Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Лишние полосы в ПЦР!
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 29.08.2018 02:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Carbon Copy @ 27.08.2018 17:15)
Ссылка на исходное сообщение  По собственному опыту бетаин работает лучше, чем ДМСО. Я когда-то ставил ПЦРки (Fragile X syndrome), где вся вода в реакции была замещена на 5М бетаин. Правда, то были обычные ПЦР, не сиквенс.

Бетаин хранится хуже (это крахмал/сахар своего рода) и стоит значительно дороже. В бетаине что хорошо - что он в отличие от ДМСО полимеразу не ингибирует почти.
Но в капилляр его пихать в секвенатор после ПЦР без очистки - это можно сразу линейку менять. lol.gif

У меня правило такое - пробуй ДМСО, потом всякие дикие режимы (типа "вообще без магния") с праймерами >72C. Бетаин в серию не пустишь, разоришься при больших объёмах его покупать. До сих пор его нету в стоках и пока всё и без него неплохо оптимизируется.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.08.2018 15:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

в секвенатор (по крайней мере коммерческий) никто не засунет ничего, что не предписано протоколом, себе дороже. жизнь такова, знаете ли
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 29.08.2018 16:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Бетаин стоит копейки. Этилен гликоль и 1,2-пропандиол ещё говорят для GC-rich ПЦР хороши, не знаю, сам не пробовал. Реакции перед зарякой секвенатора чистят всегда, в первую очередь - из-за соли, которая меняет электрофоретическую подвижность ДНК.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.08.2018 17:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Carbon Copy @ 29.08.2018 17:25)
Ссылка на исходное сообщение  Бетаин стоит копейки. Этилен гликоль и 1,2-пропандиол ещё говорят для GC-rich ПЦР хороши, не знаю, сам не пробовал. Реакции перед зарякой секвенатора чистят всегда, в первую очередь - из-за соли, которая меняет электрофоретическую подвижность ДНК.

понятно. но гонять кастомерные реакции невозможно, это попросту не практикуется. Получится хрен знамо чего, а рекламации выслушивать - то еще удовольствие
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 29.08.2018 17:37     Сообщение для модератора         Личное письмо

Если речь о ПЦР ГЦ-богатых фрагментов, лучшим улучшителем-усилителем smile.gif является Бетаин+ДМСО в соотношении 1,5 М (не более) к 4-5% (не более - для ябреного забаненного скептика). Эти два компонента имеют совершенно разные механизмы действия на функцию феремента и взаимодействия праймеров с матрицей, что в итоге элиминируют неспецифику и усиливают основной сигнал, даже на матрицах с 99 % ГЦ.
Сто раз обсуждали на форуме с ссылками на первоисточники. Реактивы доступны, стоят копейки, хранятся при температуре окружающей среды... и ничего общего не имеют с сахаридами (для ЯЗС).
Я лично устал одно и то же говорить! mad.gif
Для Карбонича - не на подвижность ДНК в капилляре влияют соли из ПЦР буфера, а на процесс инъекции продукта в капилляр, основанный на электрокапиллярном явлении.
Согласен с Ронни, ПЦР продукт перед нанесением необходимо чистить или разбавить в 100 и более раз водичкой, формамидом как указываются в стандартных протоколах.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 29.08.2018 17:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Ну, я бы всё же обеспокоился прикрытием от гнева недовольных клиентов. Забил бы строку в прайс листе "оптимизация реакции" с какой-нибудь охрененной ценой на порядки выше рутины и мелким шрифтом "результат не гарантирован". Наличие отмаза лучше, чем его отсутствие.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.08.2018 18:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

ну, при огромном потоке сиквенсов и это- не панацея. там своих веселых шутчек хватает, чтобы разбираться. так чта... Проще отказаться от 1% заказов (на самом деле, думается, много меньше), чем затормозить 99 остальных, и чего ради? Не все уди, что клюет
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 30.08.2018 22:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(-Ъ- @ 29.08.2018 18:37)
Ссылка на исходное сообщение 
Я лично устал одно и то же говорить! mad.gif

Так можете молчать, я Вас за язык не тянул.
Но я всё же Вам добавлю, что склон вправо >7% DMSO (в сторону увеличения концентраций) более перспективен, чем влево (5% - это почти то же что и вода, если совсем честно, 10% - это начало изменения свойств растворителя в реакциях ПЦР).
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 03.09.2018 22:12     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail

Попробовали с 10% ДМСО. Лажа получилась. Похоже полимераза практически убита им.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 04.09.2018 13:08     Сообщение для модератора         Личное письмо

(metrim @ 03.09.2018 23:12)
Ссылка на исходное сообщение  Попробовали с 10% ДМСО. Лажа получилась. Похоже полимераза практически убита им.

Приятно, что продолжаете решать проблему, но только теоретиков больше не слушайте. А мои ПЦР мастермиксы ВСЕГДА ГОТОВЫ прийти к Вам на помощь, безвозбезно. smile.gif
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 04.09.2018 13:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Если полимераза убита - удлинните отжиг из расчёта минуты на 500 букв шаблона. Попробуйте 5С выше и ниже температуру отжига от нынешней. Магний уменьшите до предела, скажем до 0,5 мМ. Ну и если это не поможет - спускайтесь на 7% DMSO.

ПЦР - это многофакторное пространство оптимизации. И чужими пробниками жив не будешь, пока не найдёшь сам зону в которой по всем факторам оптимум... Первая доза у них всегда бесплатно. А потом - не купить, поскольку с аукционами госструктур они бросили работать.

Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 04.09.2018 13:16
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 04.09.2018 13:50     Сообщение для модератора         Личное письмо

(banned sceptique-NMRguy @ 04.09.2018 14:14)
Ссылка на исходное сообщение  Если полимераза убита - удлинните отжиг из расчёта минуты на 500 букв шаблона. Попробуйте 5С выше и ниже температуру отжига от нынешней. Магний уменьшите до предела, скажем до 0,5 мМ. Ну и если это не поможет - спускайтесь на 7% DMSO.

ПЦР - это многофакторное пространство оптимизации. И чужими пробниками жив не будешь, пока не найдёшь сам зону в которой по всем факторам оптимум... Первая доза у них всегда бесплатно. А потом - не купить, поскольку с аукционами госструктур они бросили работать.

Вы поглядите, что человек советует confused.gif Это такое.....! no.gif

пы сы: Да, не работаем, потому что сами себе враги. tongue.gif
NMRguy, проблема решаема элементарно, но про это могу только в личку.
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 04.09.2018 14:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Дорогой -Ъ-, я советую только то, что пробовал сам и у нас сработало. Что мешает - так это то, что я не знаю какого качества реагенты у metrim-а. ДМСО должно быть свежеоткрытым или ампулированным на хранении. Иначе всё зря (оно портится при контакте с кислородом и светом на хранении).

Решение проблемы в личке невозможно, так как лишит нас с Вами анонимности и железной гарантии Вашего качества (которое несмотря на Вашу жадность нас никогда пока не подводило), доступной лишь "вслепую". Потому мы сами решаем проблемы Вашей негибкости, правда возни при это гораздо больше. umnik.gif

Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 04.09.2018 14:23
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.09.2018 14:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

диалог становится интересным, намного интереснее, чем обсуждать % DMSO. Наблюдаю
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 04.09.2018 16:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Рио, а Вы властны разработать на заказ РТ-киты под 5-6 новых для вашей конторы локусов, если потом у Вас их покупать дальше будет возможно через дибильные аукционы?
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.09.2018 16:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Я ничем таким не занимаюсь. Но вопрос понятен. Ответ отрицательный
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 04.09.2018 17:02     Сообщение для модератора         Личное письмо

Жадным меня еще никто не называл. eek.gif Видимо, боятся в лицо сказать... lol.gif
NMRguy, что бы Вам такое подарить (ессно, из своих китов, слонов и пр. ну и в разумных пределах, конечно) чтобы Вы занесли меня в список нежадных друзей? beer.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 04.09.2018 17:04     Сообщение для модератора         Личное письмо

(banned sceptique-NMRguy @ 04.09.2018 17:09)
Ссылка на исходное сообщение  Рио, а Вы властны разработать на заказ РТ-киты под 5-6 новых для вашей конторы локусов, если потом у Вас их покупать дальше будет возможно через дибильные аукционы?

Кстати, я властен, почему нет, заказывайте! А аукционистам - только свистни confused.gif
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 04.09.2018 20:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Я им уже свистел, получил ответ что Вам принципиально неинтересно что-то продавать Ваше через этот маразматический механизм. Потому что обеспечение целый год возвращать потом, да и не факт что вернут. То есть 5-10% цены в минус сразу.
Участник оффлайн! metrim
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 04.09.2018 21:48     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail

(-Ъ- @ 04.09.2018 14:08)
Ссылка на исходное сообщение  Приятно, что продолжаете решать проблему, но только теоретиков больше не слушайте. А мои ПЦР мастермиксы ВСЕГДА ГОТОВЫ прийти к Вам на помощь, безвозбезно. smile.gif
Ну а что поделать, если задачу надо решать и решить. С признательностью опробую ваши мастермиксы, возможно сравню их с еврогеновскими.
Теоретиков послушал - потому что как неоднократно указывал - опыта в данной сфере у меня мало, а человек типа столь уверенно говорит ... Похоже правда скоро уже будет совет ЭДТА насыпать............
ДМСО у меня мерковский, но старый, хотя слабо верится что он "скис" настолько что уже в водном растворе его примеси в забуференной системе гасят реакцию. На ГХ-МС он каких либо заметных дополнительных пиков не давал.
Еще мне коллеги сказали, что у них проблема возникала с теми же еврогеновскими наборами колоночной очистки (со схожими объектами), именно с той каталожной позицией что и я использовал. После чего они набор выкинули, стали чистить на наборах других фирм или заказывать очистку и все наладилось.
Пока что попробуем поварьировать с праймерами для секвенирования, может лаборанты подскажут подходящий алгоритм
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 04.09.2018 23:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Если он старый (более года-двух открыт и в большой банке) - то в ПЦР его уже добавлять нельзя. Я не знаю почему, но работает только свежий, максимум - полгода-год после открывания. Открытые ампулы аликвотим и храним в темноте в морозилке, размороженные аликвоты в ходу максимум месяц.

Про ЕДТА юмор не понял, он всё вообще затормозит.

И ещё, никто кроме Вас не знает из чего Вы выделяете ДНК и чем. Как и то, как хорошо получилась конкретная Ваша партия праймеров. ПЦР при нормальном подходе требует огромной работы по поддержанию всего и вся в стабильном и свежем состоянии. Поскольку получится она может когда вообще всё свежее и оптимальное, а вот не пойти - практически по любой из МНОГОЧИСЛЕННЫХ причин.

Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 04.09.2018 23:48
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.09.2018 07:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Теоретиков послушал - потому что как неоднократно указывал - опыта в данной сфере у меня мало,"
Опыта нет, а подлягивает, шо твой осел- недавно ролик видел, прикольно, задними ногами кааак даст!. Тут приблизительно похоже
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 05.09.2018 15:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

В результате обсуждения нашего анонимного сотрудничества признаю свою вину, жадным оказался не -Ъ-, а одни из его посредников-дистрибьюторов, с которыми прекращаем всякие контакты и работу. Прошу прощения за свои преждевременные выводы.

Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 05.09.2018 15:26
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.09.2018 19:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

честное имя восстановлено, чепчики в воздух!

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Vadim Sharov
Участник оффлайн! бутанол
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 27.10.2018 18:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес

если неспецифический ампликон больших размеров или более тугоплавкий, то можно , снизив температуру денатурации, заингибировать его накопление

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): banned sceptique-NMRguy
Участник оффлайн! banned sceptique-NMRguy
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 27.10.2018 19:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(enchancer @ 11.10.2018 21:35)
Ссылка на исходное сообщение чтобы втюхать свои наборы, разлитые в подворотне. - Это всё что Вам нужно знать.

Но наборы его хорошо работали, этого же у них не отнять. Мы все - самовлюблённые кондомы redface.gif shuffle.gif , боюсь, даже Вы. Но при этом не все умеют делать наборы для выделения, которые весьма чистую геномку дают на выходе.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.10.2018 10:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

это личные заморочки, who gives a fuck!?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 29.10.2018 22:12     Сообщение для модератора         Личное письмо

(enchancer @ 11.10.2018 21:35)
Ссылка на исходное сообщение  Я уже несколько лет не занимаюсь наукой, и уже случайно зашёл на этот форум. И тут совсем забыл, оставить ценнейшее сообщение для потомков: -Ъ- этот человек настоящий самовлюблённый кондом, который только строит из себя специалиста, а на самом деле раздувает щёки, чтобы втюхать свои наборы, разлитые в подворотне. - Это всё что Вам нужно знать.

Визг трусливой побитой собаки... Видимо, когда-то больно наступил на хвост, пришлось бросить науку из-за этого confused.gif .
Но похвально, что проявляет заботу о потомках, за что ставлю цветочки. beer.gif
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  12.11.2021 18:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 14:24
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft