 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* E.coli Компетентные клетки с помощью PEG.
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
  |
 05.08.2001 14:19
A s PEGom khorosho vykhodit na kletkakh XL-1. Nuansy... Kletki ne doljny pererasti. Luchshe pust' men'she plotnost' budet. Nu i vsyo doljno byt' kholodnym: bufera, tsentrifujnye stakany, rotor, probirki, ta korobka kuda vy ikh slojite.... Prichyom eto vsyo doljno byt' kholodnym DO togo kak vy pristupite sobstvenno k prigotovleniu kletok. Ne rasstraivaites', sperva ni u kogo ne poluchaetsya. Krome togo, davno podmecheno, chto u baryshen' kletki vykhodyat vsegda luchshe! Esli "k.kletki" deistvitel'no neobkhodimy, mojet stoit poiskat' priyatnuu baryshnu?;-) |
|
|
06.08.2001 16:48
1. Ночную культуру (в моем случае 2 мл культуры JM109) в 200 мл LB, растить до OD600 ~ 0.3 – 0.4 (я как-то растил 3 ч, видимо, перерастил; однако клетки получились). Как показал опыт, хороший результат при соотношении ночная культура : среда 1:100 дает 2-х часовой подрост клеток; OD600 при этом достигает 0.35. 2. Охладить колбу 15ґ на льду, далее все манипуляции тоже на льду. 3. Осадить клетки 15ґ 3500 rpm, ротор JA-14; супернатант стерильно убрать. 4. Ресуспендировать осадок в TSS буфере, ~ 5% от начального объема культуры (я брал на 200 мл LB 7 мл TSS). Состав буфера TSS: LB + 10% PEG Mr 6000 (wt/vol), 5% DMSO, 50 mM MgCl2, pH = 6.5 Например: Среда LB 10 мл PEG Mr 6000 1.15 г 1 M MgCl2 0.575 мл DMSO 0.575 мл Стерилизовать через фильтр. 5. Оставить суспензию на льду на 10ґ. 6. Расфасовать аликвоты по 200 мкл, в азот и на -70є С. Получается нормально. |
|
|
06.08.2001 19:42
А если серьезно... Может вы знаете Фирмы производители реактивов... Какой фирмы лучше ПЭГ и мол. массы и.т.п. |
|
|
07.08.2001 14:06
U nas nekotorye uje paru let im pol'zuutsya. 10 v shestoi - garantirovano, inogda 10 v sed'moi vykhodit. http://www.epicentre.com/catalog/tss.htm Khotya ya lichno predpochitau kletki ot "Stratagene". Leni matushka... ;-) |
|
|
03.09.2001 19:45
|
|
|
12.09.2001 18:37
|
|
|
16.09.2001 16:21
Трансформирую как все: 1. Клетки оттаиваю во льду ~20ґ; 2. К 100-200 мкл клеток добавляю плазмидку, если пере- , или 1/2 лигазной смеси (у меня это 7-10 мкл), если трансформация; 3. ДНК+ клетки держу 20-30ґ на льду; 4. Шок +42єС 90ґґ, затем охлаждаю ~3ґ на льду; 5. Добавляю 4 объема (т.е. 400-800 мкл) среды (LB или 2YT), и на 30ґ на +37 єС (можно с качанием, можно и без); 6. Затем на чашку с антибиотиком. Миллилитр сохнет долго, можно уменьшить объем: открутить клетки 2000 rpm 5ґ (если обороты регулируемые) или на 14000 rpm 30ґґ (если нет), убрать 800 мкл, в оставшихся 200 мкл нежно рассуспендировать сэмплером (пальчиком не получается) осадок клеток – и на чашку. 7. Вроде все. Всех благ! |
|
|
02.10.2001 00:40
Все остальное то-же что у stask. |
|
|
30.11.2001 21:25
|
|
IAM1688 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
 26.10.2021 11:40
|
|
watchesonline89 Постоянный участник |
25.12.2022 09:29
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.