Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Расчет количества рестриктазы
Кураторы темы:* Ольга Л.
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в тему       Ввести решение этой задачиВнести в задачник новую задачу
Участник оффлайн! Ольга Л.




 прочитанное сообщение 21.08.2006 17:44     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail

Условие:
Вам нужно порезать 1мкг ПЦР-продукта длиной 1,6kb рестриктазой EcoRI. Для этой рестриктазы в ПЦР-продукте имеется 2 сайта рестрикции.
Какое минимальное количество ед. (u) рестриктазы EcoRI вам потребуется для проведения реакции за 1 час?

Для справки:
1.Unit Definition
One unit is defined as the amount of enzyme required to
digest 1µg of lambda DNA in 1 hour at 37°C in 50µl of
assay buffer.
2. Длина lambda DNA приблизительно 48 kb
3. Для EcoRI у lambda DNA 5 сайтов рестрикции.

Ответ округлите до целых чисел


Ответ с 2,5% точностью:   
      


/ Сборник задач,  #114205  /
Область: Молекулярная биология (биохимия, генная инженерия)
Характер и уровень: Простые (расч)


Сообщение было отредактировано Ольга Л. - 23.08.2006 08:46

Всего благодарностей: 6Поблагодарили (6): AE_, Yeaster, iliaY, Павел, Трев, ЦВТ ХИМРАР



Сообщение в колонке новостей: Информация, связанная с нашей профессиейСообщение в колонке новостей, раздел "Информация, связанная с нашей профессией"
22.08.2006 11:02
Участник оффлайн! AE
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.08.2006 19:26     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

(Ольга Л. @ 21.08.2006 16:44)
Ссылка на исходное сообщение  Какое минимальное количество ед. (u) рестриктазы EcoRI вам потребуется?


Народ вот решает. Некоторые даже получают ответы как у автора. Никто не ругается, что задача не корректная или не правильно решена. Тишь да гладь.
А можно я, как чайник в молекулярно-биологической кухне, задам пару провокационных вопросов.

1. Если так сложилось, что я готов ждать не час, а два часа, то могу ли я взять вдвое меньше единиц фермента?

2. Если я запихал тоже самое в 25µl то могу ли я считать, что за 30 минут реакция пройдет полностью.

Ответы, если можно, с объяснением.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Ольга Л.
Участник оффлайн! Ольга Л.




 прочитанное сообщение 23.08.2006 09:17     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Спасибо АЕ за справедливую критику.

Да, составитель задач из меня никудышний, не зря так долго не решалась ее писать.
В ответ на провокационные вопросы
1. Да, Вы можете взять единиц фермента меньше, теоретически даже вдвое. Но, практически, фермент с течением времени, и, соответственно, раундами рестрикции постепенно теряет свою активность. Насколько быстро - вероятно зависит от фермента.
2. Нет, не можете, поскольку количество сайтов рестрикции и количество фермента осталось прежними, только в меньшем объеме. С чего бы рестриктазе вдруг начать работать быстрее?

Надеюсь, я ответила на вопросы.
Участник оффлайн! nas
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 23.08.2006 11:06     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(Ольга Л. @ 23.08.2006 10:17)
Ссылка на исходное сообщение 
2. Нет, не можете, поскольку количество сайтов рестрикции и количество фермента осталось прежними, только в меньшем объеме. С чего бы рестриктазе вдруг начать работать быстрее?

То есть, если разбавить смесь до 25 мл (буфером, ну альбумина добавить, чтобы фермент не инактивировался) - то реакция пройдет за то же время???
Участник оффлайн! Yeaster




 прочитанное сообщение 23.08.2006 13:17     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

В условиях задачи не указано еще некоторые параметры - распложение сайтов рестрикции, наличие star-activity у рестриктазы в данном буфере. Но так ли это важно? Принципиально задача сводится к проверке понимания взаимосвязи между количеством ДНК, ее размером и количеством фермента. Дополнительные параметры необходимо учитывать уже в практическом применении в онкретной ситуации.

Что до влияния объема реакционной смеси на скорость ферментативной реакции - то вопрос сложный и теоретически результат, на мой взгляд, непредсказуем. Вдвое скорость, конечно, не возрастет. Но, с одной стороны, вы сокращаете объем вдвое и уменьшаете промежуток времени, необходимый для встречи в растворе ДНК и фермента, но при этом возрастает вязкость раствора и к тому же увеличивается концентрация компонентов буфера, в котором хранится рестриктаза, что может негативно сказаться на скорости реакции.

Так что задача вполне понятная. Ну, может быть стоит дополнить ее некоторыми ограничениями, чтобы снять спорные моменты.
Еще раз спасибо Ольге.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AE
Участник оффлайн! Urrу
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.08.2006 13:52     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

1. Если так сложилось, что я готов ждать не час, а два часа, то могу ли я взять вдвое меньше единиц фермента?

2. Если я запихал тоже самое в 25µl то могу ли я считать, что за 30 минут реакция пройдет полностью.

В обоих случаях нет, т.к. и там и там изменения не дадут линейного отклика на эффективности реакции. В последнем случае, вообще, может произойти снижение эффективности из-за двукратного увеличения вязкости реакционной смеси...

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AE
Участник оффлайн! AE
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.08.2006 13:55     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(Ольга Л. @ 23.08.2006 08:17)
Ссылка на исходное сообщение  Да, составитель задач из меня никудышний, не зря так долго не решалась ее писать.

Да ладно вам прибеднятся. Очень полезная задача
 
1. Да, Вы можете взять единиц фермента меньше, теоретически даже вдвое. Но, практически, фермент с течением времени, и, соответственно, раундами рестрикции постепенно теряет свою активность. Насколько быстро - вероятно зависит от фермента.

Ну это так, разминка была. Спасибо, что подправили условие.

 
2. Нет, не можете, поскольку количество сайтов рестрикции и количество фермента осталось прежними, только в меньшем объеме. С чего бы рестриктазе вдруг начать работать быстрее?


Количество осталось тем-же, но молярная концентрация сайтов увеличилась. А скорость ферментативной реакции зависит все-таки от концентраци, а не от количества субстрата. Иначе бы в определении единицы не был бы указан объем. Ну и как уже сказала nas, если объем реакции очень сильно увеличить а концентрацию сайтов соответсвенно уменшить, врядле приходится ожидать той-же скорости реакции.
Участник оффлайн! Ольга Л.




 прочитанное сообщение 23.08.2006 15:37     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Хорошо, хорошо, давайте по-порядку.
Я думаю с первым вопросом мы разобрались.
Теперь по-поводу второго. Суть вопроса заключалась в том, что если уменьшить объем реакции вдвое, то уменьшится ли время реакции вдвое? Ответ - нет. Соглашусь, объяснение я дала не совсем корректное.
Время работы молекулы рестриктазы состоит из следующих этапов:
1. Распознавание сайта рестрикции на молекуле ДНК
2. Присоединение фермента к найденному сайту
3. Разрезание сайта
4. Отсоединение фермента от ДНК.
Я полагаю, что 2-4 этапы у нас константные, т.к. состав буфера и температура не меняются. Остается 1-й этап.
С одной стороны, если концентрацию сайтов увеличить, то ферменту будет легче найти нужный и времени на это потребуется меньше. С другой стороны, при увеличении количества ДНК повышается вязкость раствора (то, о чем писали Urry и Yeaster), ферменту становится "труднее пробираться" между нитями ДНК, движение молекул в растворе замедляется и время реакции увеличивается. Т.о. если постепенно уменьшать количество реакционной смеси, то вначале мы получим ускорение реакции (но не линейное), потом будет некая точка перегиба (если представить себе график), после чего - снижение скорости реакции.
Кроме того, каждая молекула фермента способна провести определенное количество раундов гидролиза, после чего разваливается/инактивируется.

Надеюсь, такое объяснение публику устроит больше.

Помимо всего прочего, вот одно из определений ед. активности:

http://russia.sibenzyme.com/page.phtml?articlet=30
За одну единицу активности эндонуклеазы рестрикции принимают количество фермента, необходимое для полного гидролиза в течении одного часа одного микрограмма ДНК при оптимальной температуре и в оптимальном реакционном буфере.

Заметьте, здесь указано количество субстрата и не указан объем реакционной смеси, т.е. речь не идет о концентрации (можете обвинить авторов в безграмотности smile.gif).

И вот еще полезное замечание
http://www.promega.com/guides/re_guide/chaptwo/2_1.htm
Volume: Viscous DNA solutions inhibit enzyme diffusion and can reduce enzyme activity. DNA concentrations that are too dilute can fall below the Km of the restriction enzyme and also affect enzyme activity. Volume considerations must take into account final ionic strength and must result in glycerol concentrations no higher than 5-10% in order to avoid star activity. Reaction volumes of 10-50µl per microgram of DNA are recommended.

Сообщение было отредактировано Ольга Л. - 24.08.2006 09:20

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AE
Участник оффлайн! AE
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.08.2006 17:20     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы       Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(Ольга Л. @ 23.08.2006 14:37)
Ссылка на исходное сообщение  Хорошо, хорошо, давайте по-порядку.
Я думаю с первым вопросом мы разобрались.


Да разобрались. Кстати, если походить вокруг приведенной вами ссылки можно найти интересную табличку
http://www.promega.com/guides/re_guide/chaptwo/2_2.htm
из которой узнать сохранность активности некоторых рестриктаз во времени. Для EcoRI линейность ответа сохраняется как минимум от 15минут до 4х часов.
Так что на первый мой вопрос ответ Да.

 
Теперь по-поводу второго. Суть вопроса заключалась в том, что если уменьшить объем реакции вдвое, то уменьшится ли время реакции вдвое? Ответ - нет. Соглашусь, объяснение я дала не совсем корректное.
......
Т.о. если постепенно уменьшать количество реакционной смеси, то вначале мы получим ускорение реакции (но не линейное), потом будет некая точка перегиба (если представить себе график), после чего - снижение скорости реакции.
......
Надеюсь, такое объяснение публику устроит больше.


Объяснение меня не до конца устроило (про публику не знаю), однако аргументированно с ним спорить у меня не хватает знаний, но практический вывод меня вполне устраивает.

Еще раз спасибо за задачу.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Ольга Л.
Gal
IP-штамп: frYQ4K.bticsw
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  14.07.2008 18:53     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы     
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

"Molecular Cloning" 2nd edition 1989: One unit of enzyme is usually defined as the amount required ti digest 1microgram of DNA to completion in 1 hour in recommended buffer and at recommended temperature in a 20 - microliters reaction.
Guest
IP-штамп: frlscERHcuXAs
гость



 прочитанное сообщение 15.12.2017 21:10     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы     
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Для того чтобы заняться сексом, теперь не нужно тратить
огромные суммы на ночные клубы в поисках девицы,
которая смогла бы скрасить вечер одинокого мужчины
eek.gif
yolo
IP-штамп: frCcyOQ99/O6Q
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  11.04.2019 06:42     Сообщение для модератора  Сообщение для куратора темы     
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

true religion jeans sale
coach outlet store
coach outlet online
cheap air jordans
louis vuitton purses
kappa clothing
polo ralph lauren outlet
louis vuitton outlet online
ugg outlet
coach outlet store
louboutin outlet
durant shoes
ferragamo outlet
coach outlet online
fitflops
moncler outlet online
cheap air jordans
pandora jewelry outlet
ralph lauren outlet
air jordan
ubiq shoes
nike outlet store
adidas nmd r1
adidas outlet online
michael kors outlet
under armour shoes
yankees jerseys
kate spade outlet
moncler
air jordan 3
phillies jerseys
converse shoes
louboutin outlet
valentino
fivefingers shoes
off white clothing
ed hardy
nike outlet
adidas wings shoes
celine outlet
moncler pas cher
kendra scott
coach outlet store
true religion outlet
hermes bags
juicy couture
supreme clothing
christian louboutin sale
adidas ultra boost
christian louboutin shoes
gymshark sale
balenciaga shoes
air jordan uk
fila shoes
uggs outlet
coach factory outlet
supra shoes
fitflops outlet
fitflops sale clearance
oakley sunglasses outlet
pandora jewelry
moncler outlet online
curry 4 shoes
ravens jerseys
kate spade outlet online
air max pas cher
air max
coach outlet clearance
ugg outlet
true religion outlet store
minnesota vikings jersey
jordan shoes for sale
adidas ultra boost
fjallraven backpack
louboutin outlet
coach factory outlet online
air max shoes
adidas superstars
adidas outlet online
hermes belt
north face outlet online
ray ban sunglasses outlet
gucci outlet online
cheap mlb jerseys
seattle seahawks jersey
kate spade outlet online
air max 2015
true religion outlet
fitflops
nfl jerseys
coach outlet store online
michael kors outlet clearance
coach outlet online
yeti tumbler
coach outlet online
christian louboutin
true religion outlet store
houston texans jerseys
coach outlet online
true religion jeans
true religion
mac cosmetics
yeezy shoes
pandora charms outlet
rolex watches
ugg outlet
ferragamo belts
asics outlet
nike sneakers
christian louboutin outlet
uboutin shoes
ugg
chrome hearts outlet store
nike air max 2018
fila
mbt shoes
coach outlet
adidas neo shoes
cheap jordan shoes
cheap nike shoes
ralph lauren outlet
kobe 12
coach factory outlet online
revolution 3
cheap air max
kobe shoes
michael kors outlet online
coach outlet store
jets jersey
coach factorty outlet online
christian louboutin shoes
yeezy boost 350
lacoste outlet
nike outlet store
kate spade
coach outlet sale
pandora charms sale clearance
kate spade outlet online
versace clothing
coach factory outlet online
cubs jerseys
pandora charms
coach handbags
true religion jeans
canada goose outlet
broncos jerseys
giuseppe zanotti outlet store
le coq sportif
prada outlet
adidas yeezy boost
salvatore ferragamo shoes
converse shoes
columbia outlet store
giuseppe zanotti shoes
nike air force
ed hardy outlet
ralph lauren outlet
coach outlet online
coach outlet online
snapback hats
coach factory outlet
coach outlet online
kyrie 2
nike outlet
coach handbags outlet
canada goose
philipp plein outlet
oakley sunglasses wholesale
pandora sale clearance
hermes outlet store
coach outlet online
ralph lauren outlet online
pandora charms outlet
coach outlet online
ralph lauren outlet
celine outlet
coach factory outlet
prada outlet
coach outlet
the north face jackets
louboutin outlet
yeezy shoes
cheap maui jim sunglasses
cheap mlb jerseys
ugg boots sale
adidas slides
persol sunglasses sale
moncler jackets
moncler jacka
cardinals jerseys
ralph lauren uk
stone island sale
moncler jackets
hydro flask sale
louboutin shoes
coach factory outlet online
moncler outlet online
coach factory outlet online
nike outlet store
cheap snapbacks

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Сборник задач · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в тему       Ввести решение этой задачиВнести в задачник новую задачу

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 07.12.19 14:40
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft