15.08.2002 11:45                   URL #1 Доброе утро всем, Выделяю РНК из зеленых бобов для создания кДНК библиотеки, ползуюс RNeasy мини-китом от Эиаген. Из 1г бобов можно выделить 1 мг РНК этим мини-китом, быстро и удобно. А тут, покопавшись в материалах форума нашла тему про выделение транспортной РНК и знаюсчие люди пишут, что без цезиевого градиента не обойтись, иначе нет уверенности, что РНК не будет загрязнена ДНКой. Вопрос, а насколько еффективна обработка РНАзе-фрее ДНАзой и как вообсче проверит степень загрязненности ДНКой? Я сначала выделяю тотальную РНК, а потом буду чистить ее опять китом Олиготекс полиТ от Эиаген. Качество библиотеки для моей работы очень важно, поетому просто потеряла покой. [ 15-08-2002: Сообщение отредактировано: Макс ]

Der-ro Участник

15.08.2002 11:52                   URL #2 Я тут недавно выделял РНК Стратаджиновским кито, обратод ДНКазой, но от ДНК не избавился. так, что уверенным быть нельзя.

15.08.2002 11:54                   URL #3 А как вы проверяли - избавились от ДНК или нет? [Текст переведён с транслита]

tupoi Постоянный участник

15.08.2002 12:39                   URL #4 Ответственно заявляю, что для выделения тРНК градиент цезия не обязателен. А от ДНК полностью избавиться ДНКазами можно, но это как повезет: вроде все одно и то же делаешь, а иногда она остается...

Der-ro Участник

15.08.2002 13:15                   URL #5 На фарэзе полосы лишние появились.

15.08.2002 13:55                   URL #6 Т.е., ДНА , загрязняюсчую препарат РНА можно увидеть на фарезе? А до ДНАсе дигестион эта самая ДНА присутствовала в РНА, но на форезе не была видна? Я пока делала форез тоталной РНА, и у меня вместо 2 полос - несколко, штук 5, где-то. Это тоже ДНА? Или пластидная РНА ? Форез был нередузируюсчий, обычны ТАЕ. Потом я сделала форез с формалдегидом, один раз - добавив ЭтБр в гел, и получился офигенный бацкгроунд, с трудом можно было различит РНковые полоски. Это потом я прочитала, что этидий связывается с формалдегидом и не дает смотрет на РНКу. Второй раз я делала гел без этидия, а ЭтБр добавляла к самплес, но тоже не особо получилос, вроде 2 полоски на фоне шмера, а может, это шмер от этидия вообсче, которы связался с формалдегидом по ходу фореза. Делат гел и красит его в ванночке с раствором ЭтБр - не хотелось морочится , это ж надо RNAse free все делать, ванночку, раствор, поленилась. А возможно ли теперь эту РНА пропустить через цезиевы градиент? Все протоколы описаны для лизата, а у меня РНА в ДЕПЦобработанной водичке. Надо в буфер ее переводить? [Текст переведён с транслита]

Veshka Постоянный участник Москва

15.08.2002 14:23                     URL #7 В цезий РНК можно положить в любой момент. При этом гуанидин всё равно полезно добавить - чтобы всё диссоциировало нафиг и лучше чистилось. Что касается наличия ДНК после ДНКазы, то согласен с предыдущими постингами - какая ДНКаза и как повезёт. ГряЗ в виде ДНК на форезе увидеть нельзя - если можно, то препарат однозначно идёт в помойку. Увидет можно по включению метки, педварительно прокалибровав систему по количеству ДНК.

15.08.2002 15:05                   URL #8 RNAze-free ДНКаза 1 от Sigma Я не совсем разбираюсь, вернее, совсем не разбираюсь - а какая метка - это при first strand synthesis контрол с P32 ATP ? А что потом делают с этим контролем, отмывают от не включившейся метки и меряют кол-во включившейся на счетчике? Как различают ДНК от РНК? И как калибруется система по количеству ДНК? И есчо - гуанидин можно добавить прямо в раствор тотальной РНА (сделат раствор гуанидина и накапать до нужной концентрации)-или РНА осаждать и потом растворять в гуанидиновом растворе? И какие концентрации - если в лисис- буфере (по методе с цезиевым градиентом, что у нас в лабе использовали) 5,5,М цезий, то сейчас можно ту же концентрацию взять? Как это соображается? Спасибо большое всем ответившим. [Текст переведён с транслита]

Veshka Постоянный участник Москва

15.08.2002 15:15                     URL #9 1. (с). Сначала нужно аликвоту РНК взять и рэндом праймером с дезокси буквой чем-нбудь типа секвеназы или Клёнова достроить. Померить, объесть ДНКазой, опять померить. Калибровать - ну как - заведомо известные количества ДНК от пикограмма до нескольких нанограмм прогнать в той же системе и посчитать. 3. Концентрация гуанидина - от 4 до 8 молей - любая. Ну, буфер, саркозил, меркаптоэтанол опять же. Цезий, кстати, нужно брать 5.7 моля, а не 5.5.

15.08.2002 15:40                   URL #10 1. Что, ерундовая ДНКаза? 2. ??? Что есть мабука? (-: Мне стыдно от моей тупости и невежества, и назойливости, но что проишодит когда РНА достраивается рандом -праймером (что значит с дезокси буквой?) ? И что меряется до обйедания ДНАзой и после? Я могу нафантазировать, но это может быть далеко от реалности, а про это я не читала нигде )-: 3. Сорры, 5,5, молей концентрация гуанидина, а не цезия. Так надо все таки РНКу в полноценный буфер с МЕ и саркозилом переместить? Осадить из воды и растворить ? [Текст переведён с транслита]

15.08.2002 15:41                   URL #11 Дурацкий транслит! [Текст переведён с транслита]

15.08.2002 16:10                   URL #12 А если тотальную РНА очистить на полиТ матриксе и потом елюировать, все равно есть вероятность загрязнения ДНК? [Текст переведён с транслита]

tima

15.08.2002 16:31                   URL #13 Олга, я пользовался теми же самыми китами и для выделения РНК, и для получения мРНК. ДНК-ового загрязнения не обнаружил. По идeе, его и не должно быть после очистки за поли-А хвосты. Правда, у меня РНК была из культуры клеток. А чтобы нормально видеть РНК на форезе с этидием, гель надо вымочить в воде овернайт. И потом, если Вам нужна кДНК для библиотеки, так ли уж страшно присутствие геномной ДНК? [Текст переведён с транслита]

15.08.2002 17:09                   URL #14 Я не знаю, Тима, хотела бы это выяснить. В Маниатисе, 2нд едитион в описании isolation rna from mammalian cells стр.7.9.есть ремарка, что при выделении РНа из клеток которые были инфицированы вирусной ДНА или трансфицированы ДНА может статься , что фрагменты ДНа, комплементарно гибридизируются с РНА и служат праймерами в обратно-транскриптазной реакции. Это ведет к ошибочному маппингу 5ь конца мРНА и генерации укороченных кДНА клонов. Мне надо создать експрессионную библиотеку и затем тестировать на наличие белков-аллергенов - для этого используется сыворотка пациентов , которую трудно добыть и нужно бережно рашодовать. Поетому мне важно, чтоб клоны были не укороченные, а нормалные. И тут я прочитала, полазив по форуму, что без цезия не обойтись если нужно получить чистую РНА без примесей ДНА. Вот я и не знаю, как быть, спасают ли киты от контаминации, или нужен все-таки цезий. [Текст переведён с транслита]

15.08.2002 17:27                   URL #15 Тима, а как вы проверяли ДНКовое загрязнение - так же как и Вешка описывает? Что это за метод такой? [Текст переведён с транслита]

Veshka Постоянный участник Москва

15.08.2002 19:15                     URL #16 У меня есть правило - ничего специализированного в Сигме не покупать. Для этого есть специализированные фирмы Раньше это был Wortinghton, cейчас и не знаю кто, поскольку надобности нет. А сигма это в таких случаях средняя температура по больнице - вроде и работает, но... РНК вообще говоря достраиваться не будет. Праймера нужно брать мало (0.5-1 пикомоля). Будет достраиваться ДНК. Если достройку не делать при комнатной температуре, праймер на себя достраиваться не будет. После достройки можно увидеть есть ДНК или нет. Даже на форезе. После объедания ДНКазой Вы сможете удостовериться, что она сработала - если это так, метка по большей части перейдёт в ТХУ-растворимое состояние. Проблема не в терминации и гибридизации с ДНК, а в том, что несмотря на вроде бы малые её количества она лезет и через олигоДТ и потом большая часть клонов это ДНК а не кДНК В данном контексте обозначает непременную последовательность действий. РНК можно не осаждать. Да и не нужно. Просто добавьте гуанидина с буфером. 5.5 молей - нормально. Меньше - тоже не так и плохо.

16.08.2002 13:05                   URL #17 Спасибо, Вешка, С сигмой пячально, кто ж знал. Коллега сказал , что это хорошая Дназа, вот, я ее уже и заказала. Вообсшче ситуация такова, что все люди, кто здесь работал с созданием библиотек, делали цесиевы градиент, но из тех оснований, что они мелкими китами не могли выделить нужное количество рнк. А вовсе не изза чистоты експеримента (ну, немцы). То что цезий позволяет получить чисты продукт - это как то второстепенно. У меня же из этих бобов выделяется приличное кол-во рнки и они считают , мое началство в том числе, что это прекрасно, цезий не нужен, только в путь, давай клонируй. Я клонирую, получится не експрессионная чистая библиотека, а лиш бы что, и вся работа запотрется, переделывать наново, и тд, мне это не нужно. Счас я их пытаюсь убедить, что цезий просто необходим, чтоб перестраховаться. Но это ужасно нелегко, по причине моего слабого неубедителного немецкого (а английски не лучше), а так же по причине того, что я не спез, не шарю вообшче. А тут такой менталитет, что ни у кого ничего не спросиш, потому что создаеш себе репутацию незнайки и причем, навечно. Более того, реакция такая, как будто их грабят и убивают и отнимают самое ценное, когда пытаешся вытянуть некую информацию. Поетому копаюсь сама все семь раз не по-русски и можно голову свихнуть. Етот контроль с деокси-праимером - тут в ките инструкция, кДнк праймируется с олигодТ или рандом хинд3 и 5-ме дЦТП встраивается в обе страндс без екстракции и преципитации между 1 и 2 стан синтезом. Это и есть то самое - что надо кленовым или секвеназой достроить? Далше они пишут - от обсчего обйема 1 странд синтез взят аликвоту и добавит радиоактивны АТП и инкубироват в тех же условиях , что и всю бадю при 37 град 1 час. Потом осадить ТХУ или посмотреть на счелочном геле- это оно? А как это меряется после достройки с этим рандом деокси-праймером? Прошу прошчения за занудство. [Текст переведён с транслита]

16.08.2002 13:40                   URL #18 А ешче непонятно: если куски ДНК служат праймерами, то РНК служит матрицей, и получается, что достраивается нить, комплементарнайа РНК, то есть та самая кДНК? Или полиТ праймеры вместо того, чтоб садится на РНК, садятса на эти куски ДНК и достраивают их? Но раз эти куски короткие, то там и синтезироватся нечему, и клоны будут короткими? Помогите разобраться, пожалуйста. [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита]

16.08.2002 15:45                   URL #19 <img src="graemlins/teapot.gif" border="0" alt="[чайник]" /> <img src="graemlins/weep.gif" border="0" alt="[рев в 3 ручья]" />

Veshka Постоянный участник Москва

16.08.2002 16:31                     URL #20 Может и хорошая, хотя скорее коллега хорошую не юзал. Цезий под библиотеку просто MUST, а всё остальное, тоже must...die У немцев есть такое свойство. Вообще, если мало знаешь жалко делиться - а вдруг тот с кем поделился после этого будет знать уже больше тебя? Ведь если знаешь мало, этот порог близэнько-блзэнько Инструкции в ките положите обратно в кита пусть они там как планктон... Я не синтезе кДНК говорю - прочитайте ещё раз и не торопясь подумайте чём. Без обид, Ок? То, что в Маниатисе пишут не про фагов или тот же цезий нужно делить на 8 или 32. Если в препарате РНК ТАК много ДНК, что она мешает вот так вот синтезу, значит препарат надо было уже до синтеза выбросить. Основная проблема - в силу относительной неэффективности всех РНКово-кДНКовых процедур даже незначительные примеси ДНК потом клонируются и составляют большой процент библиотеки, а это не GLP

16.08.2002 17:51                   URL #21 Да ну, какие ешьо обиды! Спасибо вам, что пишете, и советуете. Я вот сейчас как раз и читаю. А что значит - ето не GLP?

Veshka Постоянный участник Москва

16.08.2002 19:32                     URL #22 good laboratory practice :]

can be worse Участник

17.08.2002 03:08                   URL #23 да чё вы девушке мозги то компостируете... какой в наше время цезий? можа ещё горячий фенол посоветуете? если РНК много - вперёд с ДНКазой!!! да и по правде говоря, киты то тоже не дурочки делают... Ольга, если есть аозможность - покупайте ВСЁ для РНКовой работы от Амбиона - и ОБЯЗАТЕЛЬНО следуйте инструкции (СТРОГО!) - вот когда сделаете штук 10-50 библиотек - тогда уж и сами сможете "от руки"... Удачи! И вообще, на будующее, доверяйте больше китам - а то как обычно: Россия родина слонов...

19.08.2002 11:10                   URL #24 Спасибо за советы, товарисчи! Пагибаю от мигрени третий день, жара на меня плохо влияет. )-: [Текст переведён с транслита]

19.08.2002 18:25                   URL #25 Так-так... из бобов библиотека, говорите? Мы тоже из бобов библиотеку делаем. У нас этих библиотек...как гуталину. Может посотрудничаем? Или я вам посоветовать чего смогу? RNA выделяем Gentrой. Контаминация DNA есть, но не мешает. spring_r@yahoo.com

kuku	21.08.2002 15:06                   URL #26 Олга, я думаю тоже, что загриазненийе ДНКой не будет мешать: если получится нечистая библиотека, то клоны с ДНК (а не kДНК) не будут нормально експрессироваться и не будут аллергенами. Поетому ты их просто не вытианешь и т.о. они не будут мешать.

kuku	21.08.2002 15:08                   URL #27 И ешчо, ДНК не может быть примером на РНК, т.к. она изначально длиннейе и, соответственно, РНК не может быть в этом деле матрицей. [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита]

21.08.2002 16:56                   URL #28 Вообсче - интересная тема, причем мнения специалистов можно услышать прямо противоположные. На то и форум, чтобы все обсудить и прийти к некоему консенсусу. Поетому у меня просьба к гостйе - поделиться секретами (гуталина) на форуме, может у кого появятся контраргументы, все это очень информативно, по-моему. Может ДНК и не мешает. А если мешает - то интересно, почему мешает. Праймером она быть не может, на нее садятся полыТ праймеры и реверсе транскриптаза успешно ее амплифицирует. Ну, получается смешанная библиотека, а чем это чревато? Насколько это принципиально или не принципиально? Не ГЛП, как говорит Вешка. (-: Я уже осваиваю цезиевы градиент, а именно, нахожусь на последней стадии - растворения рнки в депц-воде с целю измерения концентрации полученного продукта. Далее планирую обожрать дназой. И потом выделить мрнк на полыТматриксе. Заодно и избавлюсь от остатков нуклеотидов и дназы. В инструкции к дназе написано, что после обработки можно сразу гнеть рт-пцр а в качестве контроля - пцр без обратной транскриптазы. Как конкретно это делается, нигде не могу найти. Спросит не у кого , ибо никто этим не морочился никогда. Итак уже скоро снискаю себе нехорошую репутацию со своим педантизьмом. [Текст переведён с транслита]

kuku

21.08.2002 17:38                   URL #29 Да, у тебя будет ПЦР продукт с ДНК и ты его клонируйешь нариаду с цДНК, полученной с РНК. Но затем в експерименте цДНК будет аллергеном, а ДНК с ДНКи, имея интронныйе участки, не будет, т.к. при експрессии получится беллиберда. Как делать и РТ-ПЦР написано в инструкции к тому киту для РТ-ПЦР, кот. ты будешь использовать. НО-РТ контроль (ПЦР без обратной транскриптазы) - все тоже самойе, но без РТ, т.е. сразу делайешь ПЦР по той программе, кот. ты используйешь в РТ-ПЦР. Почитай на ввв.амбион.цом. [Текст переведён с транслита]

21.08.2002 18:58                   URL #30 Не понимаю - РТ-ПЦР я делаю инкубацию при 37 град, а нормалный пцр - надо циклы подбирать, т-аннеалинг, елонгатион, сколько раз и тд. Потом, что значит - нормальный пцр - я дксдолзна Taq-polimerase туда класть вместо обратной транскриптазы? Я не специалист, может, для специалистов, это само собой разумеюсчиеся весчи - а для меня это тупик пока что. На амбионе тоже самое и написано, догадайся мол сама. [Текст переведён с транслита]

21.08.2002 19:15                   URL #31 То ку-ку: А простите, нескромный вопрос - сколько раз вы делали kДНА библиотеки и на каком об'екте? [Текст переведён с транслита]

kuku	21.08.2002 19:36                   URL #32 Ты знаешь сколко раз и на каком :-) Напиши на мыло свой телефон.

21.08.2002 19:50                   URL #33 То-та!!! (-: [Текст переведён с транслита]

tupoi Постоянный участник

21.08.2002 23:59                   URL #34 to can be worse: а чем это Вам горячий фенол не показался? Есть вещи, которых Вам без горячего фенола сделать не удастся. Так же, как и без цезия, кстати. Здесь, конечно, цезий не нужен, а вот горячий фенол можно попробовать...

22.08.2002 15:26                   URL #35 Делюсь. Выделяем RNA, как я уже сказала, китом Gentra (Biozym). Из котиледонов и из листьев. Из семенной оболочки выделяется плохо. Дл нее использую специальный метод для тканей с большим содержанием полисахаридов. На дайнабидсы садим mRNA. А там уже после промывок никакая ДНК не страшна. Можно проверить контаминацию ДНКой простым ПЦР, или даже уже РТ-ПЦР, если к какому-нить хаузкипинг гену подобрать праймеры, узнающие геномную последовательность с интроном. Я встречала случаи, когда контаминацию в РТ-ПЦРе интерпретировали как альтернативный сплайсинг. Библиотеки у нас получаются хорошие.

22.08.2002 15:27                   URL #36 А ДНазой я бы обрабатывать не стала. Если вы ее до конца не инактивируте, у вас плохо пойдет синтех кДНК. Может вообще никак не пойдет.

22.08.2002 15:34                   URL #37 А каким китом вы делаете библиотеку? Может взять кит и сделать все, как там написано и не мучиться? А то начинать все с оптимизации... Это у же для тех, у кого хоть какой-нить опыт.

23.08.2002 18:10                   URL #38 Я выделяла qiagenom для тотальной рнк. Там есть 2 лизис буфера, один - специально для тканей, богатых поллисахаридами, им выделяется в 2 раза больше продукта, чем используя обычный, ну, он тоже там какие-то свои преимусчества якобы имеет. И с цезием у меня из того же количества стартового материала получилось рнк в 2 раза больше, чем при выделении китом с полисахаридным буфером. Потом я использовала опять qiagen для выделения мрнк и тут у меня облом, не знаю, что я утварила, но из 3 г тотальной рнки я вытянула 2! мкг м РНк, грабеж средь бела дня. Сначала получилось 6 мкг, и я решила обогатить, что называется , полученную фракциу, все, что осталось от первого раунда прогнала все тоже самое по второму кругу и вот, конечный результат. 1мкг пошел на гель, один остался. Вот не знаю, пустить этот мкграмм в синтез цднк или не стоит. Вообсшче, как получить побольше цднк - поможет ли увеличение времени реакции и ингредиентов? [Текст переведён с транслита]

Veshka Постоянный участник Москва

24.08.2002 02:29                     URL #39 Я сразу вспоминаю классику - обсуждение телефонного справочника в известном месте... Если внимательно сесть и посчитать, ОСОБЕННО учитывая работу с растениями, получится, что цезий дешевле и удобнее всего. И чего его так все боятся? Что касается кДНК, то надо брать суперскрипт. А что касается общей эффективности, то "самое главное в танке" , это эффективность клонирования. Если клетки хотя бы 10(9) по суперкойлу, то из полгаммы кДНК уже получится очень приличная библиотека. Просто не надо жалеть 20-40 кювет

26.08.2002 13:06                   URL #40 У меня сложилось впечатление, что цезия боятся изза необходимости работать с ультрацентрифугой, она нагоняет на молбиологов жуткий страх, особенно на западных, которые привыкли с маленькими центрифужками и китами работать. А у меня все наоборот, киты я не перевариваю, а ультрацентрифуги очень даже уважаю, 4 года имела с ними дело, пока занималась биохимией, а не молбиол. А вот что такое суперскрипт и 10(9) по суперкоилу , сорры, опять :teepot Как в том анекдоте - думай , Петька, думай! (в какой руке бутылка - в левой!) [Текст переведён с транслита]

Veshka Постоянный участник Москва

26.08.2002 16:50                     URL #41 SuperScript II это наиболее эффективная ревертаза. Делает её life Technologies, теперь это Invitrogen, а когда-то BRL . 10(9) это эффективность трансформации микрограмма суперскрученной плазмиды. На химически компетентных клетках практически недостижима, что бы там не писали. Только на электропораторе. Для того, чтобы эффективно электропорировать несколько микрограмм лигата, нужно извести не одну кювету, а несколько десятков и несколько милллилитров электрокомпетентных клеток, иначе эффективность резко падает.

27.08.2002 13:19                   URL #42 Я буду использовать mmvl от novagen, цднк будет задем встраиватся в фаговы lambda-screen вектор ( novagen ). У нас это поставленная метода, шаг вправо шаг влево приравнивается к попытке бегства, стреляют без предупреждения :-Д [Текст переведён с транслита]

27.08.2002 22:52                   URL #43 Олга! Я ползовался тем же китом для виделеня РНК, Без последуучеи ДНКзнои обработки ВСЕГДА остается ДНК, даже если обрабативаеш "на колонке" ДНкзои Эиаген. Потом я стал применят ДНКзу "Амбион". Оказалос успешно. Проблема толко в том, что РНК не видерживает болше 2 размораживании - деградирует [Текст переведён с транслита]

Veshka Постоянный участник Москва

28.08.2002 02:56                     URL #44 Ааа, упаковкаа... Ну, дедовский метод, но весьма неплохой с точки зрения эффективности. Да и молони тоже ничего, но похуже Суперскрипта

28.08.2002 13:08                   URL #45 У нас счас в связи с потопом закрыли финансирование института, деньги идут только с проектов. Поетому жуткая економия и скоро даже будут учится мыть пластиковые наконечники для пипеток и по новой использовать (-: Поетому, коней (то биш qiagen и ambion)на переправе не меняют. )-: Киты берутся те, которые до этого использовали коллеги. Но я чисчу не на колонках с Qiagenovskoj ДНАзой, тоталную РНк я выделила с Cs-градиентом, потом чисчу ДНАзой от Sigma, а потом только на полиТ qiagen для выделения мРНК. Таким вот образом. Да, а молони тоже входит в состав ламбда-китов novagenа. А вообсче у нас некоторые чистят и на qiagenovskih колонках с ихнехй дназой, но никак не проверяют, осталас дна или нет. И когда задаеш вопросы - а как вы проверяете, то косятся, как ленин на буржуазию и и толкают пламенные речи, что дназа - это ядреное срэдство против дна, и после нее все чисто, какие есчо проверки. [Текст переведён с транслита]

f1dark Постоянный участник Lahore, Punjab, Pakistan

01.10.2022 14:48                     URL #46 F1 Removal is a well known movers and packers company all over the UK. We have been working since 1980 providing professional moving services according to the need of the customers. We have highly trained staff for all sort of moving services during relocation. Removals Company | Removals Company in London | Office Removal in London | Office Removals London | Relocation Companies London | Removals Company in London | Moving Company in London | Moving Company | Movers in London | Man and Van in London | House Removals in London | House Removals | Packers and movers in London | Packers and movers London | Movers and Packers in London | Relocation Company in London | Commercial Removals | Local Movers | Long Distance Mover | Long Distance Movers | Long Distance Moving Company | renovations | london renovations | renovation companies in london | renovations company london | house renovation in london | Kitchen renovation london | Kitchen fitting london | Kitchen fitters in London | bathroom renovations london | painters and decorators in london | painting and decorating in london | painters in london | london decorators | vinyl tile flooring | vinyl flooring | laminate flooring | parquet flooring | wood flooring | parquet flooring london | luxury vinyl flooring | lvt flooring | wood flooring london | karndean flooring | herringbone flooring | laminate flooring london | amtico flooring | bathroom floor tiling | bathroom tiling | kitchen tiling | floor tiling | porcelain tiling | terrazzo tiling | painting and decorating leicester | painter and decorator ealing | painting and decorating brighton | local decorators

Ufa1688 Постоянный участник

07.10.2022 20:54                   URL #47 In that case the ufabet เข้า สู่ระบบ shooter was said ทางเข้าufa1688 to have erupted after an argument aff 1688 with another soldier over ufa1688 a land-selling commission UFA1688 fee. In this case, the motive ราคาบอล is unclear but after terrorizing สล็อตออนไลน์ the childcare center, Panya Kamrab ลิงค์รับทรัพย์ a 34-year-old former policeman drove แฮนดิแคป home and shot his wife and child บอลสเต็บ before taking his own life.

guest: 123vega IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость

12.11.2022 12:45               URL #48 A long, beautiful stretch SUPERSLOT เครดิตฟรี of sand in Australia's สล็อต โร มา เว็บตรง tropical far north, Wangetti Beach, was Toyah ทดลองเล่นสล็อตโรม่า Cordingley's favourite beach. It is also where she died, in what ROMA SLOT has been called a "frenzied and brutal and sadistic" attack. SLOT JOKER The 24-year-old had gone to the SLOTXO beach to walk her dog on 21 October 2018, as she เครดิต ฟรี กด รับ เอง 50 บาท had done countless times before, but never came home. The PG SLOT ซื้อฟรีสปิน next morning her father found her "messed up" body half buried in sand dunes. Her JOKER ROMA เว็บตรง beloved dog was tied up nearby, unharmed. Four PG SLOT ทางเข้า years on, Australian authorities are appealing for the public's help in an international hunt to find the man they believe killed Toyah - Rajwinder Singh.

Ufa1688 Постоянный участник

14.03.2023 08:07                   URL #49 David Carrick ทาง เข้า ufabet a serial sex offender ufabet vip served in one of Britain’s ทาง เข้า ufabet มือ ถือ most elite armed police units แฮนดิแคป คือ for years. He is now behind bars 123goal but his ability to evade justice nigoal123 has only fueled a growing distrust app aff1688 and anger toward police ปั่นสล็อต in the United Kingdom. CNN has เกมสล็อต investigated how failures may have prevented สูตรสล็อต Carrick from being stopped sooner.

Jaislmer Escort IP-штамп: frQrtJ1xVpdzY гость

16.03.2023 07:29               URL #50 We have an extensive list of hot and gorgeous Escort InJaislmer who are ready to satisfy your cravings. They are available for both short and long-term relationships and are willing to do anything for you! Website https://www.depika-kaur.in/jaisalmer-escorts https://www.depika-kaur.in/abu-road-escorts Our Linkes https://www.depika-kaur.in/amet-escorts https://www.depika-kaur.in/antah-escorts https://www.depika-kaur.in/anupgarh-escorts https://www.depika-kaur.in/arthuna-escorts https://www.depika-kaur.in/asind-escorts https://www.depika-kaur.in/asnawar-escorts https://www.depika-kaur.in/atru-escorts https://www.depika-kaur.in/badnor-escorts https://www.depika-kaur.in/badopal-escorts https://www.depika-kaur.in/bagar-escorts https://www.depika-kaur.in/bagru-escorts

*	« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »