 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* INF в ELISA
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 IrishВладимир  |
 02.09.2008 12:44
Не оценивает ли кто-нибудь INF в ELISA и пролиферацию с аламар блю? Методически не поможете? заранее спасибо! |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
04.09.2008 22:22
|
|
Matveichev A. V. Участник Нижний Новгород |
17.09.2008 14:07
Сообщение было отредактировано Matveichev A. V. - 17.09.2008 14:10 |
|
Guest IP-штамп: frClxkmPIL4sQ гость |
10.10.2008 11:55
Не особо в этом специалист, so буду рада любой полезной информации..  .
|
|
Matveichev A. V. Участник Нижний Новгород |
14.10.2008 23:40
ИМХО, дело Ваше нужно делать так: берете у куры кровь в склянку с гепарином (для людей мы применяем раствор гепарина в среде с концентрацией 100 ед. гепарина в мл – миллилитра 4 на 20 мл крови). Разводите средой раза в два, слоите на градиент (фиколл-верографин или гистопак 1077) (3 части крови на одну часть градиента), центрифугируете 45 минут при 450 g. Собираете интерфазное кольцо, отмываете пару раз (в первую отмывку неплохо несколько капель рабочего раствора гепарина капнуть). Дальше у людей засеваем клетки на адгезию в планшеты (концентрация 4-7×106 клеток в миллилитре), дабы от моноцитов отделаться. Часа на три. Пластик – на Ваш выбор. Мы с Costar`ом работаем. Про кур можно прочитать в статье “Lymphocyte and brain neurotoxic esterase: Dose and time dependence of inhibition in the hen examined with three organophosphorus esters”, авторы Schwab, Bradley W. Richardson, Rudy J. из журнала Toxicology and Applied Pharmacology, Volume 83, Issue 1, 30 March 1986, Pages 1-9 – там они на фиколл-пак кровь слоят и никакого разделения по адгезивным свойствам не делают. Тогда, соответственно, соберутся МНПК с большим количеством моноцитов. После снимаете неприлипшие клетки: это то, что надо – то есть относительно чистая фракция собственно лимфоцитов (естественно, всех). Их отмыть, посчитать и посеять в концентрации 1 миллион клеток в миллилитре. Активируете, чем Вам нужно и растите (суток четверо, на вскидку, может быть вполне достаточно, но вообще сначала хорошо бы поискать пик продукции: снять супернатант культур с одинаковыми условиями культивирования через сутки, через двое, через трое, сравнить – то есть, будете знать изменения в динамике). По истечении срока снимаете супернатант автоматической пипеткой, аликвотируете, если надо. Для корректной работы иммуноферментная тест-система требует 100 микролитров образца на одну лунку стрипа. Для работы с человеческими интерферонами неплохо, ИМХО, зарекомендовали себя тест-системы фирмы “Вектор-Бест” (К примеру, ТТХ могут быть такие: диапазон измеряемых концентраций 0 – 2000 пг/мл, чувствительность анализа – 20 пг/мл для тест-системы к гамма-интерферону), а вот что до кур… Наверное, стоит обратиться к дистрибьюторам “Сигмы-Альдрич”, российских тест-систем к куриным цитокинам я не знаю. Дальше – стандартный твердофазный ИФА. Результат измеряете на ридере (длина волны 450 нанометров, вероятней всего). Если написал то, что Вы уже знаете – пардону прошу (так вопрос понял). Конкретизируйте - и спишемся снова. С уважением, Матвеичев А.В. Сообщение было отредактировано Matveichev A. V. - 14.10.2008 23:53 |
|
Irish Владимир |
15.10.2008 13:55
А храните Вы снятые суперы на -70? А ст.кривую Вы строите из INF набора или сами выращиваете его (мой знакомый американец именно так и поступает в своей американской республике)? Уже намыла статью, пойду поглядеть.. С уважением, Ирина |
|
Matveichev A. V. Участник Нижний Новгород |
18.10.2008 16:24
 . Мы поставили в параллели калибровочный образец и рекомбинантный цитокин от “Biosource”).
|
|
Guest IP-штамп: frClxkmPIL4sQ гость |
20.10.2008 15:31
А про ПЦР интересно конечно - мы его ставим. Irish |
|
Nec |
28.10.2008 05:34
Дальше у людей засеваем клетки на адгезию в планшеты (концентрация 4-7×106 клеток в миллилитре), дабы от моноцитов отделаться. После снимаете неприлипшие клетки: это то, что надо – то есть относительно чистая фракция собственно лимфоцитов (естественно, всех). Их отмыть, посчитать и посеять в концентрации 1 миллион клеток в миллилитре. Уважаемый Matveichev A. V. Очень надеюсь на Ваш совет!!! Я выделяю крысиные лимфоциты способом, похожим на Ваш, после чего активирую их ФГА (10мкг/мл) в течении 18 часов и смотрю интерферон методом Elisa. Посоветуйте, сколько клеток надо сажать в одну лунку (я инкубирую с ФГА в 24-луночном планшете). Я сажала 400 000 в одну лунку (исходная концентрация 2 млн/мл, беру 200 мкл и в лунку) и никакой активации не получила. Как вы считаете-может быть слишком мало клеток? Или время инкубации маленькое? Просто нашла огромное количесвто статей в которых для оценки продукции интерферона гамма люди инкубируют клетки 18-24 часа. Очень давно мучаюсь, надеюсь на Вашу помощь  Сообщение было отредактировано Nec - 28.10.2008 06:07 |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
28.10.2008 12:55
|
|
Nec |
28.10.2008 13:25
Вы считаете, что токо на цитометре можно? Но так там же только внутри клетки меряется... а цитокины же наружу синтезируются... вроде как логичней Elisoi делать, нет?... Что же делать? 
|
|
Matveichev A. V. Участник Нижний Новгород |
28.10.2008 14:41
Снова здравствуйте! По нашему общему мнению, Ваша проблема может иметь две причины: 1) используется некачественная среда и сыворотка. Обязательно для выделения нужно использовать хорошие среды для культивирования (DMEM, к примеру), и хорошую же, не просроченную фетальную сывортку для последующего выращивания клеток. Раствор Хенкса и любые другие солевые растворы не подойдут. После выделения и при культивировании оцените жизнеспособность клеток - c помощью красителей или на глаз (внешне клетки должны быть ровные, округлые, без рваных краев). Стоит поглядеть, как ведут они себя при культивировании с ФГА - уже к концу первых суток в опытных лунках должно быть клеток визуально больше, чем в контроле, должны быть бласты - довольно крупные и круглые. 2) если культура выглядит хорошо - как описано, то стоит увеличить срок культивирования до 2-3 суток. Если же нет такой картины - значит, скорее всего, проблема в процедуре выделения. Опишите ее подробней, пожалуйста. Мерять продукцию ИФН в данном случае с помощью ИФА стоит Извините за пустое письмо на Ваш email - отправил, не зайдя на форум  ибо служба оповещения не сработала.To Дядя ФАКСер. Еще как можно получить полезную информацию с ИФА. Зря Вы так. С уважением, Матвеичев А.В. |
|
Nec |
28.10.2008 14:55
Подробную методику я отправила Вам на электронный адрес...или нужно еще более подробно... ? Мне кажется, что я выделяю живые и хорошие клетки... я их красила трипановым голубым и они были живые... да и в микроскопе они кругленькие и симпатичные...культивирую я их в RPMI с сывороткой....? Это подходящая среда? А отмываю Хенксом? Это нормально, как Вы считаете? А может быть увеличить количество клеток на одну лунку...вот мне тут всей лабораторией советуют сажать по 2млн в лунку... правда в этой лаборатории занимаются не кровью... а еще они предлагают смешивать кровь от разных крыс (одной линии)... мне кажется это неправильным... как Вы считаете? Попробую инкубировать 3 дня...нужно ли дополнительно добавлять что-то в среду? И еще вопрос,можно  как вы считаете ФГА-10мкг/мл-нормально? Все вроде с такими концентрациями работают, судя по статьям...но только на человеке...а вот для крысы непонятноСпасибо Вам за активное участие в моей научной судьбе... Сообщение было отредактировано Nec - 28.10.2008 14:56 |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
28.10.2008 15:03
(Matveichev A. V. @ 28.10.2008 12:41)  ФАКСер.Еще как можно получить полезную информацию с ИФА. Зря Вы так. С уважением, Матвеичев А.В. Я написал - "в большинстве случаев". Если интересует "брутто-ответ"- то да, ИФА поможет. А если необходимо узнать, кто конкретно продуцирует- то проточка, элиcпот и бид-эррей. К тому же, ИФА- метод низкой чувствительности. |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
28.10.2008 15:06
(Nec @ 28.10.2008 11:25) .....Господи..... Как это...... я в растерянности... Вы считаете, что токо на цитометре можно? Но так там же только внутри клетки меряется... а цитокины же наружу синтезируются... вроде как логичней Elisoi делать, нет?... Что же делать? Верно, в классической проточки- внутриклеточные цитокины детектятся. Секретируемые - бид-эрреем (CBA, BioPlex, Luminex - плюс в чувствительности и мульиплексинге) или ELISPOT (забавный метод, на single-cell cytokine secretion). Для проточки, кстати, тоже есть замечательный аппроач для детекции цитокин-секретирующих клеток - вот ссылка: |
|
Nec |
28.10.2008 15:29
|
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
28.10.2008 15:56
А вот- по мультиплексным цитокиновым эссеям (CBA): И по ELISPOTу: В России сие дистрибутирует "Биолайн": |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
28.10.2008 16:09
|
|
Matveichev A. V. Участник Нижний Новгород |
29.10.2008 09:56
Про методики. Об использовании человеческого градиента не беспокойтесь - ничего страшного, не так велика разница. Кроме того, клетки, собравшиеся делиться, имеют меньшую плотность в сравнении с покоящимися, так что на 1077 градиенте Вы собираете именно таковые (то есть бласты). Конечно, если крысиный градиент будет - это очень хорошо. Что до Lymhposep - читал, что он света боится (не стоит ДОЛГО держать на прямом солнечном свету. Долго - это, вероятно, дни напролет. Повседневная работа влиять на него не должна). Концентрация ФГА, думаю, нормальная. Но, можно попробовать 20 мкг/мл - чтоб наверняка. Может быть стоит использовать новую партию препарата - он, как я слышал, бывает портится. Так же есть мнение (старое-престарое, почти легенда , что для клеток грызунов лучше применять Конкавалин А.
|
|
Nec |
29.10.2008 13:55
Спасибо большое за ценные советы... А можно попросить Вас еще ответить на вопрос про количесвто клеток в 1 лунку и про то, можно ли смешивать кровь от разных крыс...просто у меня есть возможность использовать только небольших крыс, а из них много крови сложно получить стерильно... И как Вы считаете, среды для культивировани и выделения (RPMI и Хенкс) подходящие? А лимфосеп от света я всегда берегу... и ФГА наисвежайший...купили пол месяца назад... Завтра-послезавтра начну по новой
|
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
29.10.2008 14:06
(Nec @ 29.10.2008 11:55) можно ли смешивать кровь от разных крыс..Нельзя, ибо клетки разных индивидов весьма вариабельны по цитокиновому ответу. |
|
Nec |
29.10.2008 14:18
|
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
29.10.2008 17:33
P.S. В постдочестве на NOD мышах работал, с пакреатическими лимфоузлами - оттуда вообще клеток выделяется чуть-чуть (несколько сот тысяч). Однако цитокинчики ловил без проблем. С крысами проще- они больше
|
|
Matveichev A. V. Участник Нижний Новгород |
30.10.2008 18:06
(Дядя ФАКСер @ 29.10.2008 14:06) Нельзя, ибо клетки разных индивидов весьма вариабельны по цитокиновому ответу.ИМХО, если все Ваши крысы одной линии, содержались в одних условиях и у Вас не стоит задачи сравнить действие внешних условий (содержание, стресс и т.д) на ЛИНИЮ, то пулировать кровь от нескольких линейных животных даже НУЖНО. С ЛИНЕЙНЫМИ ЖИВОТНЫМИ (а не с человеком, конечно) такой подход как раз НИВЕЛИРУЕТ индивидуальные различия и улучшает статистику. Давний поход, еще 80-х годов. Что до среды и раствора Хенкаса, то здесь, вроде бы, все должно быть хорошо, но попробуйте, на всякий случай, вообще не применять Хенкс и отмывать RPMI. Количество клеток у Вас очень хорошее. Мы, как я говорил, вообще засеваем 1 миллион на миллилитр. |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
30.10.2008 18:59
(Matveichev A. V. @ 30.10.2008 16:06) ИМХО, если все Ваши крысы одной линии, содержались в одних условиях и у Вас не стоит задачи сравнить действие внешних условий (содержание, стресс и т.д) на ЛИНИЮ, то пулировать кровь от нескольких линейных животных даже НУЖНО. ....и получим нерепрезентативный "брутто-эффект". А потом будем стенать: "Ах, почему нашу статью не берут в нормальный журнал, буржуи проклятые?!..."... Хотя, если нужно к примеру, тупо поиметь н миллионов Т-клеток для использования в ин-витро культуральной системе- то кровь сливать можно в общую бадью
|
|
Matveichev A. V. Участник Нижний Новгород |
31.10.2008 12:37
Вообще, если уж говорить о методах и публикациях, то для серьезного исследования и публикации, к примеру, в "Nature", нужно применять ВСЕ перечисленные методы - и каждый - для СВОЕЙ цели. Исследуем продукцию цитокина - то надо измерять мРНК, смотреть изменение числа продуцентов - EliSpot`ом, субпопуляционный состав продуцентов - с измерением внутриклеточной продукции цитокинов (в чем я с Вами согласен абсолютно) и наконец, тотальную продукцию белка - с помощью ИФА. (Дядя ФАКСер @ 28.10.2008 15:03) К тому же, ИФА- метод низкой чувствительности.По поводу "низкой чувствительности ИФА" - 0.5 пикограмма на миллилитр (Вектор-Бест, тест-система на интерлейкин-6). Это ли низкая чувствительность? Что до мультиплексного измерения цитокинов - метод, безусловно, интересный, возможно, он заменит ИФА - когда докажет покажет себя столь же надежным, удобным и недорогим инструментом  . А пока...Чего-то в массе своей на него исследователи не переходят. Про журналы. Ex vivo stimulation of cord blood mononuclear cells by dexamethasone and interleukin-7 results in the maturation of interferon-γ-secreting effector memory T cells. V. Yu. Talayev et al., Clinical & Experimental Immunology, Volume 141 Issue 3, Pages 440 - 448 - это мы. Пробились, как видите. Сообщение было отредактировано Matveichev A. V. - 31.10.2008 12:55 |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
31.10.2008 13:17
(Matveichev A. V. @ 31.10.2008 10:37) Экий Вы идейный противник ИФА Я не противник. Просто есть такая штука, как области применимости методов- только и всего. И мне проще джае для брутто юзать CBA- ибо сразу могу смотреть до десятка секретируемых цитокинов с одного семпла. |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
31.10.2008 13:18
(Matveichev A. V. @ 31.10.2008 10:37) Что до мультиплексного измерения цитокинов - метод, безусловно, интересный, возможно, он заменит ИФА - когда докажет покажет себя столь же надежным, удобным и недорогим инструментом . А пока...CBA и сейчас дешевле ELISA выходит, если надо не один, а, допустим, 4-5-6 цитокинов ловить. |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
 05.01.2023 12:03
|
|
watchesonline89 Постоянный участник |
09.01.2023 12:16
|
| « Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.