Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Vally |
Мы культивируем лимфоциты с Т-клеточным активатором и ИЛ-2, на третьи сутки производим окрашивание на поверхностные (СD4) и внутриклеточные (даже внутриядерные Helios и Foxp3) антигены. Окрашивание делаем по стандартному протоколу eBiocsience. Только вместо фирменного Fix/Perm буфера используем 2% формалин в PBS. Perm буфер стандартный фирменный. После окрашивания на графике светорассеяния получаем картину "раздвоения" гейта лимфоцитов. Из-за чего это может быть? И как гейтировать, как спасти хоть что-то?)) Если мало информации, могу еще добавить. Спасибо заранее всем откликнувшимся. Картинки безобразия прикрепляю. На первой - клетки без активатора, подвергшиеся фиксации и пермеабилизации. На второй и третьей - с активатором и тоже фикс и перм. Картинки: ________________________________.jpg — (16.35к) ___________________________.jpg — (30.14к) ___________________________2.jpg — (38.54к) |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
Низзя С фирменным Perm buffer из кита eBioscience надобно юзать и фирменный Fix/Perm, ибо протокол под него "заточен" (он начинает мягкую пермеабилизацию еще в ходе префиксирования). Либо- полностью на "рукоделие": фиксация 1% параформальдегидом в PBS (не формалином!), и пермеабилизация потом сапонином в PBS. |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
Прибор какой? До фикс-перм клетки прогоните, для нулевого контроля еще. |
Vally |
|
Vally |
Картинки: ______________________________________.png — (237.39к) ____________________________________.png — (165.4к) |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
(Vally @ 02.02.2017 09:04) 1. 2% формалин в PBS. 2. получаем картину "раздвоения" гейта лимфоцитов. Из-за чего это может быть? И как гейтировать, 3. окрашивание на поверхностные (СD4) 1. чем отличаются формалин, формальдегид и параформальдегид посмотрите, пожалуйста, в гугле. Право, странно такие вопросы читать. Формалин не используют в цитометрии не потому, что нельзя, а потому что он плох. Наличие спиртов и альдегидов в одном флаконе ограничивает возможности и создаёт вариабельность. Но если ничего другого нет, то и формалин сойдёт. 2. термин “гейт“ не следует путать с термином популяция. На Вашей картинке четко видно появление агрегатов клеток, мертвых клеток, агрегатов “живые и мертвые“ итд. FACScalibur позволяет провести анализ H/A/W. Если Вы оставите CD4-FITC а вместо двух других добавите Propidium iodide (PI), то немедленно увидите, где агрегаты, а где нет. (посмотрите в литературе, как это делается. Ключевые слова для поиска: Doublet discrimination) 3. Если Вы “загейтите“ CD4+ клетки, то на цветной картинке FSC/SSC Вы немедленно увидите, где лимфоциты, где их агрегаты, а где ошметки и прочий дебрис. Если Вы без всякой фиксации прогоните Ваши клетки с PI то немедленно увидите, где живые, а где мертвые. Ваше раздвоение и растроение это появление в результате активации крупных пролиферирующих лимфобластов, умирание остальных, образование агрегатов всего и вся. Если что-то осталось непонятным, всегда к Вашим услугам. |
Vally |
Про формалин я спрашивала именно применительно к цитометрии. Анализ H/A/W провести попробую. На CD 4 окрашивание проводили, но без PI, один гейт дал 96% СD4+, который правее, дал 98%. Буду искать PI, где-то был)) Но...В пятницу сделали еще один эксперимент. По рекомендации Дениса (Дядя ФАКСер), уменьшила вольтаж на FSC, добавила на SSC. Картина изменилась, появились клетки, которых мы, видимо, вообще "не видели" раньше... В понедельник смогу посмотреть файлы на предмет окрашивания на CD4. Прикрепляю фото того, что было на графике светорассеяния в пт. Картинки: CmjE6fYip1k_1.jpg — (103.96к) |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Леонид В @ 04.02.2017 00:40) Позволяет только H/W. Не интегрирует площадь старичок. Но и сего будет достаточно для отсечки дублетов-мультиплетов. Вот ежели Cytek upgrade стоит (для внутренностей)-тогда да: будет. |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Vally @ 05.02.2017 08:18) Это до фиксации? Надо б еще уменьшить FSC . Лимфоциты увидели,наконец (белый гейт) Красный- в основном,в апоптоз уходящие они же. Бурый - dead & cell debris |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Vally @ 05.02.2017 08:18) Если это отсортированные CD4+, то хороший результат. А если же это для общего пула лимфоцитов- то суровая неспицифика Надеюсь, на поверхностные маркеры красите до фиксации а не после? |
Vally |
Процент СD4+ - это в выделенных СD4 - клетках, но это в тех гейтах, которые еще на "старых", первых картинках. Сразу после выделения тоже контролировали на проточнике, процент СD4 был хороший, 96%. Последняя картинка - это уже 72 часа культивированные с активатором (частицы, они, видимо, в буром гейте), фикс и перм СD4+лимфоциты. Да, поверхностные окрашиваем до фиксации. Как еще снизить вольтаж на FSC? У меня больше не снижается)) Вот что сейчас с настройками (картинка). Спасибо за ответы и "разбор" гейтов)) Картинки: sZG_gHF_uPM.jpg — (223.97к) |
Guest IP-штамп: fr8ioI1Eho7.M гость |
(Vally @ 05.02.2017 11:10) Апгрейда у прибора вроде нет никакого((( А нужно ли теперь делать Н/W? Или это в любом случае полезно? В случае клеток из культуры (да вообще в любом) необходимо отсекать агрегаты. Вы ведь не хотите потрясти мір открытием новой редкой популяции CD3/CD19 позитивных клеток? Или чего-либо подобного. Однако FACScalibur, если память не изменяет, может выдавать A/W только в каналах флюоресценции, отсюда рекомендация использовать PI, чтобы увидетъ DNA. Это полезно для Вас, чтобы понимать откуда появляются некоторые популяции на графиках. (Vally @ 05.02.2017 11:10) Последняя картинка - это уже 72 часа культивированные с активатором (частицы, они, видимо, в буром гейте), фикс и перм СD4+лимфоциты. Подсказка: если пропустить на цитометре одни частицы то слово видимо в Вашей фразе можно будет опустить. (Vally @ 05.02.2017 11:10) Как еще снизить вольтаж на FSC? У меня больше не снижается)) Вот что сейчас с настройками (картинка). Подсказка. Под импортным словом Voltage можно увидеть вполне понятные Ё нуль-нуль. Нажмите туда мышкой, выберете иное значение для этого Ё и посмотрите, что получится |
Guest IP-штамп: frlxzemGYp3g. гость |
(Guest @ 05.02.2017 21:12) В случае клеток из культуры (да вообще в любом) необходимо отсекать агрегаты. Вы ведь не хотите потрясти мір открытием новой редкой популяции CD3/CD19 позитивных клеток? Или чего-либо подобного. Однако FACScalibur, если память не изменяет, может выдавать A/W только в каналах флюоресценции, отсюда рекомендация использовать PI, чтобы увидетъ DNA. Это полезно для Вас, чтобы понимать откуда появляются некоторые популяции на графиках. Подсказка: если пропустить на цитометре одни частицы то слово видимо в Вашей фразе можно будет опустить. Подсказка. Под импортным словом Voltage можно увидеть вполне понятные Ё нуль-нуль. Нажмите туда мышкой, выберете иное значение для этого Ё и посмотрите, что получится Спасибо за подсказки, все сделаем)) |
Lenabiorobot |
Картинки: ____.jpg — (146.14к) |
Леонид В Постоянный участник Квебек |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Lenabiorobot @ 20.07.2018 11:03) Коллеги, хелп! Раздваивается популяция лимфоцитов на графике прямое - боковое светорассеивание. Проверили уже все, что только можно. Дело не в приборе- приносили образец из другой лаборатории- все проходит нормально. Гоняли отдельно воду, буфер для клеток- лишних событий там нет. Меняли дозаторы, проверили лизирующий раствор и даже пробирки для взятия крови- бесполезно. На флуоресценции причем это не сказывается- картинка идеальная, раздвоение только на графике FSC SSC. Единственный случай- когда лимфоциты не раздваиваются- это без добавления антител. Но антитела всегда разные, разных производителей, разные панели, с нормальными сроками, температурный режим выдерживается. Не осталось просто мыслей с чем это связано. Картинки прилагаю. 1) Где dead cell exclusion? 2) FSC-A vs FSC-H? 3) Отгейтируйте отдельно обе популяции- и гляньте маркеры. 4) Свежий образец или фиксированный? Какой протокол пробоподготовки? 5) Какой цитометр? Вижу, что DiVa софт идет. CST когда делали? |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Леонид В @ 20.07.2018 19:11) На doublets похоже |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(Леонид В @ 20.07.2018 19:11) Cудя по всему, у ребят Canto-II CS 2 лазера- 6 цветов, и панель стандартная "забита" наглухо под фенотипирование. Некуда live/dead впиндюрить (что- неправильно методологически, но у клиницистов- сплошь и рядом) |
dan14444 Участник |
Плохой анализ может размыть субпопуляцию, но не может разделить её. |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
(dan14444 @ 05.10.2018 20:24) Плохой alignment могет еще и не то учудить |
dan14444 Участник |
Плохой alignment могет еще и не то учудить smile.gif А как?... ИМХО alignment могет только обратное. |
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
dan14444 Участник |
|
Дядя ФАКСер moderator Nothern Maccaronia, Ticinum |
|
Lenabiorobot |
|
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |