molbiol.ru -> Странные результаты Real-time PCR

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Странные результаты Real-time PCR

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Егор Бобров

30.04.2013 23:43

URL #1

Здравствуйте, уважаемые коллеги.
Я новичок в деле ПЦР в реальном времени, поэтому при проведении опытов ожидал не самых гладких результатов. Однако такая картина меня очень сильно удивила. Кривая флуоресценции в некоторых пробах пошла вверх на первых же циклах, вскоре вышла на плато, а потом опять пошла вверх. С чем такой результат может быть связан? Как этого избежать?

Спасибо!

Картинки:
картинка: 2.04.PNG

2.04.PNG — (21.33к)

картинка: 29.03.PNG

29.03.PNG — (19.65к)

Guest
IP-штамп: frwB36QXctn1E
гость

01.05.2013 13:47

URL #2

Плашку/стрипы сбрасывали перед ПЦР?

Поблагодарили (1): Flyamer

RNK
Постоянный участник
СССР

01.05.2013 19:21

URL #3

Когда количество ПЦР циклов под 40, наблюдается деградация флюрисцентных проб и праймеров и другие сюрпризы, что вы и наблюдаете.

Вас должно интересовать только то, что детектируется до 30 циклов, ну уж ни как выше 30 циклов.
Вы наблюдаете артефакты, а не позитивный результат.

Одна копия вмплифицируемого фрагмента в геномной ДНК детектируется до 30 циклов.

Все ваши кривые, что вы наблюдаете после 35 циклов, это артефакт, у вас нет там ничего ценного.

Проверьте эти ПЦР продукты электрофорезом.
Вообще это плохая практика делать 40 циклов, пустая трата времени.

Если ПЦР условия подобраны правильно и ПЦР идёт эффективно, то уже к 20 циклам детектируется одна копийния гена на геном человека.

Очень эффективная полимераза для qPCR:

Thermo Scientific Phire Hot Start II DNA Polymerase
http://www.thermoscientificbio.com/pcr-enz...dna-polymerase/

кроме того, можно использовать в реакции раз 5 меньше рекомендуемой концентрации и ПЦР проводить в 10 мкл. Тогда 1000 U Phire Hot Start II DNA Polymerase за 400 евро превращается в 12 тыс реакций.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

01.05.2013 20:01

URL #4

А какие были использованы в ПЦР пробы, то биш зонды, Hydro или Hybro?
И вообще, расскажите что-нибудь про ... все

Кривая выходит на плато после 10-ого цикла - это круто! Я думал, что только я умею...

Зонд чудит сам с собой, без матрицы.
RNK в принципе прав, но теоретически.

Еасли в реакции все ОК, и после 50 циклов ничего не поднимается.

RNK
Постоянный участник
СССР

01.05.2013 20:15

URL #5

На кривых видно, что уже к 10 циклам реакция выходит на "плато", а к 40 циклам снова идет вверх.
Этот второй выход вверх, вероятно результат деградации пробы и вообще всего, что в реакции может светиться, ДНК не деградирует, а только флюорисцентрая метка отщепляется от олига (мой предположения).

Для других образцов, кривая подымается к 30 циклам, что также удовлетворительно.

Но имеются такие образцы у которых подъём начинается после 36 цикла, это деградация пробы, и не стоит обращать на эти образцы внимание.

Конечно, в каждом случае что-о своё, и возможно, что я ошибаюсь.
И в 40 циклов что-то амплифицируется, ожидаемое.

Сообщение было отредактировано RNK - 01.05.2013 20:36

Guest
IP-штамп: frwB36QXctn1E
гость

02.05.2013 02:08

URL #6

Чтобы подъем начинался от первых циклов, надо в ПЦРку её же и бухнуть из предыдущей пробирки, такого количества геномки чисто физически насыпать нельзя.
Это или биорад придуривается (я на нем вообще часто ставлю первые 10 циклов без съема флуоресценции), или что-то медленно стекает со стенок в низ лунки.
Да и вообще больше на ошибку программы похоже, приведите, плиз, сырые графики флуоресценции.
И стартовое количество материала какое?

kloun
IP-штамп: frDDJret4PE4A
гость

02.05.2013 06:55

URL #7

Сложно сказать про ранние циклы, но я видел на праймерах на рибосомную РНКу Ср=5, и 7, и 8 видел. Судя по картинке, там Ср около 7-8 - то есть, если пара гамм РНКи в реакции и разведена всего раз в 5-20, то можно получить плато до 12 циклов. А если взят ПЦР продукт как матрица - то и плато в 10 будет.

AlexRez
Постоянный участник
Екатеринбург

02.05.2013 08:47

URL #8

До 10-го цикла - это не целевой продукт. Это "грязь" светится. Скорее всего химический дефект. Может в пробирке (реакционная смесь, проба), может в самом приборе что осталось. Потом это выгорает. Поставьте реакцию без пробы и вообще пустую пробирку - получите такой же подъем. Хотя, возможно, и программа привирает. Целевой продукт начинает появляться после 25-го цикла и позже.

С RNK не соглашусь, это только в идеальных условиях теоретически так бывает. Практически, целевой продукт может появляться (в достаточном количестве) и на более поздних циклах (40-45). Это проверено не только форезом, но и сиквенсом. Зонды выдерживают и 50 и 60 циклов без видимой деградации. И деградация скорее выражается в снижении уровня сигнала из-за разрушения флуоресцирующей метки, а не зонда в целом. Кривые на последних циклах слишком правильные и подъем слишком значительный для деградации.

AlexRez
Постоянный участник
Екатеринбург

02.05.2013 08:50

URL #9

Чтобы избежать этого явления начинайте фотографировать после 5 - 10 цикла.

ernesta88
Постоянный участник
москва

02.05.2013 11:23

URL #10

кстати у меня так было когда плашка не подошла под прибор такое ощущение что сигналы из соседних лунок перебивают друг друга - в стрипах такого никогда не было даже если они совсем левые были

может у вас пластик под прибор не подходит попробуйте стрипы если ставили в плашке

кстати в этом отношении лучше всего стрипы\планшеты с белыми стенками имхо

бутанол
Постоянный участник
Новосибирск

02.05.2013 14:05

URL #11

а это не может быть деградацией зонда ДНКазами? Если ДНК не очень чистая... А еще интересно как в биорадовском приборе фон убирается? Ведь обычно уровень фоновой флюоресценции в пробах сильно разнится. Программа приводит это все к единому знаменателю. Может масло стекло и изменило интенсивность флюоресценции?

Yuri K
IP-штамп: frO84jFrTPiQA
гость

02.05.2013 17:20

URL #12

Одна копия до 30 циклов, это сильное преувеличение. Ну вот счас я гонял калибровку на Био-Раде CFX96, и при эффективности ПЦР 96% 1,400 копий видно на 25 циклах с СИБРом и на 30 в этой же реакции с ТакМаном. Одна копия, следовательно, будет видна еще через 10 циклов, т е 35 с СИБРом и 40 с такМаном. Картинки в сети в целом с такими же результатами, напр http://aem.asm.org/content/77/18/6486/F1.large.jpg

То, что видно на этих кривых, это артифакты дизайна или эффект от пузырьков воздуха в лунках. Или в образце дохренищи баластной РНК.

Поблагодарили (1): yamiren

guest: Саня
IP-штамп: fr/9gxL6jBvmM
гость

06.05.2013 17:31

URL #13

Очень высокая фоновая флуоресценция. Перегруз реакции нуклеиновой кислотой. Ну или на самом деле "грязь".

campus
Участник
Иркутск

07.05.2013 10:45

URL #14

[quote=-Ъ-,01.05.2013 10:01]

Кривая выходит на плато после 10-ого цикла - это круто! Я думал, что только я умею...

когда со штаммом работаем, у нас и после 5-го цикла выхлоп начинается

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

07.05.2013 11:10

URL #15

кривые нарисуйте в стандартном логарифме - что за манера линейные кривули глядеть непонятно чего СИБРы или Такманы

где калибровачные кривые с плазмид ?

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

07.05.2013 11:16

URL #16

(Yuri K @ 02.05.2013 17:20)

Одна копия до 30 циклов, это сильное преувеличение. Ну вот счас я гонял калибровку на Био-Раде ЦФХ96, и при эффективности ПЦР 96% 1,400 копий видно на 25 циклах с СИБРом и на 30 в этой же реакции с ТакМаном. Одна копия, следовательно, будет видна еще через 10 циклов, т е 35 с СИБРом и 40 с такМаном. Картинки в сети в целом с такими же результатами, напр хттп://аем.асм.орг/цонтент/77/18/6486/Ф1.ларге.йпг

То, что видно на этих кривых, это артифакты дизайна или эффект от пузырьков воздуха в лунках. Или в образце дохренищи баластной РНК.

почему приувеличение 2 в 30-й степени - миллиард чтук днков

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

07.05.2013 11:31

URL #17

(Yuri K @ 02.05.2013 17:20)

еффективность обычно 100 плюс/минус 10%

если в качестве темплата для стандартной кривой 90 нт олиг беза шпилек и не кривые праймеры - то 110 % получите

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

07.05.2013 11:38

URL #18

(Yuri K @ 02.05.2013 17:20)

http://tools.invitrogen.com/content/sfs/ap...20of%20qPCR.pdf

Yuri K
IP-штамп: frO84jFrTPiQA
гость

07.05.2013 19:56

URL #19

(Guest @ 07.05.2013 11:16)

почему приувеличение 2 в 30-й степени - миллиард чтук днков

А что есть миллиард молекул, 10^9 что ли? Это каких-то жалких полтора фемтомоля. Ты даже чистый флюоресцеин на фоне воды не увидишь в таком количестве.

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

08.05.2013 06:35

URL #20

(Yuri K @ 07.05.2013 19:56)

можно в килограммах ?

http://www.clarechemical.com/gelstar.htm

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

08.05.2013 06:42

URL #21

(Yuri K @ 07.05.2013 19:56)

не знаю сколько в молях , но 20 пикограмм 100бп ПЦР продукта прекрасно видно на агарозном геле с ГелСтаром

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

08.05.2013 06:48

URL #22

(Yuri K @ 07.05.2013 19:56)

20 пикограм 100 бп получаетася 300 атоммоля ?

http://www.***.ru/scripts/01_07.html

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

08.05.2013 06:52

URL #23

(Guest @ 08.05.2013 06:48)

20 пикограм 100 бп получаетася 300 атоммоля ?

http://www.***.ru/scripts/01_07.html

http://www.sciencelauncher.com/mwcalc.html

Yuri K
IP-штамп: frO84jFrTPiQA
гость

09.05.2013 16:44

URL #24

(Guest @ 08.05.2013 06:48)

20 пикограм 100 бп получаетася 300 атоммоля ?

http://www.***.ru/scripts/01_07.html

Подсказка: погугли на "число Авогадро".

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

10.05.2013 07:50

URL #25

(Yuri K @ 09.05.2013 16:44)

Подсказка: погугли на "число Авогадро".

погуглил - всеравно 20 пикограммов 100 бп ПЦР продукта - 308 атоммолей

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

10.05.2013 07:55

URL #26

(Yuri K @ 09.05.2013 16:44)

Подсказка: погугли на "число Авогадро".

наверно у тебя гугла неправилный , если 20 пикограмм 100 бп ДНК не 308 атто

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

10.05.2013 08:07

URL #27

(Yuri K @ 09.05.2013 16:44)

Подсказка: погугли на "число Авогадро".

если твоя биорадовская реал-тайм тарахтелка не видит одну копию - ставь обычный пцр и агарозу

Yuri K
IP-штамп: frO84jFrTPiQA
гость

13.05.2013 16:54

URL #28

(Guest @ 10.05.2013 07:55)

наверно у тебя гугла неправилный , если 20 пикограмм 100 бп ДНК не 308 атто

Это мозги у тебя какие-то неправильные. 10^9 молекул, это полтора аттомоля, независимо от пикограммов и длинны продукта. Хоть это 20-ка праймер, хоть плазмида pBR322, хоть целая хромосома. Нахрен ты пикограммы приплел сюда? Хорош спамить.

kblag
Постоянный участник

15.05.2013 14:49

URL #29

Нужно посмотреть на кривые до нормировки по фону.

atypus

09.10.2017 17:01

URL #30

(Егор Бобров @ 01.05.2013 00:43)

Вы неверно интерпретируете ваши графики. На самом деле здесь дело в том, что прибор неверно обработал информацию о флуоресценции. Вы смотрите не на исходные данные, а на обработанные. Те кривые, которые, как вы считаете, вышли на первых циклах, они на самом деле вышли на последних. Изменение же флуоресценции на первых циклах происходит из-за пузырей и капель в реакционной среде и на стенках пробирок, а вовсе не из-за накопления продукта амплификации. Через несколько циклов пузыри лопаются, капли на стенках испаряются и флуоресценция приходит на нулевой уровень, от которого и надо плясать.
Именно по этой причине во многих программах амплификации первые 5, а то и 10 циклов делают без считывания флуоресценции, чтобы прибор не путался и мог нормально определить нулевой уровень флуоресценции.
Итого: с ваше реакцией всё в порядке. Делайте первые 5 циклов без считывания флуоресценции и будет всё красиво.
_____________
Сергей Тюленев.

Поблагодарили (1): Fanat MMM

dk
Постоянный участник
Россия

10.10.2017 16:12

URL #31

Очень радует смотреть подобные "некрофильские" темы.
Егор Бобров - 30.04.2013
atypus - вчера, 15:01

Поблагодарили (1): Ivalex

Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far

11.10.2017 17:36

URL #32

(dk @ 10.10.2017 14:12)

Очень радует смотреть подобные "некрофильские" темы.
Егор Бобров - 30.04.2013
atypus - вчера, 15:01

Ну дык у ботов очень своеобразное чувство времени. Воскрешение зомби-топиков - обычное для них дело.

tarhairath

Москва

15.10.2017 10:59

URL #33

watchesbiz
Постоянный участник

23.11.2021 14:54

URL #34

https://archives.profsurv.com/forum/Profess...ert/-67881.aspx
https://atlanta.bubblelife.com/community/an...ex_Watch_Online
https://gumroad.com/rolexrelicawatches/p/di...replica-watches
https://onmogul.com/stories/guide-on-how-to...ex-watch-online
https://list.ly/i/5704105
https://www.behance.net/gallery/114237003/Replica-Rolex
https://www.mlbdailydish.com/users/Replicarolexwatches
http://replicawatches24.simplesite.com/
https://watcheshutuk.cabanova.com/
https://www.pinterest.com/watcheshutuk/_saved/
https://www.linkedin.com/pulse/guide-how-pu...online-hei-bai/
https://justpaste.it/8t11q
https://padlet.com/watcheshutuk/in2opwnfmnmclce8
https://www.allforxi.com/users/Replicarolexwatches
https://profile.hatena.ne.jp/Rolexrelicawatches/profile

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.