Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
HACTEHKA |
И какими ДНК полимеразами I лучше их надстраивать до тупых? Сообщение было отредактировано HACTEHKA - 18.07.2008 13:43 |
guest: Андрей IP-штамп: fr5rCDKjN1xa6 гость |
|
Egil Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость |
|
Guest IP-штамп: frNVjPT6S76SU гость |
Андрей +1 Egil, согласен, для ПЦР продукта достаточно и 5 мин. |
Guest IP-штамп: frWv/19onoXiA гость |
вопрос про липкие концы и причем тут ПЦР продукт... |
The problem Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frTITTs62W.JQ гость |
Большое спасибо за помощь |
The problem Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано The problem - 07.08.2008 12:38 |
Guest IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(The problem @ 07.08.2008 11:37) не надо Pfu, просто добавьте в ПЦр Т4-пол, как я писал выше (букв можно немного добавить) 1-2 ед на 50 мкл реакции, 5 мин на столе, и все. Для Pfu по классике требуется добавить свой буфер, буквы и фермент, потом 30 мин на 70оС (так написано у Stratagene, по крайней мере, в ките для лигирования с помощью Srf I по тупым концам- что естественно, фирма предлагает свои полимеразу и рестриктазу) С Pfu тупить, я думаю, надо уметь - был случай у меня когда Pfu cо свистом объедал 3-конец и делал 5-торчащий липкий. Также Pfu портил мне зашпиленные праймеры (тупой конец). Т4 ДНК полимераза и не открывайте америку. Проблемник прав. |
Guest IP-штамп: frTITTs62W.JQ гость |
После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК? |
Guest IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 08.08.2008 10:30) поясните, что делать с фенолом? После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК? Надосадок (супернатант) переносите в чистую пробирку для осаждения спиртом, а фенол остается в пробирке, которую закрывете и в мусор. Может быть порежется без очистки, попробуйте... |
The problem Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: fryZ/qrb5F46U гость |
(Guest @ 08.08.2008 10:30) поясните, что делать с фенолом? После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК? Я после 5ти минут на столе (Т4 полимераза с буквами) просто ставлю 20 минут на +70С, потом в лед, и добавляю вторую рестриктазу, без фенола. |
The problem Постоянный участник |
|
HACTEHKA |
Подскажите, пожалуйста, как подобрать оптимальные условия для S1, что бы она не съела лишнее? |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Odysseus Постоянный участник |
Проще говоря, возможны ли проблемы при дальнейшей работе с полученным вектором из-за обработки PFU полимеразой? (А то меня тут пугают ) P.S. Других ферментов у меня просто нет . Заранее спасибо за ответ. Сообщение было отредактировано Odysseus - 11.02.2009 20:51 |
ship Постоянный участник Moscow |
|
Odysseus Постоянный участник |
(ship @ 11.02.2009 22:18) Один раз уже получилось, правда тупой был только один конец. Сейчас, один из двух сайтов рестрикции вставки подходит к сайту вектора. Я хочу вырезать фрагменты, лигировать по одному из сайтов, потом "затупить" и лигировать с другой стороны в тупую. |
Veshka Постоянный участник Москва |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
RJ Dio Постоянный участник |
(Odysseus @ 12.02.2009 13:59) Один раз уже получилось, правда тупой был только один конец. Сейчас, один из двух сайтов рестрикции вставки подходит к сайту вектора. Я хочу вырезать фрагменты, лигировать по одному из сайтов, потом "затупить" и лигировать с другой стороны в тупую. так не выйдет- нарисуйте, подумайте, поймете (может) почему.
|
Veshka Постоянный участник Москва |
|
Odysseus Постоянный участник |
(RJ Dio @ 12.02.2009 18:53) Да, вижу. Видимо, не покатит. Спасибо. Буду думать дальше до понедельника. Уж больно не хочется делать два последовательных клонирования. |
бобр IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
|
RJ Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано RJ Dio - 15.03.2011 10:57 |
katarina |
(RJ Dio @ 20.01.2009 17:38) я бы не стал упражняться с S1, много клонов лопатить придется, пока найдете один с нужной рамкой, лучше подумайте над изменением схемы клонирования, почти всегда можно найти что-нибудь поизящнее, чем S1 А Т4 полимераза не сможет 5-выступающий отгрызть? |
RJ Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано RJ Dio - 28.11.2011 14:55 |
guest: Madyson IP-штамп: frYUDxQtTmM0s гость |
|
nigoal123 IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
but also exciting and lively |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |