это не значит, что продукт плохой. ДназаТурбо реально мощная, но на колонке если просто РНК клеанАп делать не чистится. Ее обязательно прогреть надо. Если прогревать РНК не хочется (с добавлением ЭДТА конечно) к Турбе прилагается специальная смола. ПурЛинк должен достаточно чисто выделять. Можно добавить один степ и ДНазить прямо на колонке во время выделения. Ваша Дназа ферментас вполне подойдет. Дыма без огня не бывает. Моё дело - показать, что с ДНКзой надо работать "с пониманием". А что за смола прилагается к Турбе? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(-Ъ- @ 28.02.2013 13:44) Дыма без огня не бывает. Моё дело - показать, что с ДНКзой надо работать "с пониманием". А что за смола прилагается к Турбе? For removing gDNA from a previously isolated RNA sample, the TURBO DNA-free™ kit provides an efficient solution. This kit combines the highly active TURBO DNase™ I enzyme and a novel reagent: TURBO DNA-free™ DNase Removal Reagent. This reagent removes the TURBO DNase™ I and divalent cations rapidly and effectively, eliminating the need to heat-inactivate the enzyme, which can lead to strand scission of the RNA. TURBO DNA-free™ DNase Removal Reagent also helps to reduce protein contamination and removes the need to use phenol:chloroform extraction, which can reduce the RNA yield from limiting samples. |
Guest IP-штамп: fr2FbKna871ww гость |
(-Ъ- @ 28.02.2013 12:53) -все так, и фермент отлично работает, но оговаривается, что даже небольшие следы этой инактивирующей смолы ингибируют последующие реакции.
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 28.02.2013 13:59) -все так, и фермент отлично работает, но оговаривается, что даже небольшие следы этой инактивирующей смолы ингибируют последующие реакции. Про смолу вроде все понятно если она также удаляет из среды другие белки и двухзарядные катионы - может напрочь ингибировать последующие реакции... |
ASDF Постоянный участник |
но ваш природный скепсис мне даже импонирует, сам иногда такой .. |
ASDF Постоянный участник |
(ship @ 28.02.2013 12:47) RNasy kit + on-column treatment with RNAse free DNAse set от QIAGEN. все отлично работает, ДНКазой быстро и удобно обрабатывать тк на колонке все делается. Принципиальная проблема этой связки - невозможно сделать на QIAcube. А куб это единственная причина, по которой стОит использовать дорогущий Киаген. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(ASDF @ 28.02.2013 14:43) Ъ, Да все нормально со смолой ))). она нормально откручивается и плотно сидит. Никаких проблем не доставляет. но ваш природный скепсис мне даже импонирует, сам иногда такой .. Дело в том, что я эту смолу 15 лет использую в своих китах для выделелния НК на финальной стадии элюции с сорбента. Ambion нагло своровал идею. под видом инактивации ДНКазы. Но мне не жалко. А клонированную Турбо ДНКзу видимо дешевле производить, чем нативную очищать от следов РНКаз. |
abdula Постоянный участник |
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33) Здравствуйте! Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР. Спасибо. вообщем деградация рнка - если делаете експрессию реал-таймом - на скорость не влияет - обратная транскрипция 15-мерами и суперскриптом-3 и вперед |
abdula Постоянный участник |
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33) Здравствуйте! Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР. Спасибо. вас должно напрягать натуральная деградация рнк ин виво , а не после выделения - да хоть рнказой обрабатуйте |
abdula Постоянный участник |
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33) Здравствуйте! Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР. Спасибо. если праймеры на соседних екзонах - зачем днказа ? |
abdula Постоянный участник |
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33) Здравствуйте! Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР. Спасибо. кстати ваш вопрос достаточно абстрактен - конкретно что хотите рт-пцрить ? ато может вы там на гептитах-ц или спидах балуетесь |
abdula Постоянный участник |
(AlexanderLopbio @ 18.02.2013 22:33) Здравствуйте! Посоветуйте пожалуйста ДНАсе с минимальной (без нее) РНАсе активностью, полностью инактивировалась при условиях инактивации, указаных в протоколе. Чтобы продукт реакции был пригоден для проведения обратной транскрипции и последующей ртПЦР. Спасибо. обратитесь к фрау зеленски - она у нас тут болший спец по диагностике рнка-вирусов - типа спида - топик три строчки вниз |
abdula Постоянный участник |
(abdula @ 28.02.2013 23:47) обратитесь к фрау зеленски - она у нас тут болший спец по диагностике рнка-вирусов - типа спида - топик три строчки вниз |
kloun IP-штамп: frDDJret4PE4A гость |
Пиццу развозить - не камильфо - пусть ваши начальники-индусы идут развозить Что можно сказать по гелю: Почему на такой выдержке такой слабый маркёр - или его мало или он разваливается. Не вижу праймеров на геле - они все выработались или их там не было, или они спрятались в облаке снизу? Вот интересно - что за хвост тянется из геля - это или геномка или тонны кДНКи - которая нарабатывается с одного рабочего праймера. Её много - что может убивать ПЦР само по себе - титруются праймеры и на образования продукта их уже не хватает. Отсутствие множества полос может говорить о том - что Тм ПЦРа высоковата - тогда один праймер просто не садится. Ну и контрольную РНКу нужно ставить в реакцию - это тут сказали. |
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
it sets the tone for |
nigoal123 IP-штамп: frpXPq5TOmUHs гость |
They are writing their |
guest: 123 IP-штамп: frJhOCvSv9ICE гость |
|
guest: 123 IP-штамп: frJhOCvSv9ICE гость |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |