Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Sergeant Постоянный участник |
Делаю лентивирусы, экпрессирующие Cas9 и гайдРНК. Плюю их на человеческие клетки и смотрю на вестерне экспрессию целевого белка. Уменьшение есть, но хочется иметь полный нокаут. Клетки позитивные на инфекцию отбираю на пуромицине. Что бы разобраться в эффективности нокаута делаю Т7 мисматч тест. Вроде инделы есть. Вопрос: Хочу сделать клональную селекцию после инфекции. Как отбирать наилучшие клоны? Только Вестерном? Ведь в геноме две копии хромосомы и соответственно две копии моей мешени. Если нокаут идет только по одной хромосоме, то на сиквенсе сенгером я получи кашу от разных аллелей. Это если сразу сиквенировать участок в окрестностях мешени. А если сначала клонировать фрагменты ПЦР то на сиквенсе в разных бактериальных клонах будут разные аллели. Как подбирать праймеры для ПЦР, что бы разобраться в разных вариантах: 1. Нет нокаута целевого гена (или есть оффтагет эффект) 2. Нокаут только по одной аллели 3. Полный нокаут. Как я понимаю у каждой аллели можент быть свой набор инделов. Вариантов полногеномного сиквенирования не предлагать. Это, безусловно, информативно, но уж больно дорого. |
Serpent Постоянный участник RU-->IT |
При этом можно подобрать 2 гРНК так, чтобы 2 разрыва приводили к делеции достаточно большого куска днки, чтобы разницу видеть на форезе. |
ship Постоянный участник Moscow |
стр2287 Файл/ы:
|
Sergeant Постоянный участник |
(Serpent @ 19.10.2016 15:05) Можно отбирать клоны на основе ПЦР с геномной ДНК. При этом можно подобрать 2 гРНК так, чтобы 2 разрыва приводили к делеции достаточно большого куска днки, чтобы разницу видеть на форезе. А можно схемку нарисовать? Как то не совсем понятно как большая делеция получается. |
ship Постоянный участник Moscow |
(Sergeant @ 19.10.2016 15:56) см статью выше |
Sergeant Постоянный участник |
(ship @ 19.10.2016 16:03) Спасибо |
Sergeant Постоянный участник |
С ПЦР все ясно. Праймеры фланкирующие делецию или комбинации out/in. В моем случае в линтивирусе Cas9 дикого типа и только одна гайдРНК. Ну Cas9 я легко поменяю мутагенезом, а что делать со второй РНК? Делать два разных вируса и коинфекцию? Слишком много новой возни. В моем случае делеции получаются небольшие и внутренних праймеров на них не сделать, а внешние дают продукт, который не разделится на агарозе, а городить длинные акриламидные гели геморой. Начинаю завидовать владельцам сиквенаторов от Иллюмины. РНК-сек и баркодинг были бы в тему. Куда не глянь, а в моем случае самое простое/дешовое делать скрининг Вестерном. |
ship Постоянный участник Moscow |
а потом уже можно клоны и от ПЦРить и секвенировать по Сэнгеру, чтобы убедится. по идее можно сделать один праймер на место делеции, другой внешний - с дикого типа и с одного аллеля будет ПЦРится, а если оба аллеля порезаны - то нет. |
Flyamer Постоянный участник Москва |
Плюс есть вот эта штука, которая может решить все проблемы, но я не пробовал.
|
Sergeant Постоянный участник |
Плюс есть вот эта штука, которая может решить все проблемы, но я не пробовал. Ценник впечатляет. И как то я сомневаюсь , что эта штука вообще может взлететь. Но ПОПРОБУЮ. то только клонирование ПЦР-продукта и секвенирование клонов Пробовали. Теоретически Да. А практически нужно иметь целый взвод негров для клонирования и скрининга. Плохо масштабируемо. С клональной селекцией тоже не так уж радужно. Долго. И не все клетки так резво делятся как 293. |
Flyamer Постоянный участник Москва |
Причем здесь 293? Е. коли быстро делятся Сообщение было отредактировано Flyamer - 21.10.2016 12:20 |
Sergeant Постоянный участник |
(Flyamer @ 21.10.2016 10:18) 1. Ну это я про лицензию для желающих прикрутить R скрипты на свой веб сервер. Меня и бесплатный вариант устроит. Вот только есть небольшая проблемма. Программа не работает ни с одного рабочего места. Серый экран и никаких признаков жизни. Пробовал дома. Там работает. 2. А причем здесь E.Coli? Я вроде бактериальный геном редактировать не собираюсь. Клонирование понятие универсальное. Бактериями не ограничивается. В моей ситуации я плюю вирус на человеческие клетки. Потом давлю антибиотиком неифецированные клетки. Что получается? Получается компот из гомозиготных, гетерозиготных нокаутов. Плюс варианты с делециями, но активным белком. Плюс неспецифика. На вестерне в сумме все это дает падение экспессии до 30-50%. Меня КАТЕГОРИЧЕСКИ не устраивает. Выход из ситуации- рассадить инфецированные клетки в 96 велочный планшет примерно по одной клетке на лунку. И ждать пока в лунках вырастут клоны. Если клетки шустро делятся тогда за 2-3 недели можно наростить клеток до товарного колличества и делать скрининг на этих клонах. А если клетки дохлые и ростут очень медленно, то до клонов можно и не дожить. |
Flyamer Постоянный участник Москва |
Да это я понимаю, что универсальное. Но ведь клонировать ПЦР-продукт из человеческих клонов надо будет в е коли, чтобы потом секвенировать. А то если в двух аллелях по-разному починился разрыв, опять же будет мешанина в сиквенсе. Сообщение было отредактировано Flyamer - 22.10.2016 10:48 |
Esya Постоянный участник PA, USA |
Но ведь клонировать ПЦР-продукт из человеческих клонов надо будет в е коли, чтобы потом секвенировать. а зачем? |
Flyamer Постоянный участник Москва |
(Flyamer @ 22.10.2016 02:31)
|
Flyamer Постоянный участник Москва |
Конечно, может, этот TIDE все разберет, тогда это не нужно. |
nigoal123 IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
organic traffic from |
guest: 123vega IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |