Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
nfc |
Столкнулся с задачей: Есть 100-500 клеток (эпителиальных, человеческих) в 10 мкл воды, Вопрос - как выделить из них ДНК, сохранив хотя бы большую ее часть? Есть ли у кого-нибудь опыт очистки таких количеств ДНК? В дальнейшем ДНК должна идти на ПЦР. Пробовал разные микроколонки с сорбентами (типа QIAamp DNA Micro Kit)- не помогает... Пробовал выделять данную ДНК из нормальных количеств материала и разводить до соответствующих значений - около 200 геномов ПЦР ловит однозначно. Заранее спасибо за помощь. |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
|
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
Пробовал разные микроколонки с сорбентами (типа QIAamp DNA Micro Kit)- не помогает... А чем проверяли ? Ни форез, ни нанодроп такое не прочует.Да и вообще, о чем речь? Если надо на пцр, так и пцр-те прям с клеток. |
Paradox |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
1. Среду удалить ЦФ 2. Добавить 10-20 мкл 2-3% Chelex 100 в воде, 3. Довести до 95 оС, 4. ЦФ, а супер до 10 мкл на реакцию... |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
|
nfc |
Насчет клеток без выделения - сам не пробовал, но говорят что лимфоциты работают, а с эпителием не проходит. Думаю, надо попробовать с Chelex, спасибо за совет. Попробую - отпишусь. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Mykhaylo @ 11.02.2010 16:05) Мудрые слова! |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
TAOLI Участник |
(nfc @ 11.02.2010 14:17) Уважаемые коллеги, прошу помощи знающих людей. Столкнулся с задачей: Есть 100-500 клеток (эпителиальных, человеческих) в 10 мкл воды, Вопрос - как выделить из них ДНК, сохранив хотя бы большую ее часть? Есть ли у кого-нибудь опыт очистки таких количеств ДНК? В дальнейшем ДНК должна идти на ПЦР. Пробовал разные микроколонки с сорбентами (типа QIAamp DNA Micro Kit)- не помогает... Пробовал выделять данную ДНК из нормальных количеств материала и разводить до соответствующих значений - около 200 геномов ПЦР ловит однозначно. Заранее спасибо за помощь. Прикрепляю методики, которые используют в МВД. С помощью некоторых из них (с chelex) ДНК выделяется даже из пятен крови на одежде размером несколько мм. Файл/ы:
|
nazen Участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Это про кит на основе Хелекса: Но есть и более продвинутый аналог, если кому интересно... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(nazen @ 12.02.2010 20:46) Это глупо из 10 клеток выделять ДНК для ПЦР... |
TAOLI Участник |
(plotter @ 11.02.2010 14:45) А чем проверяли ? Ни форез, ни нанодроп такое не прочует. Да и вообще, о чем речь? Если надо на пцр, так и пцр-те прям с клеток. Да действительно форез, и нанодроп такое может не прочувствовать. поэтому я бы сделал рециклинг: вначале 40-50циклов ПЦР, а потом заново навел бы ПЦР смесь (в качестве матрицы использовать ПЦР-продукт из 1-го ПЦР) и повторил бы еще раз 40-50 циклов. Или сразу поставить на большое количество циклов(циклов 60-70). |
nazen Участник |
(-Ъ- @ 12.02.2010 19:46) Обоснуйте. |
nfc |
100 клеток работают, меньше не пробовал. Всем спасибо!
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Так что, выделение ДНК - понятие "философическое". |
Demyanov Постоянный участник Санкт-Петербург |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Demyanov @ 24.02.2010 14:21) У меня тоже не открывается. |
anybody |
(-Ъ- @ 12.02.2010 22:44) Это первоисточник про Chelex 100 и ДНК - это чтобы учасники дискуссии не подумали будто метод придумали минты: Это про кит на основе Хелекса: Но есть и более продвинутый аналог, если кому интересно... да, очень интересно!!!! скиньте инфу плз!!! |
VVolkov Постоянный участник |
|
rikitiki Участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(anybody @ 18.07.2010 11:51) Какую конкретно инфу? Если вы клюнули на "тот продвинутый аналог" - речь идет о готовом ките, о котором на форуме из-за рекламы ... ну сами понимаете. Пишите, пожалуйства, в личку. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(VVolkov @ 18.07.2010 13:42) Название темы идиотское. Можно выделить из 1 клетки, а предельно малого числа не существует. Собственно возникают мысли, что дальше читать не надо - после названия. Не лучше ли помолчать, коли нечего конкретного дабавить. Другое дело, если чешется... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
aslan39 |
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Поставить ДНК-комету, прогнать форез, покрасить этидием бромидом, вырезать кусочек с ДНК, расплавить (вместо элюции) и кинуть на Hot Start PCR. Можно пробовать Hot Start сразу с клеток - прокипятить, охладить до температуры запуска Hot Start PCR (95, до 10 минут), а потом добавить полимеразу. Смутно помню, но кажись один мой младший коллега когда-то амплифицировал клонированную вставку в вектор прямо с дохлой культуры E.coli. |
RNK Постоянный участник СССР |
"Non-invasive RNA/DNA skin sampling" |
Guest IP-штамп: fr6P9QD2IlgOg гость |
(Paradox @ 11.02.2010 13:58) если нужна только poly(A)
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |