Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Heather |
Проблема такая. Нужно заклонировать белок Х в YFP и BFP векторы. В нашей группе он уже был заклонирован в GFP вектор. Это было сделано другими людьми, в лабораторном журнале подробностей не описано (как и проблем), но концентрация ДНК очень низкая, по сравнению с нашими обычными минипрепами. Стали делать новые клонирования и застряли. Делаем лидирование. Колонии есть, но требуют 2-3 дня, что бы хоть чуть-чуть вырасти. На этом останавливаются и дальше доращивать их уже бесполезно. Пытаемся из этих колоний вырастить минипрепы. Культура растет где-то до оптической плотности 0.05-0.1 и встает. Как бы похоже на токсичность. Стали выращивать их на более низких оборотах (140-150) и при 25оС. Ситуация немного улучшилась, но все равно не достаточно. В таких условия дорастает до плотности 0.1-0.2. Вырастили 100 миллилитров, скрутили, сделали минипрепы. Концентрация ДНК отличная, где-то 200нг/мкл. При этом сиквенсы пришли нечитабельные. Нанесли эту ДНК на гель - пусто. Кто-нибудь с таким сталкивался? Что с этим делать и как через это прорваться? Заранее спасибо за помощь и совет. ПС. Пробовали несколько разных типов компетентных клеток, даже экспрессивные попробовали. |
MMM Постоянный участник |
Не! Это значит что их нет! И значит: либо не идет рестрикция (плохие концы), либо не идет лигирование, либо не идет трансформация. Трансформацию проверить на pUC, Рестрикцию и лигирование на фаге лямбда. После этого можно снова ставить клонирование. Если все работает, то рано или поздно получите клон может не с первого раза, а с 20ого. Если не работает менять реактивы на работающие пока не заработают, потом клонировать. |
ship Постоянный участник Moscow |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
как это, что Вы измеряли? Нано, -прости господи, дропом, что ли? То есть перед сиквенсом на форез плазмиду не наносили? Круть! Короче, надо бы еще проверить антибиотиковую устойчивость Ваших исходных плазмид. Поставьте тупо перетрансформацию. Посмотрите, что где растет (ампициллин, канамицин, других вариантов нет- если это плазмида для маммалиан экспрессии, то скорее всего известная серия векторов в флуор. генами, канамицин) Если бактериальная- то ваще все просто, колонии светиться (и быть окрашенными) должны |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |