Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
AbramShimei |
P.S. Пробовали повысить специфичность реакции повышением температуры отжига праймеров, после чего исчезли вообще все полосы, включая нужные. Сообщение было отредактировано AbramShimei - 13.08.2018 08:49 |
genseq Постоянный участник |
|
AbramShimei |
(genseq @ 13.08.2018 08:58) Попробуйте разобраться с полимеразой. Чаще всего дополнительные полосы появляются при отсутствии "горячего старта". Подобрать полимеразу с хорошим "горячим стартом", т.е. с полным отсутствием активности при комнатной температуре, не так-то просто: Спасибо за совет! Полимераза у нас действительно без горячего старта. Другую закупать пока не собираются, а результаты хоть как то интерпретировать требуют уже сейчас. А по такой картине, я так понимаю, никак не определить, что там получилось? |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Результаты доложите тут. Специально не пишу, что может быть, чтобы Вы написали что получилось сами и сами всё выяснили. В наборе что-либо написано, что в Вашем гене может быть альтернативный сплайсинг? Название гена не напишете? Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 13.08.2018 10:39 |
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 09:48) В наборе что-либо написано, что в Вашем гене может быть альтернативный сплайсинг? Название гена не напишете? Альтернативы быть не должно, должен быть результат на наличие экспрессии (либо да, либо нет). Набор на группу генов Cry для Bacillus thuringiensis |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 10:43) Так, если это генномодифицированные растения, - там может быть одновременно несколько кассет разной длины. Это же ГРУППА генов. А последовательность праймеров Вам наверное не известна? Это бактерии. Группа генов, но каждая пара праймеров соответствует своему гену. Последовательность праймеров имеется. Сообщение было отредактировано AbramShimei - 13.08.2018 11:00 |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Если ДНК Вы выделяли из объёма микробиома, а не из клональной культуры - вполне может быть одновременно несколько изоформ в популяции. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(AbramShimei @ 13.08.2018 10:15) Спасибо за совет! Полимераза у нас действительно без горячего старта. Другую закупать пока не собираются, а результаты хоть как то интерпретировать требуют уже сейчас. А по такой картине, я так понимаю, никак не определить, что там получилось? Генсек дал правильную подсказку - начинать нужно с хот-старта. Если нет фермента с хот-стартом, делайте его "вручную" - вносите полимеразу в реакционную смесь при 80 оС и выше ПОД МАСЛО !!! во время паузы. А забаненный заговорит Вас насмерть, не слушайте его. |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 11:58) Если ДНК Вы выделяли из объёма микробиома, а не из клональной культуры - вполне может быть одновременно несколько изоформ в популяции. Использовались изоляты |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 12:55) Это штаммы патентованные и привезенные из-за границы. Больше мне не известно, самими микробами я не занимаюсь, мне их в колбах растят. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 13:42) Если хот-старт не поможет, тогда идем праймеры разглядывать на димеры. Если праймеры действительно такие горбатые, их никакой хот-старт не исправит, это правда. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Если это патентованные штаммы, и их растят неправильно (недостаточно активно отбирают), то бактерии могут избавляться от гена на плазмиде, иногда - не целиком. Потому у Вас нецелевой диапазаон получается. Ваш токсин, судя по википузии, имеет несколько активных изоформ разной длины. А бывает, что в культуре возникают дуплексы и триплексы факторов отбора. Проделайте вырезание из геля, разбавление и перепцренье. Результат важен. Можете сделать в параллель как обычно и как советуют хотстарт. Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 13.08.2018 14:02 |
AbramShimei |
(R-J-Dio @ 13.08.2018 13:19) что значит- заранее подобранные праймеры? Кем подобранные? В китайской статье? "коллегами" на словах передано секретное знание? В ВАШИХ руках они давали чистый продут на проверенном контроле? Начните с этого В статьях подобранные, а как еще... Работали хорошо на штаммах собственного производства. А вот на чужих такая штука... |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 14:04) Нет такой цели, да и оборудования. У нас ПЦР чисто для подтверждения качества продукции компании... Ну плюсь там поиск генов полезных в разных штаммах, когда нужно. |
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 13:22)
|
R-J-Dio Постоянный участник |
Далее, улыбнуло "В статьях подобранные, а как еще... " Действительно, как еще? А самим подобрать? Ребята "в статье" как-то сделали, а Вы??? Мосх собственный дома остался? Надо бы его иногда брать с собой на работу... |
AbramShimei |
(R-J-Dio @ 13.08.2018 15:03) Ребята "в статье" как-то сделали, а Вы??? Мосх собственный дома остался? Надо бы его иногда брать с собой на работу... Они там тоже опираются на иностранные работы. У меня слишком узкие задачи, чтобы самостоятельно заниматься подбором. К тому же, сильно ограничены ресурсы. Я единственный молекулярный биолог в компании. Мне говорят, надо пцр-ить, я пцр-ю. Все остальное - отклонение от основных задач. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
AbramShimei |
(R-J-Dio @ 13.08.2018 15:24) тогда плохо. Задача не имеет решения в общем виде. Либо Вы научаетесь их решать- оно ведь не в последний раз такое,- либо это направленьице в вашей конторе надо прикрыть Да насколько я понимаю, оно чисто для понта перед генеральным руководством и клиентами, которые в науке не шарят совсем. |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
(AbramShimei @ 13.08.2018 16:16) Они там тоже опираются на иностранные работы. У меня слишком узкие задачи, чтобы самостоятельно заниматься подбором. К тому же, сильно ограничены ресурсы. Я единственный молекулярный биолог в компании. Мне говорят, надо пцр-ить, я пцр-ю. Все остальное - отклонение от основных задач. Если Вы умеете ПЦРить по готовым китам что-то - это не делает Вас биологом, тем более молекулярным. Интересно, чем Вы собрались искать гены в культурах, если у Вас нету секвенатора или денег на эту нехитрую процедуру на чужом? Если Вы видите полоску на геле в области целевого продукта после ПЦР - это ещё не значит, что это он и есть. Контроль экспрессии токсина с литра культуры делается БЕЛКОВЫМ гелем, а не ДНКовым. Тем более, если не Вы подбирали праймеры и вообще не знаете что и какой длины должно быть между ними. Мутные производственные регламенты, в которых или подкладывают тухлый или токсичный антибиотик/индуктор, или его недокладывают процентов 50% всегда приводит к потере экспрессии целевых продуктов культуры. Искать куда делся ген в штамме таких культур пост фактум дело безсмысленное. Вырезать и ПЦРить полоски нужно чтобы проверить, даст ли каждая из полос только саму себя при переПЦРивании или даст 2 полосы опять, в начале будучи выделенной из одной. Как интерпретировать то и другое дальше объяснять? |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
Horse-radish Участник |
(AbramShimei @ 13.08.2018 11:31) В статьях подобранные, а как еще... Работали хорошо на штаммах собственного производства. А вот на чужих такая штука... Можете показать форезы того как оно было на своих штаммах и как оно стало на чужих?
|
ship Постоянный участник Moscow |
по факту нет информации чтобы чтото обсуждать или давать советы. надо хотя бы праймеры и протокол ПЦР, может циклы снизить можно просто, чтобы убрать неспецифику. картинки опять же, детали того как и что делали. контроли тоже нужны. кроме того человек говорит про "экспрессию генов", но что то мне подсказывает что ПЦРят они геномную ДНК. Если нет - то как выделяли РНК, как ставили обратную транскрицию ? и т.п.
|
AbramShimei |
(Horse-radish @ 13.08.2018 17:23) Будут вам форезы... |
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 17:15) А что, ПЦРщик это у нас отдельная профессия?? Или для того, чтобы называться биологом нужно неприменно сидеть в каком нибудь институте на кафедре за копейки?? |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
На кафедрах сейчас платят 60-100 т.р. Если зав.каф. не ворует с глав.бухом. Вы немного отстали от жизни. |
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 14.08.2018 10:00) На кафедрах сейчас платят 60-100 т.р. Если зав.каф. не ворует с глав.бухом. Вы немного отстали от жизни. Так что-ж мои бывшие одногруппники-то получают по 15к. А на сайте кфу висит вакансия на мнс за 18? |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
AbramShimei |
1) Как работало со своим штаммом. 2) Контроль со того опыта, где был свой штамм 3) Как работает с чужим штаммом 4) Контроль опыта с чужим штаммом
|
R-J-Dio Постоянный участник |
Пустые гели можно не показывать, кроме того, что агароза у Вас советская (видимо, из закромов), с чудесными волосиками, или чешская, один хрен, смотреть на пустых гелях нечего Сдается мне, там, где полосы слабые, там вообще все неспецифика- в отсутствие целевого фрагмента в геноме идет фоновая амплификация, я бы вообще не рассматривал эти полосы. Считать, что результат ПЦР отрицательный, и все
|
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Все дорожки кроме 4 и 5 - неспецифика. Поднимите температуру отжига в каждом цикле на пару-тройку градусов, количество циклов сделайте 30, а лучше - 25. На дорожках 4 и 5 - та же (на глаз, нужно мерить в проге трансиллюминатора с разными коррекциями) специфика. Дорога 4 - если бы не знал, что это бактерия, предположил, что гетерозигота по данному локусу между праймеров в геноме, количества шаблона специфики 300нп и 550нп примерно равно. Если бы был сиквенс, я б даже заподозрил, что это дупликация того, что фланкируют праймеры (-50нп на фланги до повтора). Либо - 2 плазмиды-продуцента с примерно одинаковой копийностью, одна из которых с 1-нарной вставкой гена, вторая - с дуплицированной вставкой. И да, хотстарт тут явно не повредит, как и советуют выше. Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 14.08.2018 15:41
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
AbramShimei |
(banned sceptique-NMRguy @ 14.08.2018 15:38) Праймеры явно старые, хранились плохо, не разаликвочены перед хранением в морозилке сразу после разбавления. И да, хотстарт тут явно не повредит, как и советуют выше. Праймерам примерно полгода, разаликвочиваем сразу как приходят из бигля, а рабочие концентрации делаем непосредственно перед блоком опытов.... Насчет хот-старта сказала руководсту, не знаю, чем там дело кончится.... |
AbramShimei |
(R-J-Dio @ 14.08.2018 14:36) еще б аннотировать картинки неплохо было б! Указать целевую длину, например. И лунки, где что нанесено. И число циклов укажите Пустые гели можно не показывать, кроме того, что агароза у Вас советская (видимо, из закромов), с чудесными волосиками, или чешская, один хрен, смотреть на пустых гелях нечего Целевая длина по разным праймерам разная, в среднем около 300 п.н. Каждая лунка соответствует своему праймеру, праймеры у меня пронумерованы в данном случае просто по порядку. Число циклов: 35. Агароза хеликоновская )) Волосики на фильтре у трансилюминатора, либо на объективе фотика, но скорее первое. Сообщение было отредактировано AbramShimei - 14.08.2018 16:43 |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
я бы вам еще посоветовал поставить раститровку по количеству циклов, например 20-25-30-35 на всех образцах. в 4 и 5 образцах увидите скорее всего продукт рано, а в остальных вылезет неспецифика к 30-35 циклам.
|
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Такая грязь как у Вас обычно всплывает из-за порченных праймеров или поплывшего по температурам термоциклера. Что требует коррекции температуры отжига на 3 градуса вверх, а количества циклов - на 5-10 в меньшую сторону. Можете ещё добавлять в каждую реакцию ДМСО до финальной концентрации 10%. Тоже поднимите специфичность.
|
AbramShimei |
P.S. Сложно быть самоучкой в такой науке... Сообщение было отредактировано AbramShimei - 15.08.2018 09:20 |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(banned sceptique-NMRguy @ 14.08.2018 18:58) Праймеры когда разбавляете перед аликвоченьем обязательно добавляйте 1-2 мкл стокового 10-50х буфера ТЕ в пробирку к праймеру (к 200-300 мкл воды, в которой их растворяете). Всегда буферите их СЛЕГКА при хранении вокруг pH7.0, тогда они будут хорошо храниться в морозилке сколько угодно. Такая грязь как у Вас обычно всплывает из-за порченных праймеров или поплывшего по температурам термоциклера. Что требует коррекции температуры отжига на 3 градуса вверх, а количества циклов - на 5-10 в меньшую сторону. Можете ещё добавлять в каждую реакцию ДМСО до финальной концентрации 10%. Тоже поднимите специфичность. Ну и советы, особенно 10% ДМСО ТС, праймеры в студию! и не бУхайте полимеразы и праймеры в реакцию без меры. И неприлично ПЦР ставить без хот-старта. |
AbramShimei |
(-Ъ- @ 15.08.2018 10:16) Кстати, хотела попросить для хот-старта полимеразу у содружественного вуза, а они тоже как то без нее обходятся.... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(AbramShimei @ 15.08.2018 11:34) Кстати, хотела попросить для хот-старта полимеразу у содружественного вуза, а они тоже как то без нее обходятся.... Ну тогда попросите у меня И не позорьтесь тут ссылаясь на дружественные вузы
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |