Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
avial Постоянный участник |
Хоть выбор и невелик и можно было бы все просто перебрать, но сложности с заказом заставляют задать этот вопрос здесь |
genseq Постоянный участник |
|
afanasev-max Постоянный участник Irkutsk-Moscow-Irkutsk |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
|
guest: avial IP-штамп: frM.OGd33xfA6 гость |
Понятно, значит, пока все плохо Будем перебирать доступные, может чего и найдется. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(guest: avial @ 18.06.2008 13:11) Да, солисовская вариант, но опять-таки, забугорная фактически. В том смысле что у нас ее не продают, а хотелось бы просто покупать в том же хеликоне. Понятно, значит, пока все плохо Будем перебирать доступные, может чего и найдется. Генсек Вам дал правильное направление. А звонить можно по этому телефону и получить самую квалифицированную информацию о КленТаке и его модификации (335-71-93 Игнатов). По моим результатам это лучшая полимераза в мире по аллельспецифик ПЦР. Для Аспе тоже подойдет, думаю. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 18.06.2008 13:30) Генсек Вам дал правильное направление. А звонить можно по этому телефону и получить самую квалифицированную информацию о КленТаке и его модификации (335-71-93 Игнатов). По моим результатам это лучшая полимераза в мире по аллельспецифик ПЦР. Для Аспе тоже подойдет, думаю. Дк может ему не для минисиквенса |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 18.06.2008 13:33) avial хорошо знаю - разведка доложила - точно для минисиквенса. Он очень капиллярники любит. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 18.06.2008 13:37) тогда клентермаза нужна для терминаторов . |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 18.06.2008 13:55) Буйная фантазия у ребят - расписали свою продукцию комбинируя три фермента ... |
avial Постоянный участник |
(Ъ @ 18.06.2008 11:37) Вот чего не люблю, так это каппилярники. Мутотень капризная. Так что неправильная разведка Неужели по сайту в той теме непонятна была моя любовь? Ну да ладно. К тому же, да, забыл в первоначальном вопросе указать, что полимераза для дидезокси- нужна. А КленТак по сравнению со Штоффелем лучше в аллель-специфичной? Спасибо за телефон и за наводку И еще один общетеоретический вопрос - ладно аллель-специфичная ПЦР, где от полимеразы требуется максимально избирательно элонгировать только полный дуплекс и "не узнавать" мисматч, но в primer extension - это же обычный первый шаг обычной элонгации, который обрывается из-за дальнейшей невозможности прицепить следующую букву. Почему такая разница в работе полимераз? Или я чего-то не понимаю? |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(avial @ 18.06.2008 18:50) Вот чего не люблю, так это каппилярники. Мутотень капризная. Так что неправильная разведка Неужели по сайту в той теме непонятна была моя любовь? Ну да ладно. К тому же, да, забыл в первоначальном вопросе указать, что полимераза для дидезокси- нужна. А КленТак по сравнению со Штоффелем лучше в аллель-специфичной? Спасибо за телефон и за наводку И еще один общетеоретический вопрос - ладно аллель-специфичная ПЦР, где от полимеразы требуется максимально избирательно элонгировать только полный дуплекс и "не узнавать" мисматч, но в primer extension - это же обычный первый шаг обычной элонгации, который обрывается из-за дальнейшей невозможности прицепить следующую букву. Почему такая разница в работе полимераз? Или я чего-то не понимаю? КленТак и Штоффел-фрагмент, в принципе, одно и тоже - от разных авторов, из разных продуцентов разные модификации, якобы улучшающие качества. Они не имеют от 5-штрих и от 3-штрих экзонуклеазных активностей и их используют в первую очередь в циклических секвенированиях по Сенгеру и в аллельспецифик ПЦР. В праймер-экстеншн и АСПЕ, наверное, используется это же свойство - в этом я только теоретик. Спросите у Гостя1, он собаку съел на этом. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(avial @ 18.06.2008 18:50) Вот чего не люблю, так это каппилярники. Мутотень капризная. Так что неправильная разведка Неужели по сайту в той теме непонятна была моя любовь? Ну да ладно. К тому же, да, забыл в первоначальном вопросе указать, что полимераза для дидезокси- нужна. А КленТак по сравнению со Штоффелем лучше в аллель-специфичной? Спасибо за телефон и за наводку И еще один общетеоретический вопрос - ладно аллель-специфичная ПЦР, где от полимеразы требуется максимально избирательно элонгировать только полный дуплекс и "не узнавать" мисматч, но в primer extension - это же обычный первый шаг обычной элонгации, который обрывается из-за дальнейшей невозможности прицепить следующую букву. Почему такая разница в работе полимераз? Или я чего-то не понимаю? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(avial @ 18.06.2008 18:50) Вот чего не люблю, так это каппилярники. Мутотень капризная. Так что неправильная разведка Неужели по сайту в той теме непонятна была моя любовь? Ну да ладно. К тому же, да, забыл в первоначальном вопросе указать, что полимераза для дидезокси- нужна. А КленТак по сравнению со Штоффелем лучше в аллель-специфичной? Спасибо за телефон и за наводку И еще один общетеоретический вопрос - ладно аллель-специфичная ПЦР, где от полимеразы требуется максимально избирательно элонгировать только полный дуплекс и "не узнавать" мисматч, но в пример ехтенсион - это же обычный первый шаг обычной элонгации, который обрывается из-за дальнейшей невозможности прицепить следующую букву. Почему такая разница в работе полимераз? Или я чего-то не понимаю? некоторые терминаторы меченные некоторыми красителями некоторые сиквеназы не любют |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 19.06.2008 10:34) .... в некоторых руках! Привет. Стаья полезная - один и тот же фермент, но из разных источников , я так думаю. |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
[/quote] Ферменты немного разные хотя все содержат мутацию Табора-Ридчарсона для включения ddNTPs. ThermoSequenase, например, это полноразмерная Taq с двумя заменами: одна выключает нуклеазную активность, а вторая Табора-Ридчарсона. Therminator (NEB) создан на базе отличного от Taq фермента. TERMIPol и KlenThermase -клентаки. Причем KlenThermase, насколько я знаю, бала создана в России людьми на которых указал Генсек и Ъ и содержит какие-то дополнительные навороты которые они не раскрывают. |
avial Постоянный участник |
Хорошо, спасибо за наводки, будем искать |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
[/quote] Ферменты немного разные хотя все содержат мутацию Табора-Ридчарсона для включения ддНТПс. ТхермоСеяуенасе, например, это полноразмерная Тая с двумя заменами: одна выключает нуклеазную активность, а вторая Табора-Ридчарсона. Тхерминатор (НЕБ) создан на базе отличного от Тая фермента. ТЕРМИПол и КленТхермасе -клентаки. Причем КленТхермасе, насколько я знаю, бала создана в России людьми на которых указал Генсек и Ъ и содержит какие-то дополнительные навороты которые они не раскрывают. [/quote] Клентерму они-то создали тока буфферочек к ней поленились довести до ума. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
[/quote] Ферменты немного разные хотя все содержат мутацию Табора-Ридчарсона для включения ддНТПс. ТхермоСеяуенасе, например, это полноразмерная Тая с двумя заменами: одна выключает нуклеазную активность, а вторая Табора-Ридчарсона. Тхерминатор (НЕБ) создан на базе отличного от Тая фермента. ТЕРМИПол и КленТхермасе -клентаки. Причем КленТхермасе, насколько я знаю, бала создана в России людьми на которых указал Генсек и Ъ и содержит какие-то дополнительные навороты которые они не раскрывают. [/quote] Игнатовскую Клентерму я гоняю на промеговском "зеленом буффере" от ГоуТак Как говорят "почувствуй разницу" |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
[/quote] Игнатовскую Клентерму я гоняю на промеговском "зеленом буффере" от ГоуТак Как говорят "почувствуй разницу" [/quote] Сами они называют такой буфер на ктором фиг-вам. Тоже удивляюсь, почему не довести . Ну вот, теперь я о тебе знаю все, в случае чего, мало ли. Привет. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(avial @ 19.06.2008 23:46) Сибэнзим термосеквеназа - тоже КленТак. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
Как говорят "почувствуй разницу" [/quote] Сами они называют такой буфер на ктором фиг-вам. Тоже удивляюсь, почему не довести . Ну вот, теперь я о тебе знаю все, в случае чего, мало ли. Привет. [/quote] Получил из Генкрафта проспект - на нем на первой странице статья Каледина и надпись "Самая первая Так полимераза в мире!" |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
они впали в ступор привет |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
[/quote] Получил из Генкрафта проспект - на нем на первой странице статья Каледина и надпись "Самая первая Так полимераза в мире!" [/quote] "Как молоды мы были ... " Было ли это. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
All: 1 Review: 0 Click to change filter selection through MyNCBI. 1: Biokhimiia. 1980 Apr;45(4):644-51.Links [Isolation and properties of DNA polymerase from extreme thermophylic bacteria Thermus aquaticus YT-1] [Article in Russian] Kaledin AS, Sliusarenko AG, Gorodetskiĭ SI. A DNA polymerase has been isolated from the thermophylic bacteria Thermus aquaticus YT-1. The six-step purification procedure resulted in an electrophoretically homogeneous enzyme preparation with molecular weight of about 62 000. The enzyme does not contain contaminant exo- and endonuclease activities and has a temperature optimum on the DNA templates at 70 degress and that on RNA matrices at 50 degrees. The maximal activity of the enzyme requires the presence of bivalent cations (magnesium or manganese) 0,1--0,2 M KCl or NaCl, all deoxynucleoside triphosphates and template in the incubation mixture. The enzyme is active when "activated" DNA, poly(dA)-poly(dT), poly(dA)-oligo(dT)10 and poly(rA)-oligo(dT)10 are used as templates and is inactive on the native and denaturated DNAs as well as on the native molecules of RNA and poly(rC)-oligo(dG)12--180. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 20.06.2008 08:39) Это твоя профессия - людей в ступор вводить. Смотри чтобы тебе СНИП-азу не подсунули - она очень медленная, но очень точная. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
и надпись "Самая первая Так полимераза в мире!" [/quote] "Как молоды мы были ... " Было ли это. [/quote] Таки Каледин выделил Штоффель или КленТак в итоге ? |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
[/quote] Таки Каледин выделил Штоффель или КленТак в итоге ? [/quote] Естественно не КленТак и не Стоффел, а самый обыкновенный 90 с чем-то кд Так Пол. А Каледин много чего термофильного (полимераз) выделял и от нечего делать я впоследствии все это пробовал. А Кленов-фрагмент из Е соли (не термофильный) в те времена только входил в моду в составе кита рандом-праймер. Начало КленТаков - от мадам Стоффел. Каледину КленТак в то время только снился. Надеюсь, ничего не сочиняю |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
[/quote] Естественно не КленТак и не Стоффел, а самый обыкновенный 90 с чем-то кд Так Пол. А Каледин много чего термофильного (полимераз) выделял и от нечего делать я впоследствии все это пробовал. А Кленов-фрагмент из Е соли (не термофильный) в те времена только входил в моду в составе кита рандом-праймер. Начало КленТаков - от мадам Стоффел. Каледину КленТак в то время только снился. Надеюсь, ничего не сочиняю [/quote] Каледин прямо пишет - 62 000 вес , а не 92 000 вес - куда 30 000 от Так полимеразы он потерял ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH. Program in Core Research, Roche Molecular Systems, Alameda, California 94501. The Thermus aquaticus DNA polymerase I (Taq Pol I) gene was cloned into a plasmid expression vector that utilizes the strong bacteriophage lambda PL promoter. A truncated form of Taq Pol I was also constructed. The two constructs made it possible to compare the full-length 832-amino-acid Taq Pol I and a deletion derivative encoding a 544-amino-acid translation product, the Stoffel fragment. Upon heat induction, the 832-amino-acid construct produced 1-2% of total protein as Taq Pol I. The induced 544-amino-acid construct produced 3% of total protein as Stoffel fragment. Enzyme purification included cell lysis, heat treatment followed by Polymin P precipitation of nucleic acids, phenyl sepharose column chromatography, and heparin-Sepharose column chromatography. For full-length 94-kD Taq Pol I, yield was 3.26 x 10(7) units of activity from 165 grams wet weight cell paste. For the 61-kD Taq Pol I Stoffel fragment, the yield was 1.03 x 10(6) units of activity from 15.6 grams wet weight cell paste. The two enzymes have maximal activity at 75 degrees C to 80 degrees C, 2-4 mM MgCl2 and 10-55 mM KCl. The nature of the substrate determines the precise conditions for maximal enzyme activity. For both proteins, MgCl2 is the preferred cofactor compared to MnCl2, CoCl2, and NiCl2. The full-length Taq Pol I has an activity half-life of 9 min at 97.5 degrees C. The Stoffel fragment has a half-life of 21 min at 97.5 degrees C. Taq Pol I contains a polymerization-dependent 5' to 3' exonuclease activity whereas the Stoffel fragment, deleted for the 5' to 3' exonuclease domain, does not possess that activity. A comparison is made among thermostable DNA polymerases that have been characterized; specific activities of 292,000 units/mg for Taq Pol I and 369,000 units/mg for the Stoffel fragment are the highest reported. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
Начало КленТаков - от мадам Стоффел. Каледину КленТак в то время только снился. Надеюсь, ничего не сочиняю [/quote] Каледин прямо пишет - 62 000 вес , а не 92 000 вес - куда 30 000 от Так полимеразы он потерял ? [/quote] Я могу у Городецкого спросить, это его детище. Каледин в 90-х может быть и КленТак выделял. Даю ЦУ своей разведке. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
Каледин в 90-х может быть и КленТак выделял. Даю ЦУ своей разведке. [/quote] А Кабоев наверняка все знает. Когда у него день рождения? Звони и мне тефон дай, на всякий пожарный. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
Каледин в 90-х может быть и КленТак выделял. Даю ЦУ своей разведке. [/quote] А Кабоев наверняка все знает. Когда у него день рождения? Звони и мне тефон дай, на всякий пожарный. [/quote] день рождения и меил я тебе уже давал . |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
[/quote] день рождения и меил я тебе уже давал . [/quote] Потерял, дай еще раз - пусть вся страна тоже знает про своих героев. |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
Как говорят "почувствуй разницу" [/quote] Сами они называют такой буфер на ктором фиг-вам. Тоже удивляюсь, почему не довести .[/quote] Кажется "они" довели (буфер). В Еврогене "из-под прилавка" дают пробовать новый 5х ПЦР буфер - аналог ГоуТак-овского, только не зеленый, а красный. Сравнил с Промеговской зеленкой в параллельных разведениях матрицы и полимеразы. Удивительно, но факт (кто бы сказал - не поверил), в Еврогеновском красном зелье все работает НАМНОГО лучше чем в Промеговском зеленом . Может заленка у меня не свежая ? |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
Кажется "они" довели (буфер). В Еврогене "из-под прилавка" дают пробовать новый 5х ПЦР буфер - аналог ГоуТак-овского, только не зеленый, а красный. Сравнил с Промеговской зеленкой в параллельных разведениях матрицы и полимеразы. Удивительно, но факт (кто бы сказал - не поверил), в Еврогеновском красном зелье все работает НАМНОГО лучше чем в Промеговском зеленом . Может заленка у меня не свежая ? [/quote] Точно, зелень завяла. Оранж Ж + кселенцианол = зелень. Добавить туда бетаинчику до 1.5-2.0 М и буфер стандартный до 2х и получится 2х промеговская зеленка. Евроген заменил зелень на крезоловый красный (для красоты) и добавили NH4+ с бетаином для усиления реакции, я так думаю. |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
Точно, зелень завяла. Оранж Ж + кселенцианол = зелень. Добавить туда бетаинчику до 1.5-2.0 М и буфер стандартный до 2х и получится 2х промеговская зеленка. Евроген заменил зелень на крезоловый красный (для красоты) и добавили NH4+ с бетаином для усиления реакции, я так думаю. [/quote] Все может быть. Но факт остается фактом - новый Еврогеновский буфер работает лучше Промеговского . |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
Точно, зелень завяла. Оранж Ж + кселенцианол = зелень. Добавить туда бетаинчику до 1.5-2.0 М и буфер стандартный до 2х и получится 2х промеговская зеленка. Евроген заменил зелень на крезоловый красный (для красоты) и добавили НХ4+ с бетаином для усиления реакции, я так думаю. [/quote] Все может быть. Но факт остается фактом - новый Еврогеновский буфер работает лучше Промеговского . [/quote] какое окно по магнию получается на еврогене и промеге ? |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
Точно, зелень завяла. Оранж Ж + кселенцианол = зелень. Добавить туда бетаинчику до 1.5-2.0 М и буфер стандартный до 2х и получится 2х промеговская зеленка. Евроген заменил зелень на крезоловый красный (для красоты) и добавили NH4+ с бетаином для усиления реакции, я так думаю. [/quote] Все может быть. Но факт остается фактом - новый Еврогеновский буфер работает лучше Промеговского . [/quote] Я искренно рад за Евроген и охотно верю, что лучше. Кстати, куда делся Проблемник не с кем пособачиться. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
[/quote] Все может быть. Но факт остается фактом - новый Еврогеновский буфер работает лучше Промеговского . [/quote] Я искренно рад за Евроген и охотно верю, что лучше. Кстати, куда делся Проблемник не с кем пособачиться. [/quote] Проверь магниевое окошко еврогена на верити. |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
[/quote] Я планирую. но мне сначала предстоить свою "зеленку" соорудить под этот КленТак. С таким высоким рН, как рекомендуют, весь Магний уйдет в осадок. Партизаны, не хотят дружить. |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
(Guest @ 20.06.2008 16:39) какое окно по магнию получается на еврогене и промеге ? Новый 5х буфер у Еврогена без магния. Гонял в параллель с ГоуТак Флекси (тоже без магния). Обычный Taq в обоих буферах неплохо работает с Mg от 1.5 до 3.0 мМ. Оптимум на простых матрицах где-то 1.8-2.0мМ. если брать больше 2-2.5мМ то надо уменьшать циклы или лезет грязь |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 20.06.2008 17:17) Новый 5х буфер у Еврогена без магния. Гонял в параллель с ГоуТак Флекси (тоже без магния). Обычный Taq в обоих буферах неплохо работает с Mg от 1.5 до 3.0 мМ. Оптимум на простых матрицах где-то 1.8-2.0мМ. если брать больше 2-2.5мМ то надо уменьшать циклы или лезет грязь А Mg продается в отдельной пробирке? F выше 2,5 mM полезет конечно грязь, если отжиг оставить тот же - Тm смещается, т.е. надо повышать отжиг и все нормализуется. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 20.06.2008 17:17) Новый 5х буфер у Еврогена без магния. Гонял в параллель с ГоуТак Флекси (тоже без магния). Обычный Taq в обоих буферах неплохо работает с Mg от 1.5 до 3.0 мМ. Оптимум на простых матрицах где-то 1.8-2.0мМ. если брать больше 2-2.5мМ то надо уменьшать циклы или лезет грязь С минимальным Магнием КленТак будет работать чисто, без ошибок (не наломает дров с аллельспецифик), с максимальным или близким к этому (2,5 -3,5 mM) - высокую чувствительность, я так думаю... |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
(Ъ @ 20.06.2008 17:28) А Mg продается в отдельной пробирке? F выше 2,5 mM полезет конечно грязь, если отжиг оставить тот же - Тm смещается, т.е. надо повышать отжиг и все нормализуется. Согласен. Если магния много - уменьшай циклы и повышай отжиг, иначе беда. Mg в отдельной пробирке у них пока отсутствует. Новый буфер капают из под прилавка (раздают знакомым для независимого тестирования). Поэтому пользую магний из промеговских наборов или свой |
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
(Ъ @ 20.06.2008 17:36) С минимальным Магнием КленТак будет работать чисто, без ошибок (не наломает дров с аллельспецифик), с максимальным или близким к этому (2,5 -3,5 mM) - высокую чувствительность, я так думаю... Логично |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 20.06.2008 17:17) Новый 5х буфер у Еврогена без магния. Гонял в параллель с ГоуТак Флекси (тоже без магния). Обычный Тая в обоих буферах неплохо работает с Мг от 1.5 до 3.0 мМ. Оптимум на простых матрицах где-то 1.8-2.0мМ. если брать больше 2-2.5мМ то надо уменьшать циклы или лезет грязь Гоу Така флекси зеленая у меня "пошире окошко" по магнию давала - от 2 до 6 мМ равномерные выходы - без красок - окно поуже |
avial Постоянный участник |
(Ъ @ 20.06.2008 06:27) В смысле аналог свой или они покупают у кого-то? |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |