molbiol.ru -> Проточная цитометрия, внутриклеточное окрашивание

> Все форумы > Тематические форумы > Клеточные технологии

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Проточная цитометрия, внутриклеточное окрашивание -- Раздвоение на графике светорассеяния --

Компания Biocommerce - официальный дистрибьютер продукции компаний Miltenyi Biotec GmbH (Германия) и RanD S.r.l. (Италия).

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Vally

02.02.2017 16:04

URL #1

Добрый день всем!
Мы культивируем лимфоциты с Т-клеточным активатором и ИЛ-2, на третьи сутки производим окрашивание на поверхностные (СD4) и внутриклеточные (даже внутриядерные Helios и Foxp3) антигены. Окрашивание делаем по стандартному протоколу eBiocsience. Только вместо фирменного Fix/Perm буфера используем 2% формалин в PBS. Perm буфер стандартный фирменный. После окрашивания на графике светорассеяния получаем картину "раздвоения" гейта лимфоцитов. Из-за чего это может быть? И как гейтировать, как спасти хоть что-то?)) Если мало информации, могу еще добавить. Спасибо заранее всем откликнувшимся. Картинки безобразия прикрепляю. На первой - клетки без активатора, подвергшиеся фиксации и пермеабилизации. На второй и третьей - с активатором и тоже фикс и перм.

Картинки:
картинка: ________________________________.jpg

________________________________.jpg — (16.35к)

картинка: ___________________________.jpg

___________________________.jpg — (30.14к)

картинка: ___________________________2.jpg

___________________________2.jpg — (38.54к)

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

03.02.2017 00:02

URL #2

2% формалин?

Низзя

С фирменным Perm buffer из кита eBioscience надобно юзать и фирменный Fix/Perm, ибо протокол под него "заточен" (он начинает мягкую пермеабилизацию еще в ходе префиксирования).

Либо- полностью на "рукоделие": фиксация 1% параформальдегидом в PBS (не формалином!), и пермеабилизация потом сапонином в PBS.

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

03.02.2017 00:03

URL #3

Вольтаж на FSC уменьшить стоит, а на канале SSC- увеличить.
Прибор какой?

До фикс-перм клетки прогоните, для нулевого контроля еще.

Vally

03.02.2017 09:18

URL #4

Спасибо за ответ. Что мы все-таки получили? Недопермеабилизация? А если просто увеличить время инкубации с perm буфером? Насколько критично отличие формалина и ПФА? Сейчас нет возможности быстро достать ПФА, а работать надо. Еще, если переходить на "рукоделие" - сапонин подойдет? Или лучше тритон x-100? Он есть. Про вольтаж поняла, тоже думала об этом. Прибор старинный, FACS Calibur c одним лазером, тремя ФЭУ. Нашла картинку контроля без фикс и перм и ту же пробу, но с фикс и перм. Прикрепляю, картина странная.

Vally

03.02.2017 09:21

URL #5

Вот картинки

Картинки:
картинка: ______________________________________.png

______________________________________.png — (237.39к)

картинка: ____________________________________.png

____________________________________.png — (165.4к)

Леонид В
Постоянный участник
Квебек

04.02.2017 01:40

URL #6

(Vally @ 02.02.2017 09:04)

1. 2% формалин в PBS.
2. получаем картину "раздвоения" гейта лимфоцитов. Из-за чего это может быть? И как гейтировать,
3. окрашивание на поверхностные (СD4)

1. чем отличаются формалин, формальдегид и параформальдегид посмотрите, пожалуйста, в гугле. Право, странно такие вопросы читать.

Формалин не используют в цитометрии не потому, что нельзя, а потому что он плох. Наличие спиртов и альдегидов в одном флаконе ограничивает возможности и создаёт вариабельность.
Но если ничего другого нет, то и формалин сойдёт.

2. термин “гейт“ не следует путать с термином популяция.

На Вашей картинке четко видно появление агрегатов клеток, мертвых клеток, агрегатов “живые и мертвые“ итд.
FACScalibur позволяет провести анализ H/A/W. Если Вы оставите CD4-FITC а вместо двух других добавите Propidium iodide (PI), то немедленно увидите, где агрегаты, а где нет.
(посмотрите в литературе, как это делается. Ключевые слова для поиска: Doublet discrimination)

3. Если Вы “загейтите“ CD4+ клетки, то на цветной картинке FSC/SSC Вы немедленно увидите, где лимфоциты, где их агрегаты, а где ошметки и прочий дебрис.

Если Вы без всякой фиксации прогоните Ваши клетки с PI то немедленно увидите, где живые, а где мертвые. Ваше раздвоение и растроение это появление в результате активации крупных пролиферирующих лимфобластов, умирание остальных, образование агрегатов всего и вся.

Если что-то осталось непонятным, всегда к Вашим услугам.

Vally

05.02.2017 09:18

URL #7

Леонид, спасибо огромное за подробный ответ.

Про формалин я спрашивала именно применительно к цитометрии.

Анализ H/A/W провести попробую. На CD 4 окрашивание проводили, но без PI, один гейт дал 96% СD4+, который правее, дал 98%. Буду искать PI, где-то был))

Но...В пятницу сделали еще один эксперимент.

По рекомендации Дениса (Дядя ФАКСер), уменьшила вольтаж на FSC, добавила на SSC. Картина изменилась, появились клетки, которых мы, видимо, вообще "не видели" раньше...
В понедельник смогу посмотреть файлы на предмет окрашивания на CD4.

Прикрепляю фото того, что было на графике светорассеяния в пт.

Картинки:
картинка: CmjE6fYip1k_1.jpg

CmjE6fYip1k_1.jpg — (103.96к)

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

05.02.2017 09:52

URL #8

(Леонид В @ 04.02.2017 00:40)

FACScalibur позволяет провести анализ H/A/W.

Позволяет только H/W. Не интегрирует площадь старичок. Но и сего будет достаточно для отсечки дублетов-мультиплетов.
Вот ежели Cytek upgrade стоит (для внутренностей)-тогда да: будет.

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

05.02.2017 09:58

URL #9

(Vally @ 05.02.2017 08:18)

По рекомендации Дениса (Дядя ФАКСер), уменьшила вольтаж на FSC, добавила на SSC.

Это до фиксации? Надо б еще уменьшить FSC . Лимфоциты увидели,наконец (белый гейт)

Красный- в основном,в апоптоз уходящие они же. Бурый - dead & cell debris

картинка: post_1099881_1486275477.jpg

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

05.02.2017 10:00

URL #10

(Vally @ 05.02.2017 08:18)

один гейт дал 96% СD4+, который правее, дал 98%.

Если это отсортированные CD4+, то хороший результат.
А если же это для общего пула лимфоцитов- то суровая неспицифика

Надеюсь, на поверхностные маркеры красите до фиксации а не после?

Vally

05.02.2017 11:10

URL #11

Апгрейда у прибора вроде нет никакого((( А нужно ли теперь делать Н/W? Или это в любом случае полезно?

Процент СD4+ - это в выделенных СD4 - клетках, но это в тех гейтах, которые еще на "старых", первых картинках.

Сразу после выделения тоже контролировали на проточнике, процент СD4 был хороший, 96%.

Последняя картинка - это уже 72 часа культивированные с активатором (частицы, они, видимо, в буром гейте), фикс и перм СD4+лимфоциты.

Да, поверхностные окрашиваем до фиксации.

Как еще снизить вольтаж на FSC? У меня больше не снижается)) Вот что сейчас с настройками (картинка).

Спасибо за ответы и "разбор" гейтов))

Картинки:
картинка: sZG_gHF_uPM.jpg

sZG_gHF_uPM.jpg — (223.97к)

Guest
IP-штамп: fr8ioI1Eho7.M
гость

05.02.2017 21:12

URL #12

(Vally @ 05.02.2017 11:10)

Апгрейда у прибора вроде нет никакого((( А нужно ли теперь делать Н/W? Или это в любом случае полезно?

(Vally @ 05.02.2017 11:10)

Последняя картинка - это уже 72 часа культивированные с активатором (частицы, они, видимо, в буром гейте), фикс и перм СD4+лимфоциты.

Подсказка: если пропустить на цитометре одни частицы то слово видимо в Вашей фразе можно будет опустить.

(Vally @ 05.02.2017 11:10)

Как еще снизить вольтаж на FSC? У меня больше не снижается)) Вот что сейчас с настройками (картинка).

Подсказка. Под импортным словом Voltage можно увидеть вполне понятные Ё нуль-нуль. Нажмите туда мышкой, выберете иное значение для этого Ё и посмотрите, что получится

Guest
IP-штамп: frlxzemGYp3g.
гость

06.02.2017 08:14

URL #13

(Guest @ 05.02.2017 21:12)

В случае клеток из культуры (да вообще в любом) необходимо отсекать агрегаты. Вы ведь не хотите потрясти мір открытием новой редкой популяции CD3/CD19 позитивных клеток? Или чего-либо подобного. Однако FACScalibur, если память не изменяет, может выдавать A/W только в каналах флюоресценции, отсюда рекомендация использовать PI, чтобы увидетъ DNA. Это полезно для Вас, чтобы понимать откуда появляются некоторые популяции на графиках.
Подсказка: если пропустить на цитометре одни частицы то слово видимо в Вашей фразе можно будет опустить.
Подсказка. Под импортным словом Voltage можно увидеть вполне понятные Ё нуль-нуль. Нажмите туда мышкой, выберете иное значение для этого Ё и посмотрите, что получится

Спасибо за подсказки, все сделаем))

Lenabiorobot

20.07.2018 12:03

URL #14

Коллеги, хелп! Раздваивается популяция лимфоцитов на графике прямое - боковое светорассеивание. Проверили уже все, что только можно. Дело не в приборе- приносили образец из другой лаборатории- все проходит нормально. Гоняли отдельно воду, буфер для клеток- лишних событий там нет. Меняли дозаторы, проверили лизирующий раствор и даже пробирки для взятия крови- бесполезно. На флуоресценции причем это не сказывается- картинка идеальная, раздвоение только на графике FSC SSC. Единственный случай- когда лимфоциты не раздваиваются- это без добавления антител. Но антитела всегда разные, разных производителей, разные панели, с нормальными сроками, температурный режим выдерживается. Не осталось просто мыслей с чем это связано. Картинки прилагаю.

Картинки:
картинка: ____.jpg

____.jpg — (146.14к)

Леонид В
Постоянный участник
Квебек

20.07.2018 20:11

URL #15

добавьте PI, если “обе“ популяции непроницаемы для него — будем думать, еже ни — ответ очевиден

Поблагодарили (1): Дядя ФАКСер

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

24.07.2018 16:41

URL #16

(Lenabiorobot @ 20.07.2018 11:03)

1) Где dead cell exclusion?
2) FSC-A vs FSC-H?
3) Отгейтируйте отдельно обе популяции- и гляньте маркеры.
4) Свежий образец или фиксированный? Какой протокол пробоподготовки?
5) Какой цитометр? Вижу, что DiVa софт идет. CST когда делали?

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

24.07.2018 16:46

URL #17

(Леонид В @ 20.07.2018 19:11)

добавьте PI, если “обе“ популяции непроницаемы для него — будем думать, еже ни — ответ очевиден

На doublets похоже

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

24.07.2018 17:03

URL #18

(Леонид В @ 20.07.2018 19:11)

добавьте PI,

Cудя по всему, у ребят Canto-II CS 2 лазера- 6 цветов, и панель стандартная "забита" наглухо под фенотипирование. Некуда live/dead впиндюрить (что- неправильно методологически, но у клиницистов- сплошь и рядом)

dan14444
Участник

05.10.2018 21:24

URL #19

Забавно видеть как при "раздваивании" начинают искать проблемы в анализе. А оно ж наоборот... Если дело не в тривиальных дублетах и выпотрошенных клетках, то чётко различные субпопуляции на картинке - означают столь же разные субпопуляции в анализируемой смесюге.
Плохой анализ может размыть субпопуляцию, но не может разделить её.

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

19.10.2018 22:22

URL #20

(dan14444 @ 05.10.2018 20:24)

Плохой анализ может размыть субпопуляцию, но не может разделить её.

Плохой alignment могет еще и не то учудить

dan14444
Участник

25.10.2018 21:36

URL #21

Плохой alignment могет еще и не то учудить smile.gif

А как?... ИМХО alignment могет только обратное.

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

25.10.2018 21:57

URL #22

Маска в перед детектором FSC сдвинута шаловливыми ручками, например.

dan14444
Участник

25.10.2018 22:14

URL #23

Всё равно не вижу, откуда раздвоение на две чёткие субпопуляции возьмётся...

Дядя ФАКСер
moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

26.10.2018 14:09

URL #24

В том случае- это просто даблеты, либо активированные и делящиеся лимфоциты (для ответа на сей вопрос - я предложил же выше алгоритм, коему следовать надо)

Lenabiorobot

21.02.2019 14:41

URL #25

Спасибо всем за помощь, проблема решилась увеличением времени лизирования. Может кому пригодится.

watchesonline89
Постоянный участник

05.01.2023 11:49

URL #26

https://omegawatches89.mystrikingly.com/
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248
https://eatsleepride.com/c/383270
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0
https://omegawatches90.mystrikingly.com/
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online
https://62e8da780bf7c.site123.me/
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.