Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Настя14145 |
Проводится генотипирование по конкретному гену (мелкий рогатый скот). Праймеры CTCTGCCTGCCCTGGACT GGAGAAGCAGAAGGCAAC ПЦР смесь: Вода-16,7 мкл, буфер Taq (х1)-2,5 мкл, dNTP (10 mM) - 0,5 мкл, прймеры (100 mM)- по 0,5 мкл, MgCl2 (30 mM)-3 мкл, Taq полимераза (конц 5000 е. а./мл)-0,3. были опробованы 2 температурных протокола: 1. 94 С-5 мин 2, 95 С-30 сек 3, 68 С-30 сек -1 per cycle 4, 72 С-45 сек Повтор с 2 по 4-13 раз 5. 95 С- 30 сек 6, 65 С - 30 сек 7. 72 С-45 сек повтор с 5 -20 раз Конеч. элонгация 72 С-7 мин. И второй протокол: 94°C for 5 min, 35 cycles of 95° C for 30 sec, touchdown annealing from 65°C to 52°C for 30 sec (1°C per cycle), 72°C for 45 sec and a final extension at 72°C for 7 min. Проблема в том, что выход амплификата получается либо у одной пробы (остальные без нужной полоски на электрофорезе), хотя я беру 100 % идущие пробы, либо амплификата нет вообще. Очень нуждаюсь в совете по необходимой подгонке микса для ПЦР и, возможно корректировке температурного режима. Премного благодарна за ответы. Картинки: IMG_20190415_151757.jpg — (3.55мб) |
semi Постоянный участник Москва |
Если я не ошиблась в прикидках, то чуть ли не 10 раз больше, чем нужно. И про Mg проверьте, не ли его в буфере. Температуру отжига снизьте до 60 оС. Маркер длин нужен при электрофорезе. Праймеры у вас в двух местах отжигаются у козы, кстати; дают одинаковый продукт по длине. Дупликация там, что ли? Сообщение было отредактировано semi - 16.04.2019 00:17 |
Настя14145 |
(semi @ 16.04.2019 00:56) Праймеров слишком много, IMHO. Если я не ошиблась в прикидках, то чуть ли не 10 раз больше, чем нужно. И про Mg проверьте, не ли его в буфере. Температуру отжига снизьте до 60 оС. Маркер длин нужен при электрофорезе. Праймеры у вас в двух местах отжигаются у козы, кстати; дают одинаковый продукт по длине. Дупликация там, что ли? Здравствуйте. Насчет шмеров, смею предположить, что я кладу слишком много ДНК-это не разведение, а матрица после выделения сразу (решила проверить, так как х10 кратное разведение ДНК не дает никакой реакции при данном протоколе). Насчет маркеров длин, да-виновата, не добавила (как правило, разумеется добавляю). Насчет магния в буфере уточню пожалуй у того, кто разводил (но не думаю, что он там присутствует). Премного благодарна Вам за ответы! |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
По тому что видно, ничего не скажу. И праймеров избыток на картинке, кстати, тоже не наблюдаю. Шмеры от самих лунок - избыток геномки или результат "бешено -бестолковой" работы полимеразы. И еще подозреваю что у Вас ДНК грязная и ее бУхаем в реакцию много, очень много. И конц-цию праймеров исправьте заодно... где Вы видели такие кг.
|
Настя14145 |
(-Ъ- @ 16.04.2019 11:26) Не стыдно такой гель выкладывать? По тому что видно, ничего не скажу. И праймеров избыток на картинке, кстати, тоже не наблюдаю. Шмеры от самих лунок - избыток геномки или результат "бешено -бестолковой" работы полимеразы. И еще подозреваю что у Вас ДНК грязная и ее бУхаем в реакцию много, очень много. И конц-цию праймеров исправьте заодно... где Вы видели такие кг. Гель такой выкладывать стыдно, поэтому до последнего не обращалась сюда, пытаясь справиться самостоятельно. Поэтому и прошу помощи у Вас. Насчет геномики уже уяснила-исправлю этот момент. Насчет праймеров тоже поняла-пересчитаю. Благодарю за ответы. |
dk Постоянный участник Россия |
Праймеров - ну оооочень много. Вы, как я понимаю, льёте прямо готовый маточный р-р после разведения? На реакционную смесь, как у Вас, надо 1-0,5 мкл 10 mM Температура гибридизации - Вы для чего используете "ступенчатую" ПЦР? Есть какое-то подозрение на неспецифику? Довольно большая разница темп.гибр. между праймерами (55-50=5 градусов). Это не критично, но при высокой температуре второй праймер просто не успевает "прилипнуть". Уменьшите темп.гибр. до 48 градусов и посмотрите. Для 25 мкл. ПЦР-смеси хватает и 1 ед. Taq-полимеразы, это реально "на кончике носика". Надеюсь, Вы готовите мастер-микс на много проб сразу, а не в каждую по отдельности? А то из 5-тысячной конц. запросто раз в 10 ошибётесь. Магния, как мне кажется, слишком много (да и он, обычно, уже имеется в буфере). В конечной конц. не нужно больше 2,5 mM Так что я бы, для начала, проверил все концентрации и уменьшил темп.гибр. |
Настя14145 |
(dk @ 16.04.2019 11:58) Какая длина продукта? Судя по протоколу около 0,5 kb - успевает ли пройти синтез: может, Вы пару kb "гоните"? Праймеров - ну оооочень много. Вы, как я понимаю, льёте прямо готовый маточный р-р после разведения? На реакционную смесь, как у Вас, надо 1-0,5 мкл 10 mM Температура гибридизации - Вы для чего используете "ступенчатую" ПЦР? Есть какое-то подозрение на неспецифику? Довольно большая разница темп.гибр. между праймерами (55-50=5 градусов). Это не критично, но при высокой температуре второй праймер просто не успевает "прилипнуть". Уменьшите темп.гибр. до 48 градусов и посмотрите. Для 25 мкл. ПЦР-смеси хватает и 1 ед. Taq-полимеразы, это реально "на кончике носика". Надеюсь, Вы готовите мастер-микс на много проб сразу, а не в каждую по отдельности? А то из 5-тысячной конц. запросто раз в 10 ошибётесь. Магния, как мне кажется, слишком много (да и он, обычно, уже имеется в буфере). В конечной конц. не нужно больше 2,5 mM Так что я бы, для начала, проверил все концентрации и уменьшил темп.гибр. Премного благодарна Вам за ответы! Да, праймеры я действительно лью с маточного раствора, поэтому очень благодарна за данное замечание. Длина продукта 422 bp. с температурной подгонкой праймеров пробовала менять-получалось не очень успешно, но продукт хотя бы немного, но был. Мастер микс готовлю на планируемон для амплификации количество проб на один рабочий день, не раскапываю каждый реактив по пробиркам. Насчет магния-у нас буфер без него, собственно, поэтому и добавляю в смесь. Премного благодарна Вам за ответы-для меня эти замечания очень важны! |
semi Постоянный участник Москва |
(Настя14145 @ 16.04.2019 12:29) Не знаю, как вам удаётся что-то генотипировать, если ваши праймеры залипают в двух местах и дают продукт одинаковой длины? Это ведь у вас коза? Да, и замечание про качество ДНК дельное. Чем выделяете ДНК? Сообщение было отредактировано semi - 16.04.2019 13:25 |
Настя14145 |
(semi @ 16.04.2019 14:23) Не знаю, как вам удаётся что-то генотипировать, если ваши праймеры залипают в двух местах и дают продукт одинаковой длины? Это ведь у вас коза? Да, и замечание про качество ДНК дельное. Чем выделяете ДНК? Нет,это овцы. Выделяли наборам для выделения от Синтол (если я правильно помню-фенол хлороформ). Насчет генотипирования-предыдущие исследователи резали HaeIII и получали необходимые генотипы. С длинной расщепления 366 и 56 bp. Может я неправильно выразилась,но на фото результат амплификации до рестрикции. Сообщение было отредактировано Настя14145 - 16.04.2019 14:00 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Все нормально, но чтобы дальше резать, ПЦР продукт должен быть практически идеальным без неспецифики (шмеров) и димеров. Но до этого очень далеко... ПЦР реактивы тоже из Синтола?
|
Настя14145 |
(-Ъ- @ 16.04.2019 15:13) Полиморфизм гена гормона роста у баранов. Кстати, берут все из статьи, но очень старой, и делают все по старинке как в начале 90-х. Все нормально, но чтобы дальше резать, ПЦР продукт должен быть практически идеальным без неспецифики (шмеров) и димеров. Но до этого очень далеко... ПЦР реактивы тоже из Синтола? Нет, большая часть берется из Сибензима, праймеры из Еврогена. |
semi Постоянный участник Москва |
(kakakaka @ 16.04.2019 15:32) Зато на козу легло, как влитое.
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
ПЦР у Вас не идет, контролей нет никаких, т.е. говорить не о чем, к сожалению. |
Настя14145 |
(-Ъ- @ 16.04.2019 15:48) Вам остается попробовать ПЦР реактивы от другого производителя. Других советов чтобы Вы смогли "корректировать и калибровать параметры ПЦР" у меня лично нет. ПЦР у Вас не идет, контролей нет никаких, т.е. говорить не о чем, к сожалению. Я Вас поняла. Премного благодарна за ответы и советы. С уважением. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(kakakaka @ 16.04.2019 15:41) нет, сказала МЕЛКИЙ, а не КРУПНЫЙ но рогатый скот. |
kb1 Участник |
94 С - 20 сек 58 С -20 сек 70 С - 20 сек магний до 2 мМ |
Настя14145 |
(kb1 @ 18.04.2019 01:56) Добрый день. Хорошо, попробую, спасибо за совет! |
semi Постоянный участник Москва |
(Настя14145 @ 18.04.2019 12:05) А что-нибудь уже пробовали из множества советов бывалых? |
Настя14145 |
(semi @ 18.04.2019 12:19) Да, развела праймеры, снизила концентрацию магния и ДНК взяла в разведении и снизила количество Taq. Также попробовала снизить температуру отжига до 52 и 48, и убрала градиент. При 52 проявились еле заметные бэнды на нужной длине, на 48, к сожалению, ничего. Сообщение было отредактировано Настя14145 - 18.04.2019 11:26 |
semi Постоянный участник Москва |
(Настя14145 @ 18.04.2019 12:25) Да, развела праймеры, снизила концентрацию магния и ДНК взяла в разведении и снизила количество Taq. Также попробовала снизить температуру отжига до 52 и 48, и убрала градиент. При 52 проявились еле заметные бэнды на нужной длине, на 48, к сожалению, ничего. Ну значит, вы на правильном пути. Поднимите температуру до 58, как выше советуют. Шмер-то исчез? Или вы после здешней ругани нам картинок больше не предъявите? Сообщение было отредактировано semi - 18.04.2019 14:54 |
Настя14145 |
(semi @ 18.04.2019 15:53) Ну значит, вы на правильном пути. Поднимите температуру до 58, как выше советуют. Шмер-то исчез? Или вы после здешней ругани нам картинок больше не предъявите? Уже в работе. Шмеров почти не было, Пока идет амплификация, после фореза покажу фото. Премного благодарна за поддержку! Сообщение было отредактировано Настя14145 - 18.04.2019 14:56 |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |