Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Лишние полосы в ПЦР!
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 08:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Доброго времени суток! Изучаем экспрессию генов при помощи набора праймеров. Праймеры готовые, заранее подобранные под конкретный ген. В результатах появляются лишние фрагменты, которые такие же четкие, как и нужные. В связи с этим затруднена интерпретация результата. Выходит, что к имеющейся ДНК данные праймеры не подходят. Что данный случай говорит об экспрессии нужного гена вообще?
P.S. Пробовали повысить специфичность реакции повышением температуры отжига праймеров, после чего исчезли вообще все полосы, включая нужные.

Сообщение было отредактировано AbramShimei - 13.08.2018 08:49
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.08.2018 08:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Попробуйте разобраться с полимеразой. Чаще всего дополнительные полосы появляются при отсутствии "горячего старта". Подобрать полимеразу с хорошим "горячим стартом", т.е. с полным отсутствием активности при комнатной температуре, не так-то просто:
https://www.future-science.com/doi/10.2144/000114481

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): AbramShimei, -Ъ-
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 09:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(genseq @ 13.08.2018 08:58)
Ссылка на исходное сообщение  Попробуйте разобраться с полимеразой. Чаще всего дополнительные  полосы появляются при отсутствии "горячего старта". Подобрать полимеразу с хорошим "горячим стартом", т.е. с полным отсутствием активности при комнатной температуре, не так-то просто:
https://www.future-science.com/doi/10.2144/000114481


Спасибо за совет! Полимераза у нас действительно без горячего старта. Другую закупать пока не собираются, а результаты хоть как то интерпретировать требуют уже сейчас. А по такой картине, я так понимаю, никак не определить, что там получилось?
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 09:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Попробуйте вырезать из геля и выделить по отдельности Ваши полосы. Полученный раствор ДНК на выходе из кита очищающего от агарозы разбавьте в 1000000 раз в каждом случае и добавьте в качестве шаблона в новые ПЦР сначала при тех же условиях, а потом - в температурный градиент температур отжига на каждом цикле.

Результаты доложите тут. Специально не пишу, что может быть, чтобы Вы написали что получилось сами и сами всё выяснили.

В наборе что-либо написано, что в Вашем гене может быть альтернативный сплайсинг? Название гена не напишете?

Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 13.08.2018 10:39
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 09:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 09:48)
Ссылка на исходное сообщение  

В наборе что-либо написано, что в Вашем гене может быть альтернативный сплайсинг? Название гена не напишете?


Альтернативы быть не должно, должен быть результат на наличие экспрессии (либо да, либо нет). Набор на группу генов Cry для Bacillus thuringiensis
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 10:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Так, если это генномодифицированные растения, - там может быть одновременно несколько кассет разной длины. Это же ГРУППА генов. А последовательность праймеров Вам наверное не известна?
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 10:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 10:43)
Ссылка на исходное сообщение  Так, если это генномодифицированные растения, - там может быть одновременно несколько кассет разной длины. Это же ГРУППА генов. А последовательность праймеров Вам наверное не известна?


Это бактерии. Группа генов, но каждая пара праймеров соответствует своему гену. Последовательность праймеров имеется.

Сообщение было отредактировано AbramShimei - 13.08.2018 11:00
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 11:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Вырежите полоски из геля и почистите их, разбавьте в 1000000 раз и переПЦРьте их, доложите сколько будет полосок на геле и каких.

Если ДНК Вы выделяли из объёма микробиома, а не из клональной культуры - вполне может быть одновременно несколько изоформ в популяции.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 13.08.2018 12:27     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(AbramShimei @ 13.08.2018 10:15)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо за совет! Полимераза у нас действительно без горячего старта. Другую закупать пока не собираются, а результаты хоть как то интерпретировать требуют уже сейчас. А по такой картине, я так понимаю, никак не определить, что там получилось?

Генсек дал правильную подсказку - начинать нужно с хот-старта.
Если нет фермента с хот-стартом, делайте его "вручную" - вносите полимеразу в реакционную смесь при 80 оС и выше ПОД МАСЛО !!! во время паузы.
А забаненный заговорит Вас насмерть, не слушайте его. tongue.gif
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 12:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Хотстарт не поможет, результат будет тем же.
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 12:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 11:58)
Ссылка на исходное сообщение  
Если ДНК Вы выделяли из объёма микробиома, а не из клональной культуры - вполне может быть одновременно несколько изоформ в популяции.


Использовались изоляты
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 12:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Изоляты биотех.клональных культур или "из грязи", смеси какие-то?
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 12:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 12:55)
Ссылка на исходное сообщение  Изоляты биотех.клональных культур или "из грязи", смеси какие-то?

Это штаммы патентованные и привезенные из-за границы. Больше мне не известно, самими микробами я не занимаюсь, мне их в колбах растят.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 13.08.2018 13:00     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 13:42)
Ссылка на исходное сообщение  Хотстарт не поможет, результат будет тем же.

Если хот-старт не поможет, тогда идем праймеры разглядывать на димеры.
Если праймеры действительно такие горбатые, их никакой хот-старт не исправит, это правда.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.08.2018 13:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

что значит- заранее подобранные праймеры? Кем подобранные? В китайской статье? "коллегами" на словах передано секретное знание? В ВАШИХ руках они давали чистый продут на проверенном контроле? Начните с этого
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 13:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Вы не поверите, но иногда дело бывает в самом объекте.

Если это патентованные штаммы, и их растят неправильно (недостаточно активно отбирают), то бактерии могут избавляться от гена на плазмиде, иногда - не целиком. Потому у Вас нецелевой диапазаон получается. Ваш токсин, судя по википузии, имеет несколько активных изоформ разной длины. А бывает, что в культуре возникают дуплексы и триплексы факторов отбора.

Проделайте вырезание из геля, разбавление и перепцренье. Результат важен. Можете сделать в параллель как обычно и как советуют хотстарт.

Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 13.08.2018 14:02
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 13:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 13.08.2018 13:19)
Ссылка на исходное сообщение  что значит- заранее подобранные праймеры? Кем подобранные? В китайской статье? "коллегами" на словах передано секретное знание? В ВАШИХ руках они давали чистый продут на проверенном контроле? Начните с этого


В статьях подобранные, а как еще... Работали хорошо на штаммах собственного производства. А вот на чужих такая штука...
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 14:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Вы ПЦР-продукты, хотя бы свои, секвенировали?
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 14:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 14:04)
Ссылка на исходное сообщение  Вы ПЦР-продукты, хотя бы свои, секвенировали?


Нет такой цели, да и оборудования. У нас ПЦР чисто для подтверждения качества продукции компании... Ну плюсь там поиск генов полезных в разных штаммах, когда нужно.
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 14:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

А то, про что вы говорите, можно было бы сделать для своего интереса, но цель в данном случае не будет стоить затраченных средств. Но на будущее учту этот момент, благо даже киты для выделения из геля есть.....
(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 13:22)
Ссылка на исходное сообщение  Вы не поверите, но иногда дело бывает в самом объекте.

Проделайте вырезание из геля, разбавление и перепцренье. Результат важен. Можете сделать в параллель как обычно и как советуют хотстарт.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.08.2018 15:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

про вырезание из геля все равно не понял, что это даст? Установить, специфика или НЕспецифика? Тогда зачем разбавлять в 100 тыс раз?
Далее, улыбнуло "В статьях подобранные, а как еще... " Действительно, как еще? А самим подобрать? Ребята "в статье" как-то сделали, а Вы??? Мосх собственный дома остался? Надо бы его иногда брать с собой на работу...
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 15:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 13.08.2018 15:03)
Ссылка на исходное сообщение   Ребята "в статье" как-то сделали, а Вы??? Мосх собственный дома остался? Надо бы его иногда брать с собой на работу...


Они там тоже опираются на иностранные работы. У меня слишком узкие задачи, чтобы самостоятельно заниматься подбором. К тому же, сильно ограничены ресурсы. Я единственный молекулярный биолог в компании. Мне говорят, надо пцр-ить, я пцр-ю. Все остальное - отклонение от основных задач.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.08.2018 15:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

тогда плохо. Задача не имеет решения в общем виде. Либо Вы научаетесь их решать- оно ведь не в последний раз такое,- либо это направленьице в вашей конторе надо прикрыть
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 13.08.2018 15:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 13.08.2018 15:24)
Ссылка на исходное сообщение  тогда плохо. Задача не имеет решения в общем виде. Либо Вы научаетесь их решать- оно ведь не в последний раз такое,- либо это направленьице в вашей конторе надо прикрыть


Да насколько я понимаю, оно чисто для понта перед генеральным руководством и клиентами, которые в науке не шарят совсем.
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.08.2018 17:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

(AbramShimei @ 13.08.2018 16:16)
Ссылка на исходное сообщение  Они там тоже опираются на иностранные работы. У меня слишком узкие задачи, чтобы самостоятельно заниматься подбором. К тому же, сильно ограничены ресурсы. Я единственный молекулярный биолог в компании. Мне говорят, надо пцр-ить, я пцр-ю. Все остальное - отклонение от основных задач.

Если Вы умеете ПЦРить по готовым китам что-то - это не делает Вас биологом, тем более молекулярным.

Интересно, чем Вы собрались искать гены в культурах, если у Вас нету секвенатора или денег на эту нехитрую процедуру на чужом? Если Вы видите полоску на геле в области целевого продукта после ПЦР - это ещё не значит, что это он и есть. Контроль экспрессии токсина с литра культуры делается БЕЛКОВЫМ гелем, а не ДНКовым. Тем более, если не Вы подбирали праймеры и вообще не знаете что и какой длины должно быть между ними.

Мутные производственные регламенты, в которых или подкладывают тухлый или токсичный антибиотик/индуктор, или его недокладывают процентов 50% всегда приводит к потере экспрессии целевых продуктов культуры. Искать куда делся ген в штамме таких культур пост фактум дело безсмысленное.

Вырезать и ПЦРить полоски нужно чтобы проверить, даст ли каждая из полос только саму себя при переПЦРивании или даст 2 полосы опять, в начале будучи выделенной из одной. Как интерпретировать то и другое дальше объяснять?
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.08.2018 17:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

я бы на картинку взглянул, может, такое вырезание и не надо вовсе, может, понятно и так будет, по длинам. трудоемко это, да и навыки нужны минимальные, меня в этим месте сомневуха топчет...
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 13.08.2018 17:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

(AbramShimei @ 13.08.2018 11:31)
Ссылка на исходное сообщение  В статьях подобранные, а как еще... Работали хорошо на штаммах собственного производства. А вот на чужих такая штука...


Можете показать форезы того как оно было на своих штаммах и как оно стало на чужих?

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): R-J-Dio, banned sceptique-NMRguy
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 13.08.2018 19:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

тут опять идет игра в "угадай мелодию" с двух нот. или битва экстрасенсов.
по факту нет информации чтобы чтото обсуждать или давать советы.
надо хотя бы праймеры и протокол ПЦР, может циклы снизить можно просто, чтобы убрать неспецифику. картинки опять же, детали того как и что делали. контроли тоже нужны.

кроме того человек говорит про "экспрессию генов", но что то мне подсказывает что ПЦРят они геномную ДНК. Если нет - то как выделяли РНК, как ставили обратную транскрицию ? и т.п.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): banned sceptique-NMRguy
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 14.08.2018 09:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

(Horse-radish @ 13.08.2018 17:23)
Ссылка на исходное сообщение  Можете показать форезы того как оно было на своих штаммах и как оно стало на чужих?


Будут вам форезы...
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 14.08.2018 09:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 13.08.2018 17:15)
Ссылка на исходное сообщение  Если Вы умеете ПЦРить по готовым китам что-то - это не делает Вас биологом, тем более молекулярным.




А что, ПЦРщик это у нас отдельная профессия?? Или для того, чтобы называться биологом нужно неприменно сидеть в каком нибудь институте на кафедре за копейки??
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 14.08.2018 10:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Для того, чтобы им быть Вы должны представлять что творится в бактериальной культуре на уровне молекул и читать методически статьи по строению живого, понимать как что Вы "ловите", так и то, в подробностях, что у Вас творится в пробирках во время ПЦР.

На кафедрах сейчас платят 60-100 т.р. Если зав.каф. не ворует с глав.бухом. Вы немного отстали от жизни.
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 14.08.2018 10:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 14.08.2018 10:00)
Ссылка на исходное сообщение  

На кафедрах сейчас платят 60-100 т.р. Если зав.каф. не ворует с глав.бухом. Вы немного  отстали от жизни.


Так что-ж мои бывшие одногруппники-то получают по 15к. А на сайте кфу висит вакансия на мнс за 18?
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 14.08.2018 10:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

Вопрос к завкафу с главбухом. Жалобу на них в "народный фронт". Или в борьбу с коррупцией, можно анонимную. Если где путинские указы о реальных зарплатах нс-ам и преподам в вузах выполнены фиктивно - ректора с виновными погонят вон.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2018 10:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

не то обсуждаем. картинок все нет. хотя автор обещал смилостивиться и - так уж и быть, предоставить...Типа вам надо- ну так смотрите и не говорите, что не видели
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 14.08.2018 11:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

Ну, без картинок разговор безпредметный, это да.
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 14.08.2018 14:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

Собственно, картинки...
1) Как работало со своим штаммом.
2) Контроль со того опыта, где был свой штамм
3) Как работает с чужим штаммом
4) Контроль опыта с чужим штаммом

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): mariner182
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2018 14:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

еще б аннотировать картинки неплохо было б! Указать целевую длину, например. И лунки, где что нанесено. И число циклов укажите
Пустые гели можно не показывать, кроме того, что агароза у Вас советская (видимо, из закромов), с чудесными волосиками, или чешская, один хрен, смотреть на пустых гелях нечего
Сдается мне, там, где полосы слабые, там вообще все неспецифика- в отсутствие целевого фрагмента в геноме идет фоновая амплификация, я бы вообще не рассматривал эти полосы. Считать, что результат ПЦР отрицательный, и все

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): banned sceptique-NMRguy
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 14.08.2018 15:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

Праймеры явно старые, хранились плохо, не разаликвочены перед хранением в морозилке сразу после разбавления.

Все дорожки кроме 4 и 5 - неспецифика. Поднимите температуру отжига в каждом цикле на пару-тройку градусов, количество циклов сделайте 30, а лучше - 25.

На дорожках 4 и 5 - та же (на глаз, нужно мерить в проге трансиллюминатора с разными коррекциями) специфика. Дорога 4 - если бы не знал, что это бактерия, предположил, что гетерозигота по данному локусу между праймеров в геноме, количества шаблона специфики 300нп и 550нп примерно равно. Если бы был сиквенс, я б даже заподозрил, что это дупликация того, что фланкируют праймеры (-50нп на фланги до повтора). Либо - 2 плазмиды-продуцента с примерно одинаковой копийностью, одна из которых с 1-нарной вставкой гена, вторая - с дуплицированной вставкой.


И да, хотстарт тут явно не повредит, как и советуют выше.

Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 14.08.2018 15:41

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AbramShimei
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2018 15:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

на дупликацию весьма похоже, согласен
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 14.08.2018 16:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 14.08.2018 15:38)
Ссылка на исходное сообщение  Праймеры явно старые, хранились плохо, не разаликвочены перед хранением в морозилке сразу после разбавления.


И да, хотстарт тут явно не повредит, как и советуют выше.


Праймерам примерно полгода, разаликвочиваем сразу как приходят из бигля, а рабочие концентрации делаем непосредственно перед блоком опытов....

Насчет хот-старта сказала руководсту, не знаю, чем там дело кончится....
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 14.08.2018 16:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(R-J-Dio @ 14.08.2018 14:36)
Ссылка на исходное сообщение  еще б аннотировать картинки неплохо было б! Указать целевую длину, например.  И лунки, где что нанесено. И число циклов укажите

Пустые гели можно не показывать, кроме того, что агароза у Вас советская (видимо, из закромов), с чудесными волосиками, или чешская, один хрен, смотреть на пустых гелях нечего


Целевая длина по разным праймерам разная, в среднем около 300 п.н. Каждая лунка соответствует своему праймеру, праймеры у меня пронумерованы в данном случае просто по порядку. Число циклов: 35.

Агароза хеликоновская )) Волосики на фильтре у трансилюминатора, либо на объективе фотика, но скорее первое.

Сообщение было отредактировано AbramShimei - 14.08.2018 16:43
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.08.2018 16:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

ну и вот, 35 циклов- и еле мерекается? Куда ж больше? Либо у Вас нет таргета, что более вероятно, либо праймеры не работают даже близко к экспоненте, то есть по-русски, не ПЦРят нихрена. Кроме лунок 4 и 5, разумеется, там да. ПЦР есть. а все остальное- в пользу бедных. Уважающие себя диагносты и прочие имеют положительный контроль, то есть ПЦР-продукт, клонированный и вычитанный, соответствующий таргету в геноме. Тогда вопросов не будет, есть ПЦР или нет
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 14.08.2018 17:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

если ПЦР с геномки ставите, то сколько матрицы в реакцию кладете?

я бы вам еще посоветовал поставить раститровку по количеству циклов, например 20-25-30-35 на всех образцах.
в 4 и 5 образцах увидите скорее всего продукт рано, а в остальных вылезет неспецифика к 30-35 циклам.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): AbramShimei, Dihakar
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 14.08.2018 17:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

Праймеры когда разбавляете перед аликвоченьем обязательно добавляйте 1-2 мкл стокового 10-50х буфера ТЕ в пробирку к праймеру (к 200-300 мкл воды, в которой их растворяете). Всегда буферите их СЛЕГКА при хранении вокруг pH7.0, тогда они будут хорошо храниться в морозилке сколько угодно.

Такая грязь как у Вас обычно всплывает из-за порченных праймеров или поплывшего по температурам термоциклера. Что требует коррекции температуры отжига на 3 градуса вверх, а количества циклов - на 5-10 в меньшую сторону. Можете ещё добавлять в каждую реакцию ДМСО до финальной концентрации 10%. Тоже поднимите специфичность.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AbramShimei
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 15.08.2018 08:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

Спасибо! Будем колдовать, может что-то выйдет. Сейчас, правда, велено уже за другие праймеры браться..

P.S. Сложно быть самоучкой в такой науке...

Сообщение было отредактировано AbramShimei - 15.08.2018 09:20
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 15.08.2018 10:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

в любой науке к истинному образованию ведёт только самообучение и активная исследовательская жизненная позиция. чем раньше Вы это поймёте - тем больше всего сможете совершить.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.08.2018 10:16     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

(banned sceptique-NMRguy @ 14.08.2018 18:58)
Ссылка на исходное сообщение  Праймеры когда разбавляете перед аликвоченьем обязательно добавляйте 1-2 мкл стокового 10-50х буфера ТЕ в пробирку к праймеру (к 200-300 мкл воды, в которой их растворяете). Всегда буферите их СЛЕГКА при хранении вокруг pH7.0, тогда они будут хорошо храниться в морозилке сколько угодно.

Такая грязь как у Вас обычно всплывает из-за порченных праймеров или поплывшего по температурам термоциклера. Что требует коррекции температуры отжига на 3 градуса вверх, а количества циклов - на 5-10 в меньшую сторону. Можете ещё добавлять в каждую реакцию ДМСО до финальной концентрации 10%. Тоже поднимите специфичность.

Ну и советы, особенно 10% ДМСО no.gif
ТС, праймеры в студию! и не бУхайте полимеразы и праймеры в реакцию без меры.
И неприлично ПЦР ставить без хот-старта. no.gif
Участник оффлайн! AbramShimei




 прочитанное сообщение 15.08.2018 10:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

(-Ъ- @ 15.08.2018 10:16)
Ссылка на исходное сообщение  
И неприлично ПЦР ставить без хот-старта. no.gif


Кстати, хотела попросить для хот-старта полимеразу у содружественного вуза, а они тоже как то без нее обходятся....
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.08.2018 11:07     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

(AbramShimei @ 15.08.2018 11:34)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, хотела попросить для хот-старта полимеразу у содружественного вуза, а они тоже как то без нее обходятся....

Ну тогда попросите у меня confused.gif
И не позорьтесь тут ссылаясь на дружественные вузы frown.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): enchancer
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.08.2018 11:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

что такое "попросить"? Это конечно, кууль, но работать на "попросить" вдолгую нельзя. Купите, блин, че за проблема?

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.03.24 07:05
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft