Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
(Carbon Copy @ 27.08.2018 17:15) По собственному опыту бетаин работает лучше, чем ДМСО. Я когда-то ставил ПЦРки (Fragile X syndrome), где вся вода в реакции была замещена на 5М бетаин. Правда, то были обычные ПЦР, не сиквенс. Бетаин хранится хуже (это крахмал/сахар своего рода) и стоит значительно дороже. В бетаине что хорошо - что он в отличие от ДМСО полимеразу не ингибирует почти. Но в капилляр его пихать в секвенатор после ПЦР без очистки - это можно сразу линейку менять. У меня правило такое - пробуй ДМСО, потом всякие дикие режимы (типа "вообще без магния") с праймерами >72C. Бетаин в серию не пустишь, разоришься при больших объёмах его покупать. До сих пор его нету в стоках и пока всё и без него неплохо оптимизируется. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
(Carbon Copy @ 29.08.2018 17:25) Бетаин стоит копейки. Этилен гликоль и 1,2-пропандиол ещё говорят для GC-rich ПЦР хороши, не знаю, сам не пробовал. Реакции перед зарякой секвенатора чистят всегда, в первую очередь - из-за соли, которая меняет электрофоретическую подвижность ДНК. понятно. но гонять кастомерные реакции невозможно, это попросту не практикуется. Получится хрен знамо чего, а рекламации выслушивать - то еще удовольствие |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Сто раз обсуждали на форуме с ссылками на первоисточники. Реактивы доступны, стоят копейки, хранятся при температуре окружающей среды... и ничего общего не имеют с сахаридами (для ЯЗС). Я лично устал одно и то же говорить! Для Карбонича - не на подвижность ДНК в капилляре влияют соли из ПЦР буфера, а на процесс инъекции продукта в капилляр, основанный на электрокапиллярном явлении. Согласен с Ронни, ПЦР продукт перед нанесением необходимо чистить или разбавить в 100 и более раз водичкой, формамидом как указываются в стандартных протоколах. |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
(-Ъ- @ 29.08.2018 18:37) Так можете молчать, я Вас за язык не тянул. Но я всё же Вам добавлю, что склон вправо >7% DMSO (в сторону увеличения концентраций) более перспективен, чем влево (5% - это почти то же что и вода, если совсем честно, 10% - это начало изменения свойств растворителя в реакциях ПЦР). |
metrim Постоянный участник Москва |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(metrim @ 03.09.2018 23:12) Приятно, что продолжаете решать проблему, но только теоретиков больше не слушайте. А мои ПЦР мастермиксы ВСЕГДА ГОТОВЫ прийти к Вам на помощь, безвозбезно. |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
ПЦР - это многофакторное пространство оптимизации. И чужими пробниками жив не будешь, пока не найдёшь сам зону в которой по всем факторам оптимум... Первая доза у них всегда бесплатно. А потом - не купить, поскольку с аукционами госструктур они бросили работать. Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 04.09.2018 13:16 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(banned sceptique-NMRguy @ 04.09.2018 14:14) Если полимераза убита - удлинните отжиг из расчёта минуты на 500 букв шаблона. Попробуйте 5С выше и ниже температуру отжига от нынешней. Магний уменьшите до предела, скажем до 0,5 мМ. Ну и если это не поможет - спускайтесь на 7% DMSO. ПЦР - это многофакторное пространство оптимизации. И чужими пробниками жив не будешь, пока не найдёшь сам зону в которой по всем факторам оптимум... Первая доза у них всегда бесплатно. А потом - не купить, поскольку с аукционами госструктур они бросили работать. Вы поглядите, что человек советует Это такое.....! пы сы: Да, не работаем, потому что сами себе враги. NMRguy, проблема решаема элементарно, но про это могу только в личку. |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Решение проблемы в личке невозможно, так как лишит нас с Вами анонимности и железной гарантии Вашего качества (которое несмотря на Вашу жадность нас никогда пока не подводило), доступной лишь "вслепую". Потому мы сами решаем проблемы Вашей негибкости, правда возни при это гораздо больше. Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 04.09.2018 14:23 |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
NMRguy, что бы Вам такое подарить (ессно, из своих китов, слонов и пр. ну и в разумных пределах, конечно) чтобы Вы занесли меня в список нежадных друзей? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(banned sceptique-NMRguy @ 04.09.2018 17:09) Рио, а Вы властны разработать на заказ РТ-киты под 5-6 новых для вашей конторы локусов, если потом у Вас их покупать дальше будет возможно через дибильные аукционы? Кстати, я властен, почему нет, заказывайте! А аукционистам - только свистни |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
|
metrim Постоянный участник Москва |
(-Ъ- @ 04.09.2018 14:08) Приятно, что продолжаете решать проблему, но только теоретиков больше не слушайте. А мои ПЦР мастермиксы ВСЕГДА ГОТОВЫ прийти к Вам на помощь, безвозбезно. Ну а что поделать, если задачу надо решать и решить. С признательностью опробую ваши мастермиксы, возможно сравню их с еврогеновскими.Теоретиков послушал - потому что как неоднократно указывал - опыта в данной сфере у меня мало, а человек типа столь уверенно говорит ... Похоже правда скоро уже будет совет ЭДТА насыпать............ ДМСО у меня мерковский, но старый, хотя слабо верится что он "скис" настолько что уже в водном растворе его примеси в забуференной системе гасят реакцию. На ГХ-МС он каких либо заметных дополнительных пиков не давал. Еще мне коллеги сказали, что у них проблема возникала с теми же еврогеновскими наборами колоночной очистки (со схожими объектами), именно с той каталожной позицией что и я использовал. После чего они набор выкинули, стали чистить на наборах других фирм или заказывать очистку и все наладилось. Пока что попробуем поварьировать с праймерами для секвенирования, может лаборанты подскажут подходящий алгоритм |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Про ЕДТА юмор не понял, он всё вообще затормозит. И ещё, никто кроме Вас не знает из чего Вы выделяете ДНК и чем. Как и то, как хорошо получилась конкретная Ваша партия праймеров. ПЦР при нормальном подходе требует огромной работы по поддержанию всего и вся в стабильном и свежем состоянии. Поскольку получится она может когда вообще всё свежее и оптимальное, а вот не пойти - практически по любой из МНОГОЧИСЛЕННЫХ причин. Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 04.09.2018 23:48 |
R-J-Dio Постоянный участник |
Опыта нет, а подлягивает, шо твой осел- недавно ролик видел, прикольно, задними ногами кааак даст!. Тут приблизительно похоже |
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
Сообщение было отредактировано banned sceptique-NMRguy - 05.09.2018 15:26 |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
бутанол Постоянный участник Новосибирск |
|
banned sceptique-NMRguy Постоянный участник временной жизни |
(enchancer @ 11.10.2018 21:35) Но наборы его хорошо работали, этого же у них не отнять. Мы все - самовлюблённые кондомы , боюсь, даже Вы. Но при этом не все умеют делать наборы для выделения, которые весьма чистую геномку дают на выходе. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(enchancer @ 11.10.2018 21:35) Я уже несколько лет не занимаюсь наукой, и уже случайно зашёл на этот форум. И тут совсем забыл, оставить ценнейшее сообщение для потомков: -Ъ- этот человек настоящий самовлюблённый кондом, который только строит из себя специалиста, а на самом деле раздувает щёки, чтобы втюхать свои наборы, разлитые в подворотне. - Это всё что Вам нужно знать. Визг трусливой побитой собаки... Видимо, когда-то больно наступил на хвост, пришлось бросить науку из-за этого . Но похвально, что проявляет заботу о потомках, за что ставлю цветочки. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |