Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Проблема при выделении ДНК -- Сильно тянется интерфаза --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! uKaterina




 прочитанное сообщение 01.08.2018 08:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование
Вопрос
Доброго времени суток, коллеги!
При выделении ДНК у нас возникла такая проблема:
Перед инкубацией с додецилсульфатом мы сливаем цитратный буфер и добавляем ацетат натрия (pH 7.0). При этом раствор приобретает вид желелбразного сгустка. А после инкубации (после добавления фенол/хлороформной смеси и цетрифугирования) сама интерфаза оооочень сильно тянется и тянет за собой белковую фракцию.
Может кто сталкивался? Подскажите, пожалуйста, что мы делаем не так!?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 01.08.2018 14:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

У вас очень высокая концентрация ДНК, уж не из молоки ли лосося вы ее выделяете? Разбавте раствор. И вообще пояснили бы для начала что за ДНК из какого организма и каким способом получаете.
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 01.08.2018 15:45     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

ДНКи очень много, разбавьте пробу.
Участник оффлайн! uKaterina




 прочитанное сообщение 02.08.2018 06:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

ДНК выделяем из цельной крови фенол-хлороформным микрометодом (из 0,5 мл). В итоге получается не очень большая концентрация: 50-100 нг/мкл (для такого объема это не много).
Участник оффлайн! superuser




 прочитанное сообщение 02.08.2018 06:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Вам мешает в дальнейшем анализе материал ДНК, получаемый в таком виде?

Просто у вас такая особенность пробы. Ничего существенного не сделаешь.

P.S.: Помимо происхождения пробы хорошо бы привести протокол выделения ДНК, и место его в эксперименте.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.08.2018 09:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(uKaterina @ 02.08.2018 07:00)
Ссылка на исходное сообщение  ДНК выделяем из цельной крови фенол-хлороформным микрометодом (из 0,5 мл). В итоге получается не очень большая концентрация: 50-100 нг/мкл (для такого объема это не много).

А протеиназу используете?
Участник оффлайн! uKaterina




 прочитанное сообщение 02.08.2018 09:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Нет, протеиназу не используем. Чуть позже прикреплю протокол выделения.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.08.2018 09:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

А не надо прикреплять протокол и так все ясно. У вас белка в пробе под 100мг/мл -это о 100мкг!!!(не нг)/мкл. Ну и все! Вы его денатурируете(фенолом) и он превращается в вязкую пульпу - в этом вся проблема. Обработка протеиназой К 100мкг/мл час при 56 градусах в 0,5% SDS( это минимум, а можно и еще часик добавив вторую такую же порцию протеиназы). Спасет мать русской мол.биологии. Состав буфера для лизиса я пологаю по умолчанию содержит: трис , SDS и EDTA.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): dk
Участник оффлайн! uKaterina




 прочитанное сообщение 02.08.2018 10:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Я таки прикрепляю протокол)
Белок у нас в пробе (готовой растворенной ДНК) в пределах нормы: при измерении на 260/280 - 1,6-1,8, а раствор с ДНК все равно тянется.
Протеиназу пробовали добавлять - не помогает.
Для лизиса добавляем ацетат нария.
Участник оффлайн! uKaterina




 прочитанное сообщение 02.08.2018 10:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование
Обмен опытом
Протокол:

Файл/ы:

скачать файл __________________.bmp
размер: 1.96мб
кол-во скачиваний: 493


Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.08.2018 14:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Однако, плазму вы вроде отбираете, а там больше всего белка, но все равно там остается много гемоглобина, как баластного белка, я бы все же протеиназил.

Протеиназу на 37 надо ночь держать, добавлять ее на час при 37 - это в пользу бедных.

Если разбавлять пробу ацетатом, то не во время разделения фаз, а перед. В ацетате обязательно должен быть ЭДТА хотя бы 1 мМ, а лучше 5-10. Понять, что проба вязкая, можно еще до добавления фенола аккуратно ее пропипетировав перед нанесением на фенольную фазу.
Участник оффлайн! superuser




 прочитанное сообщение 02.08.2018 22:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Измерьте рН вашего однократного цитратного буфера. Даже если делали это когда-то раньше, то желательно повторить в текущих условиях.
Нужно подробно описать, как готовите цитратный буфер.

И да, кстати, пробовали хоть раз считать лейкоциты?

Также возможно придётся менять методику, тогда что можно попробовать для начала:
1) вместо цитратного буфера применить Трис-буфер (рН 7,4-7,6 соляной кислотой, хлорид магния или аммония, если не вводили ЭДТА в пробу, то включите его в этот буфер). Если нужен рецепт буфера - дайте знать;
2) вместо 0,7 мл крови внести 0,3 мл;
3) вышеуказанные 1) и 2) - совместно.

Но, вы должны понимать, что прям вот "сияющую" ДНК получить очень маловероятно (как я писал - такова особенность вашей пробы), каким бы образом не работали: тянуться что-нибудь да как-нибудь из интерфазы будет всё равно. А если это будет не фенол-хлороформный метод, то вы должны понимать, что ДНК никогда не будет одна, такова особенность метода; хоть и называем процедуру "Выделение ДНК", на самом деле в итоговом растворе не только ДНК.
Вы не указали также, почему вам мешают получающиеся у вас особенности реализации методики; не удаётся совсем продолжать исследование (не получается раствор ДНК получить) или нужна как можно большая очищенность, или что угодно ещё?

P.S.: есть возможность иметь меркаптоэтанол?

Сообщение было отредактировано superuser - 02.08.2018 22:29

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): uKaterina
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 03.08.2018 11:56     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Странный протокол, может попробовать по-старинке, так сказать - по Маниатису? С другой стороны, если Вас всё устраивает по качеству и кол-ву выделенной ДНКи - ну и ладно, чего голову ломать.
Участник оффлайн! Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 04.08.2018 13:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(MMM @ 02.08.2018 12:24)
Ссылка на исходное сообщение  
Протеиназу на 37 надо ночь держать, добавлять ее на час при 37 - это в пользу бедных.

Поддерживаю Вас.
Протеинкиназа K, 55 градусов на ночь. Все белки в труху.
37 - это способ кроме протеазы еще и работу нуклеаз получить.

Разверну ответ. Оптимум протеинкиназы К где -то 45. Мезотермофильный фермент.
То есть 50-55-56 не совсем оптимально для протеинкиназы К, но для нуклеаз млекопитающих точно не оптимально.
Поэтому если не пахать ночами перерыв как раз на переваривание. "Ночная" концентрация фермента может быть меньше. Но если работает, зачем оптимизировать.
Каспазную апоптозную "лесенку" при 37 получить не могли (кто же публикует отрицательные результаты), при 50 градусной обработке получилась идеальная картинка.

ЭФФЕКТЫ ИНГИБИТОРА КАСПАЗЫ-3 НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ АПОПТОЗА В ЗРЕЛОМ МОЗГЕ ПРИ ЕГО ЦЕНТРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ
Юрасов В.В., Грудень М.А., Сторожева З.И., Яковлева Н.Е., Маркина Е.В., Шаров В.И., Шерстнев В.В.
Нейрохимия. 2007. Т. 24. № 4. С. 304-311.

P.S. Сам наблюдал, когда использовали 55, а в статье писали рекомендованные в бамажке к ферменту 37 wink.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): superuser
Guest
IP-штамп: frsFk8oRU4ljA
гость



 прочитанное сообщение 16.08.2018 09:52     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Спасибо всем за помощь!
Все дело оказалось в рН ацетата (рН-метр нужно уже менять!).
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 17:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 10:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

https://omegawatches89.simplesite.com/452939033
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040000/
https://blog.easyfie.com/how-to-prepare-you...on/#comment-285
https://form.jotform.com/223253786289064
https://discussions.ubisoft.com/user/omegawatches89
https://www.worldranklist.com/profile/108194
https://blog.udn.com/omegawatches89/176226568
https://penzu.com/p/56f52c40
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/tips-...replica-watches
https://omegawatches91.mystrikingly.com/
https://ameblo.jp/omegawatches89/entry-12756647425.html
https://telegra.ph/Where-To-Find-Elegant-An...es-Online-08-03
https://omegawatches89.seesaa.net/article/490300768.html
https://medium.com/@omegawatches89/reasons-...ar-e16d1fabc26f
https://omegawatches89.simplesite.com/452939109
https://teletype.in/@omegawatches89/bVw2sShID4x
https://www.pearltrees.com/omegawatches89#item456651209
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 08:26
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft