Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Егор Бобров |
Я новичок в деле ПЦР в реальном времени, поэтому при проведении опытов ожидал не самых гладких результатов. Однако такая картина меня очень сильно удивила. Кривая флуоресценции в некоторых пробах пошла вверх на первых же циклах, вскоре вышла на плато, а потом опять пошла вверх. С чем такой результат может быть связан? Как этого избежать? Спасибо! Картинки: 2.04.PNG — (21.33к) 29.03.PNG — (19.65к) |
Guest IP-штамп: frwB36QXctn1E гость |
|
RNK Постоянный участник СССР |
Вас должно интересовать только то, что детектируется до 30 циклов, ну уж ни как выше 30 циклов. Вы наблюдаете артефакты, а не позитивный результат. Одна копия вмплифицируемого фрагмента в геномной ДНК детектируется до 30 циклов. Все ваши кривые, что вы наблюдаете после 35 циклов, это артефакт, у вас нет там ничего ценного. Проверьте эти ПЦР продукты электрофорезом. Вообще это плохая практика делать 40 циклов, пустая трата времени. Если ПЦР условия подобраны правильно и ПЦР идёт эффективно, то уже к 20 циклам детектируется одна копийния гена на геном человека. Очень эффективная полимераза для qPCR: Thermo Scientific Phire Hot Start II DNA Polymerase кроме того, можно использовать в реакции раз 5 меньше рекомендуемой концентрации и ПЦР проводить в 10 мкл. Тогда 1000 U Phire Hot Start II DNA Polymerase за 400 евро превращается в 12 тыс реакций. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
И вообще, расскажите что-нибудь про ... все Кривая выходит на плато после 10-ого цикла - это круто! Я думал, что только я умею... Зонд чудит сам с собой, без матрицы. RNK в принципе прав, но теоретически. Еасли в реакции все ОК, и после 50 циклов ничего не поднимается. |
RNK Постоянный участник СССР |
Этот второй выход вверх, вероятно результат деградации пробы и вообще всего, что в реакции может светиться, ДНК не деградирует, а только флюорисцентрая метка отщепляется от олига (мой предположения). Для других образцов, кривая подымается к 30 циклам, что также удовлетворительно. Но имеются такие образцы у которых подъём начинается после 36 цикла, это деградация пробы, и не стоит обращать на эти образцы внимание. Конечно, в каждом случае что-о своё, и возможно, что я ошибаюсь. И в 40 циклов что-то амплифицируется, ожидаемое. Сообщение было отредактировано RNK - 01.05.2013 20:36 |
Guest IP-штамп: frwB36QXctn1E гость |
Это или биорад придуривается (я на нем вообще часто ставлю первые 10 циклов без съема флуоресценции), или что-то медленно стекает со стенок в низ лунки. Да и вообще больше на ошибку программы похоже, приведите, плиз, сырые графики флуоресценции. И стартовое количество материала какое? |
kloun IP-штамп: frDDJret4PE4A гость |
|
AlexRez Постоянный участник Екатеринбург |
С RNK не соглашусь, это только в идеальных условиях теоретически так бывает. Практически, целевой продукт может появляться (в достаточном количестве) и на более поздних циклах (40-45). Это проверено не только форезом, но и сиквенсом. Зонды выдерживают и 50 и 60 циклов без видимой деградации. И деградация скорее выражается в снижении уровня сигнала из-за разрушения флуоресцирующей метки, а не зонда в целом. Кривые на последних циклах слишком правильные и подъем слишком значительный для деградации. |
AlexRez Постоянный участник Екатеринбург |
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
может у вас пластик под прибор не подходит попробуйте стрипы если ставили в плашке кстати в этом отношении лучше всего стрипы\планшеты с белыми стенками имхо |
бутанол Постоянный участник Новосибирск |
|
Yuri K IP-штамп: frO84jFrTPiQA гость |
То, что видно на этих кривых, это артифакты дизайна или эффект от пузырьков воздуха в лунках. Или в образце дохренищи баластной РНК.
|
guest: Саня IP-штамп: fr/9gxL6jBvmM гость |
|
campus Участник Иркутск |
Кривая выходит на плато после 10-ого цикла - это круто! Я думал, что только я умею... когда со штаммом работаем, у нас и после 5-го цикла выхлоп начинается |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
где калибровачные кривые с плазмид ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 02.05.2013 17:20) Одна копия до 30 циклов, это сильное преувеличение. Ну вот счас я гонял калибровку на Био-Раде ЦФХ96, и при эффективности ПЦР 96% 1,400 копий видно на 25 циклах с СИБРом и на 30 в этой же реакции с ТакМаном. Одна копия, следовательно, будет видна еще через 10 циклов, т е 35 с СИБРом и 40 с такМаном. Картинки в сети в целом с такими же результатами, напр То, что видно на этих кривых, это артифакты дизайна или эффект от пузырьков воздуха в лунках. Или в образце дохренищи баластной РНК. почему приувеличение 2 в 30-й степени - миллиард чтук днков |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 02.05.2013 17:20) Одна копия до 30 циклов, это сильное преувеличение. Ну вот счас я гонял калибровку на Био-Раде ЦФХ96, и при эффективности ПЦР 96% 1,400 копий видно на 25 циклах с СИБРом и на 30 в этой же реакции с ТакМаном. Одна копия, следовательно, будет видна еще через 10 циклов, т е 35 с СИБРом и 40 с такМаном. Картинки в сети в целом с такими же результатами, напр То, что видно на этих кривых, это артифакты дизайна или эффект от пузырьков воздуха в лунках. Или в образце дохренищи баластной РНК. еффективность обычно 100 плюс/минус 10% если в качестве темплата для стандартной кривой 90 нт олиг беза шпилек и не кривые праймеры - то 110 % получите |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 02.05.2013 17:20) Одна копия до 30 циклов, это сильное преувеличение. Ну вот счас я гонял калибровку на Био-Раде CFX96, и при эффективности ПЦР 96% 1,400 копий видно на 25 циклах с СИБРом и на 30 в этой же реакции с ТакМаном. Одна копия, следовательно, будет видна еще через 10 циклов, т е 35 с СИБРом и 40 с такМаном. Картинки в сети в целом с такими же результатами, напр То, что видно на этих кривых, это артифакты дизайна или эффект от пузырьков воздуха в лунках. Или в образце дохренищи баластной РНК. |
Yuri K IP-штамп: frO84jFrTPiQA гость |
(Guest @ 07.05.2013 11:16) А что есть миллиард молекул, 10^9 что ли? Это каких-то жалких полтора фемтомоля. Ты даже чистый флюоресцеин на фоне воды не увидишь в таком количестве. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 07.05.2013 19:56) А что есть миллиард молекул, 10^9 что ли? Это каких-то жалких полтора фемтомоля. Ты даже чистый флюоресцеин на фоне воды не увидишь в таком количестве. можно в килограммах ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 07.05.2013 19:56) А что есть миллиард молекул, 10^9 что ли? Это каких-то жалких полтора фемтомоля. Ты даже чистый флюоресцеин на фоне воды не увидишь в таком количестве. не знаю сколько в молях , но 20 пикограмм 100бп ПЦР продукта прекрасно видно на агарозном геле с ГелСтаром |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 07.05.2013 19:56) А что есть миллиард молекул, 10^9 что ли? Это каких-то жалких полтора фемтомоля. Ты даже чистый флюоресцеин на фоне воды не увидишь в таком количестве. 20 пикограм 100 бп получаетася 300 атоммоля ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 08.05.2013 06:48) |
Yuri K IP-штамп: frO84jFrTPiQA гость |
(Guest @ 08.05.2013 06:48) Подсказка: погугли на "число Авогадро". |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 09.05.2013 16:44) погуглил - всеравно 20 пикограммов 100 бп ПЦР продукта - 308 атоммолей |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 09.05.2013 16:44) наверно у тебя гугла неправилный , если 20 пикограмм 100 бп ДНК не 308 атто |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 09.05.2013 16:44) если твоя биорадовская реал-тайм тарахтелка не видит одну копию - ставь обычный пцр и агарозу |
Yuri K IP-штамп: frO84jFrTPiQA гость |
(Guest @ 10.05.2013 07:55) Это мозги у тебя какие-то неправильные. 10^9 молекул, это полтора аттомоля, независимо от пикограммов и длинны продукта. Хоть это 20-ка праймер, хоть плазмида pBR322, хоть целая хромосома. Нахрен ты пикограммы приплел сюда? Хорош спамить. |
kblag Постоянный участник |
|
atypus |
(Егор Бобров @ 01.05.2013 00:43) Здравствуйте, уважаемые коллеги. Я новичок в деле ПЦР в реальном времени, поэтому при проведении опытов ожидал не самых гладких результатов. Однако такая картина меня очень сильно удивила. Кривая флуоресценции в некоторых пробах пошла вверх на первых же циклах, вскоре вышла на плато, а потом опять пошла вверх. С чем такой результат может быть связан? Как этого избежать? Спасибо! Вы неверно интерпретируете ваши графики. На самом деле здесь дело в том, что прибор неверно обработал информацию о флуоресценции. Вы смотрите не на исходные данные, а на обработанные. Те кривые, которые, как вы считаете, вышли на первых циклах, они на самом деле вышли на последних. Изменение же флуоресценции на первых циклах происходит из-за пузырей и капель в реакционной среде и на стенках пробирок, а вовсе не из-за накопления продукта амплификации. Через несколько циклов пузыри лопаются, капли на стенках испаряются и флуоресценция приходит на нулевой уровень, от которого и надо плясать. Именно по этой причине во многих программах амплификации первые 5, а то и 10 циклов делают без считывания флуоресценции, чтобы прибор не путался и мог нормально определить нулевой уровень флуоресценции. Итого: с ваше реакцией всё в порядке. Делайте первые 5 циклов без считывания флуоресценции и будет всё красиво. _____________ Сергей Тюленев.
|
dk Постоянный участник Россия |
Егор Бобров - 30.04.2013 atypus - вчера, 15:01
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(dk @ 10.10.2017 14:12) Очень радует смотреть подобные "некрофильские" темы. Егор Бобров - 30.04.2013 atypus - вчера, 15:01 Ну дык у ботов очень своеобразное чувство времени. Воскрешение зомби-топиков - обычное для них дело. |
tarhairath Москва |
Это или биорад придуривается (я на нем вообще часто ставлю первые 10 циклов без съема флуоресценции), или что-то медленно стекает со стенок в низ лунки. Да и вообще больше на ошибку программы похоже, приведите, плиз, сырые графики флуоресценции. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |