Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Выделение ДНК из предельно малого количества клеток -- Подскажите способ выделения --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! nfc




 прочитанное сообщение 11.02.2010 13:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Уважаемые коллеги, прошу помощи знающих людей.
Столкнулся с задачей:
Есть 100-500 клеток (эпителиальных, человеческих) в 10 мкл воды,
Вопрос - как выделить из них ДНК, сохранив хотя бы большую ее часть?
Есть ли у кого-нибудь опыт очистки таких количеств ДНК?
В дальнейшем ДНК должна идти на ПЦР.
Пробовал разные микроколонки с сорбентами (типа QIAamp DNA Micro Kit)- не помогает...
Пробовал выделять данную ДНК из нормальных количеств материала и разводить до соответствующих значений - около 200 геномов ПЦР ловит однозначно.

Заранее спасибо за помощь.
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 11.02.2010 13:43     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А просто прокипятить 5 мин?
Участник оффлайн! plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...



 прочитанное сообщение 11.02.2010 13:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Пробовал разные микроколонки с сорбентами (типа QIAamp DNA Micro Kit)- не помогает...
А чем проверяли confused.gif ? Ни форез, ни нанодроп такое не прочует.
Да и вообще, о чем речь? Если надо на пцр, так и пцр-те прям с клеток.
Участник оффлайн! Paradox




 прочитанное сообщение 11.02.2010 13:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

если бы нужна была рнк, то как вариант

http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_612_85...perAmp_Kit.aspx
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.02.2010 14:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

можно использовать РНК-протокол по Хомчински, там ДНК всегда много, на ПЦР уж точно хватит. Но никаких сорбентов, малые кол-ва просто размажутся тонким слоем, ничего не смоете
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 11.02.2010 14:29     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Речь не о single cell, поэтому ПЦР прямо с клеток confused.gif может быть ингибирование:
1. Среду удалить ЦФ
2. Добавить 10-20 мкл 2-3% Chelex 100 в воде,
3. Довести до 95 оС,
4. ЦФ, а супер до 10 мкл на реакцию...
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.02.2010 15:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

коли такое дело- сравните оба подхода- с сорбентом и без, будет Вам опыт качественный
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 11.02.2010 15:05     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

-Ъ-, проблемы нужно решать по мере их поступления smile.gif
Участник оффлайн! nfc




 прочитанное сообщение 11.02.2010 15:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Проверял ПЦР-ом, элюат с колонки (20 мкл) в реакцию - пусто.
Насчет клеток без выделения - сам не пробовал, но говорят что лимфоциты работают, а с эпителием не проходит.
Думаю, надо попробовать с Chelex, спасибо за совет.
Попробую - отпишусь.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 11.02.2010 15:24     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(Mykhaylo @ 11.02.2010 16:05)
Ссылка на исходное сообщение  -Ъ-, проблемы нужно решать по мере их поступления smile.gif

Мудрые слова! beer.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 11.02.2010 17:13     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

протеиназу К можно привлечь на помощь Chelex100...
Участник оффлайн! TAOLI
Участник



 прочитанное сообщение 12.02.2010 19:41     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(nfc @ 11.02.2010 14:17)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые коллеги, прошу помощи знающих людей.
Столкнулся с задачей:
Есть 100-500 клеток (эпителиальных, человеческих) в 10 мкл воды,
Вопрос - как выделить из них ДНК, сохранив хотя бы большую ее часть?
Есть ли у кого-нибудь опыт очистки таких количеств ДНК?
В дальнейшем ДНК должна идти на ПЦР.
Пробовал разные микроколонки с сорбентами (типа QIAamp DNA Micro Kit)- не помогает...
Пробовал выделять данную ДНК из нормальных количеств материала и разводить до соответствующих значений - около 200 геномов ПЦР ловит однозначно.

Заранее спасибо за помощь.


Прикрепляю методики, которые используют в МВД.
С помощью некоторых из них (с chelex) ДНК выделяется даже из пятен крови на одежде размером несколько мм.

Файл/ы:

МВД.doc
размер: 1.09мб
кол-во скачиваний: 87
12.02.2010 — 26.02.2010

Участник оффлайн! nazen
Участник



 прочитанное сообщение 12.02.2010 19:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

рибо-преп... легко выделит. У меня из 10 клеток выделял.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.02.2010 21:44     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Это первоисточник про Chelex 100 и ДНК - это чтобы учасники дискуссии не подумали будто метод придумали минты:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1867860?dopt=Abstract
Это про кит на основе Хелекса:
http://www.biocompare.com/Articles/Applica...teps-Rev-C.html
Но есть и более продвинутый аналог, если кому интересно...
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.02.2010 21:46     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(nazen @ 12.02.2010 20:46)
Ссылка на исходное сообщение  рибо-преп... легко выделит. У меня из 10  клеток выделял.

Это глупо из 10 клеток выделять ДНК для ПЦР...
Участник оффлайн! TAOLI
Участник



 прочитанное сообщение 13.02.2010 12:02     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(plotter @ 11.02.2010 14:45)
Ссылка на исходное сообщение  А чем проверяли confused.gif ? Ни форез, ни нанодроп такое не прочует.
Да и вообще, о чем речь? Если надо на пцр, так и пцр-те прям с клеток.


Да действительно форез, и нанодроп такое может не прочувствовать. поэтому я бы сделал рециклинг: вначале 40-50циклов ПЦР, а потом заново навел бы ПЦР смесь (в качестве матрицы использовать ПЦР-продукт из 1-го ПЦР) и повторил бы еще раз 40-50 циклов. Или сразу поставить на большое количество циклов(циклов 60-70).
Участник оффлайн! nazen
Участник



 прочитанное сообщение 13.02.2010 16:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(-Ъ- @ 12.02.2010 19:46)
Ссылка на исходное сообщение  Это глупо из 10 клеток выделять ДНК для ПЦР...

Обоснуйте.
Участник оффлайн! nfc




 прочитанное сообщение 15.02.2010 12:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

CHELEX помог.
100 клеток работают, меньше не пробовал.
Всем спасибо!

Всего благодарностей: 3Поблагодарили (3): -Ъ-, Alonesin, Mianusman
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.02.2010 12:29     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Таким же образом можно получить вполне "рабочие лизаты для ПЦР" (имеется в виду не ингибирующие реакцию) из большего на порядок количества клеток, если перед Хелексом использовать Протеиназу К.
Так что, выделение ДНК - понятие "философическое". tongue.gif
Участник оффлайн! Demyanov
Постоянный участник
Санкт-Петербург



 прочитанное сообщение 24.02.2010 13:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

Что-то ментовский протокол не открываеться.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 24.02.2010 16:58     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

(Demyanov @ 24.02.2010 14:21)
Ссылка на исходное сообщение  Что-то ментовский протокол не открываеться.

У меня тоже не открывается.
http://swfsc.noaa.gov/uploadedFiles/Divisi..._Lab/Chelex.pdf
http://acta.otorrinolaringol.esp.medynet.c...acta_ing3/7.pdf
http://www.iwcoffice.org/_documents/sci_co...s/SC-61-SD2.pdf
Участник оффлайн! anybody




 прочитанное сообщение 18.07.2010 10:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(-Ъ- @ 12.02.2010 22:44)
Ссылка на исходное сообщение  Это первоисточник про Chelex 100 и ДНК - это чтобы учасники дискуссии не подумали будто метод придумали минты:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1867860?dopt=Abstract
Это про кит на основе Хелекса:
http://www.biocompare.com/Articles/Applica...teps-Rev-C.html
Но есть и более продвинутый аналог, если кому интересно...


да, очень интересно!!!! скиньте инфу плз!!!
Участник оффлайн! VVolkov
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2010 12:42     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

Название темы идиотское. Можно выделить из 1 клетки, а предельно малого числа не существует. Собственно возникают мысли, что дальше читать не надо - после названия.
Участник оффлайн! rikitiki
Участник



 прочитанное сообщение 18.07.2010 14:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

придурок появился - тему можно закрывать

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): VVolkov
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2010 17:47     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

(anybody @ 18.07.2010 11:51)
Ссылка на исходное сообщение  да, очень интересно!!!! скиньте инфу плз!!!

Какую конкретно инфу?
Если вы клюнули на "тот продвинутый аналог" - речь идет о готовом ките, о котором на форуме из-за рекламы ... ну сами понимаете. wink.gif
Пишите, пожалуйства, в личку.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2010 17:52     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(VVolkov @ 18.07.2010 13:42)
Ссылка на исходное сообщение  Название темы идиотское. Можно выделить из 1 клетки, а предельно малого числа не существует. Собственно возникают мысли, что дальше читать не надо - после названия.

Не лучше ли помолчать, коли нечего конкретного дабавить. confused.gif
Другое дело, если чешется... tongue.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2010 17:59     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

Да, цветочки не забудь добавить мне тоже. tongue.gif
Участник оффлайн! aslan39




 прочитанное сообщение 09.10.2018 20:35     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

состав лизирующего р.ра Рибо преп кто знает?
Участник оффлайн! KCN
Постоянный участник
Київ. Україна понад усе! / DELETED



 прочитанное сообщение 22.12.2018 20:25     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Можно попробовать, так , я сам не пробовал, но есть догадка (потому не судите строго):
Поставить ДНК-комету, прогнать форез, покрасить этидием бромидом, вырезать кусочек с ДНК, расплавить (вместо элюции) и кинуть на Hot Start PCR.

ДНК-комета

Hot Start PCR

Можно пробовать Hot Start сразу с клеток - прокипятить, охладить до температуры запуска Hot Start PCR (95, до 10 минут), а потом добавить полимеразу.
Смутно помню, но кажись один мой младший коллега когда-то амплифицировал клонированную вставку в вектор прямо с дохлой культуры E.coli.
Участник оффлайн! RNK
Постоянный участник
СССР



 прочитанное сообщение 22.12.2018 21:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

смотрите по кличевым словам, например:
"Non-invasive RNA/DNA skin sampling"

https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/ear...385120.full.pdf

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20883150
https://patents.google.com/patent/US8389215B2/en
Guest
IP-штамп: fr6P9QD2IlgOg
гость



 прочитанное сообщение 07.01.2019 13:44     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

(Paradox @ 11.02.2010 13:58)
Ссылка на исходное сообщение  если бы нужна была рнк, то как вариант

http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_612_85...perAmp_Kit.aspx
если нужна только poly(A)
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  12.11.2021 18:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 30.03.24 07:48
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft