Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Источник человеческой ДНК
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 20.01.2017 11:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Скажите пожалуйста, как можно выявить источник человеческой ДНК, есть ли способ понять что ДНК из крови или из клеток? Есть ли какие-то маркеры в чистом ДНК или можно провести тест еще до экстракции? Произвожу определение крови в москитах, бывают контаминации с человеческой ДНК. Хочу знать наверняка, что источник ДНК из крови.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.01.2017 13:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Ну, например ПЦР на alu повтор должен неплохо дискриминировать чел. ДНК. А вот кровь или не кровь это сложнее возможно есть смысл заморочиться на иммуноглобулиновые гены, которые созревают в процессе дифференцировки клеток костного мозга до иг-продуцирующих клеток.

Кстати, ооочень простое решение ИФА(иммуноферментный анализ) на IgG человека. Практически 100% подтверждение, что вы имеете дело с кровью и с кровью не кого-нибудь, а человека.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Liora
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.01.2017 17:28     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Вопрос не понял.
"Произвожу определение крови в москитах"... confused.gif ,
А можно другими словами?
Длинные каникулы вредят не только печени... shuffle.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): fr45uHVgO7WZ2
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.01.2017 20:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Я вот тоже поражаюсь способности ммм угадывать подкорковые процессы пациента. Я даже переспрашивать не стал, так как даже не знаю с чего вопрос начать. Там все прекрасно )

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): dk
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 23.01.2017 07:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Не вполне понятна задача дифференциации источника человеческой ДНК в москитах - кровь/не кровь (что кроме крови Вы ожидаете найти в москитах от жертвы?). И не понятно что контаминировано человеческой кровью - Ваши москиты "жрут" какое-то животное и периодически покусываю человека и Вы хотите различать эти случаи? В зависимости от этого и стоит выбирать систему дифференцировки.
Участник оффлайн! le lapin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.01.2017 09:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Задача как раз вполне понятна и описана в первом посте. Человеку надо понять, пили москиты кровь человека или нет. Если делать анализ при помощи ПЦР, велика вероятность что человеческие ПЦР-продукты являются результатом контаминации. ДНК человека м.б. занесена при сборе материала или при его анализе.

Ответ на вопрос дал МММ.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.01.2017 14:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(le lapin @ 23.01.2017 07:46)
Ссылка на исходное сообщение  Задача как раз вполне понятна и описана в первом посте. Человеку надо понять, пили москиты кровь человека или нет. Если делать анализ при помощи ПЦР, велика вероятность что человеческие ПЦР-продукты являются результатом контаминации. ДНК человека м.б. занесена при сборе материала или при его анализе.

Ответ на вопрос дал МММ.

Нда?
ну перечитайте еще вопрос.
с проблемой человек/не человек еще понятно,
А вот кровь или не кровь... а что там еще может быть? Куски коленного сустава что ли?
Ну лимфа еще, наверное... не уверен. Но тут Игг не поможет.
Участник оффлайн! le lapin
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.01.2017 18:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Тот кто собирает образцы или тот, кто их анализирует может занести свою ДНК например, с чешуйками кожи или мельчайшими капельками слюны. Задача, очевидно, отличать такую контаминацию от возможной человечской крови в кишке москита.

А перечитать вопрос советую вам. Там все ясно как день. Не только я его понял smile.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Liora
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 24.01.2017 15:40     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(Liora @ 20.01.2017 12:53)
Ссылка на исходное сообщение  Скажите пожалуйста, как можно выявить источник человеческой ДНК, есть ли способ понять что ДНК из крови или из клеток? Есть ли какие-то маркеры в чистом ДНК или можно провести тест еще до экстракции? Произвожу определение крови в москитах, бывают контаминации с человеческой ДНК. Хочу знать наверняка, что источник ДНК из крови.

Сто раз перечитал... Из каких клеток??? confused.gif О чем речь?
Произошла, видимо, самая банальная контаминация и тут же самые безумно-заумные выводы! mad.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 24.01.2017 15:45     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(le lapin @ 23.01.2017 19:33)
Ссылка на исходное сообщение  Тот кто собирает образцы или тот, кто их анализирует может занести свою ДНК например, с чешуйками кожи или мельчайшими капельками слюны. Задача, очевидно, отличать такую контаминацию от возможной человечской крови в кишке москита.

А перечитать вопрос советую вам. Там все ясно как день. Не только я его понял smile.gif

Чешуйчатые люди облизывают москитов... confused.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 24.01.2017 15:48     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Liora, на какую матрицу у Вас праймеры, на уникальную или многокопийную?
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 30.01.2017 21:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Друзья, спасибо за отзывы. Le lapin совершенно верно вам пояснил. У меня завал. Работаю , как в операционной, 2 пары перчаток, халат, первая пара перчаток обрабатывается хлоркой. Все коробочки, стенды, пробирки обрабатываютя хлоркой и проходять 20 мин УФ. Но все равно получаю контаминацию, т.е. мои отрицательные контроли выходят положительными на человеческую днк. Хотя и не все. Куча проверок показывает, что контаминация скорее всего во время подготовки к пцр. Что еще можно сделать, чтобы предотвратить контаминацию? Может у кого есть ссылка на руководство по работе с такими образцами? Спасайте
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 30.01.2017 22:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(-Ъ- @ 24.01.2017 16:48)
Ссылка на исходное сообщение  Liora, на какую матрицу у Вас праймеры, на уникальную или многокопийную?

Извините, я не из России, не очень поняла ваш вопрос. Вы имеете ввиду, поднимают ли мои праймеры определенный вид носителя днк или все подряд? Если да, то Все подряд
Участник оффлайн! Panaev
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 31.01.2017 12:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Liora @ 30.01.2017 22:57)
Ссылка на исходное сообщение  Друзья, спасибо за отзывы. Le lapin совершенно верно вам пояснил. У меня завал. Работаю , как в операционной, 2 пары перчаток, халат, первая пара перчаток обрабатывается хлоркой. Все коробочки, стенды, пробирки обрабатываютя хлоркой и проходять 20 мин УФ. Но все равно получаю контаминацию, т.е. мои отрицательные контроли выходят положительными на человеческую днк. Хотя и не все. Куча проверок показывает, что контаминация скорее всего во время подготовки к пцр. Что еще можно сделать, чтобы предотвратить контаминацию? Может у кого есть ссылка на руководство по работе с такими образцами? Спасайте

Ну перчатки с коробочками это понятно.
Помещения, воздух у вас что из себя представляют?
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 31.01.2017 12:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(Panaev @ 31.01.2017 13:27)
Ссылка на исходное сообщение  Ну перчатки с коробочками это понятно.
Помещения, воздух у вас что из себя представляют?

Все стадии работы разделены, в разных комнатах и даже этажах. Днк добавляю в биологической "клетке", простите не знаю как по русски называется, с вытяжкой, после очистки и уф. Сегодня помимо всего одела маску
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 31.01.2017 13:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

1)Какую конкретно последовательность ДНК человека вы амплифицируете?
2)Очень похоже, что у вас идет загрязнение амплифицированным фрагментом.

Он может быть в одном из реактивов: Буфер(вода), полимераза, праймеры, dNTP. Он может быть в пипетках- сэмплерах. Может быть загрязнение помещения(но это менее вероятно)

И никакаие вот: "есть ли способ понять что ДНК из крови или из клеток? Есть ли какие-то маркеры в чистом ДНК или можно провести тест еще до экстракции? "
Вам не помогут.

Либо вы обновляете все разом. либо действуете методом исключения.

Сообщение было отредактировано MMM - 31.01.2017 14:10

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): -Ъ-
Участник оффлайн! Panaev
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 31.01.2017 13:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

(Liora @ 31.01.2017 13:53)
Ссылка на исходное сообщение  Все стадии работы разделены, в разных комнатах и даже этажах. Днк добавляю в биологической "клетке", простите не знаю как по русски называется, с вытяжкой, после очистки и уф. Сегодня помимо всего одела маску

Какие варианты?
1. Целевой фрагмент нужно выбирать с низкой копийностью.
2. Пробоподготовку проводить в помещениях не ниже класса B с соответствующей спецодеждой.
Контроль реактивов и расходников подразумевается.

В принципе, крови в москитах достаточно для ИФА. Поэтому лучше делать его.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 31.01.2017 13:23     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Спрашиваю другими словами: на какой ген праймеры, что Вы тестируете, от кого реактивы? Я пытаюсь узнать копийность матрицы (гена) чтобы предсказать происхождение контаминации "человеческой ДНК".
Я тоже как и МММ склонен к тому, что контаминация самая банальная - ампликонами.
Сначала загадили пипетку, ну а затем все компоненты реакции постепенно. Это пожар!
Меняйте все.
ПЫС: Интересно в какой стране девушка работает, где плохо говорят по-русски.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 31.01.2017 14:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

Плохо говорят по русски в самой России, что уж говорить о республиках бывшего СССР и странах СЭВ.

А где еще могут знать русский, но не до конца.
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 01.02.2017 06:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

А вот мне не все понятно (видимо я здесь самый отсталый) - какой отрицательный контроль дает сигнал на человеческую геномку? Отрицательный контроль выделения или отрицательный контроль постановки реакции? Я так понял что не все контроли ведут себя одинаково плохо - версия о контаминации ампликонами растворов, на мой взгляд, может оказаться не приоритетной. Если отрицательные контроли, независимо от их происхождения, дают положительный сигнал - вероятно контаминация растворов. а если нет - большой вопрос.
Вероятно есть некая пороговая концентрация ампликонов которая периодически выдает положительный сигнал а периодически нет, но для меня ситуация кажется странной. Я привык что уж если контаминация ампликонами то вылазит всегда.
Прежде чем обсуждать контаминацию, на мой взгляд, стоит поинтересоваться системой контролей в данной работе.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.02.2017 10:37     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

(Гоголь @ 01.02.2017 09:45)
Ссылка на исходное сообщение  ну лично меня больше смущает позитивный контроль "крови" комара  smile.gif

Комары, москиты - плохая модель. Лучше всего на клопах с одного, скажем, дивана. smile.gif
А если праймеры от высококопийных Alu-повторов, которых на геном тысячи (!!!), причем по всем хромосомам - туши весла. no.gif Бороться с этим в условиях ТС нереально.
А мои вопросы к ТС остаются в силе.
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 01.02.2017 10:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Вчера сделала контрольную плату, 96 ячеек. Вообще без добавления днк, только микс и вода. 4 ячейки вышли положительные на человека. Голову сломала уже
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 01.02.2017 11:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

[quote=-Ъ-,31.01.2017 14:23]Ссылка на исходное сообщение  Спрашиваю другими словами: на какой ген праймеры, что Вы тестируете, от кого реактивы? Я пытаюсь узнать копийность матрицы (гена) чтобы предсказать происхождение контаминации "человеческой ДНК".
Я тоже как и МММ склонен к тому, что контаминация самая банальная - ампликонами.
Сначала загадили пипетку, ну а затем все компоненты реакции постепенно. Это пожар!
Меняйте все.
ПЫС: Интересно в какой стране девушка работает, где плохо говорят по-русски.
[/quote
Праймеры к 12S and 16S mitochondrial rRNA gene, реактивы заказываются в местных проверенных фирмах. Все загрязнения поднитмаются давольно таки поздно (Ст=35-38-39), Real-time PCR. Заражение ампликонами возможно, но очеееень маловероятно. У нас строго с соблюдением поядка комнат. А идея завести свой набор пипеток и вычленить отдельный угол тоже уже родилась
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 01.02.2017 11:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

Идет определение крови, которую маскит пожрал
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.02.2017 11:40     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Я теперь все понял. Да нормальный у Вас русский, не хуже моего. smile.gif Про "чушню" Вы здорово сказали, а этого разбойника к вечеру забанят, частично.
Итак, встречный вопрос: Вы уверены в том что сигнал на реал тайм специфический, анализируете ли Вы после PCR продукты плавлением или используете зонды?
Митохондрий то самих на клетку сотни, а это уже много копий. Поэтому и спрашивал про копийность матрицы.
http://www.nature.com/articles/srep04089
Жду ответа. smile.gif
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 01.02.2017 11:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

Кровь В москитах не означает Кровь москитов
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 01.02.2017 12:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

Контаминация ампликонами после реал-тайма это маленько за гранью моего понимания - это же надо еще и пробирку открыть, а, если капают минмасло, то еще и вытряхнуть её. 4 пробирки из 96 - для контаминации ампликонами маловато, на мой взгляд, да и выход на позних циклах не их стиль. Уважаемый -Ъ- абсолютно прав ставя вопрос о "специфика-не специфика".
Я предполагал что загрязнения поступают с материалом (опыт работы в лаборатории по определению личности говорит мне что мало мест на этой планете не "запачканых" ДНК человека), но Ваш опыт с водой отбрасывает это предположение.
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 02.02.2017 09:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

(-Ъ- @ 01.02.2017 12:40)
Ссылка на исходное сообщение Итак, встречный вопрос: Вы уверены в том что сигнал на реал тайм специфический, анализируете ли Вы после PCR продукты плавлением или используете зонды?
Митохондрий то самих на клетку сотни, а это уже много копий. Поэтому и спрашивал про копийность матрицы.
http://www.nature.com/articles/srep04089
Жду ответа. smile.gif

Cпасибо вам за помощь и за статью, обязательно прочту. Извините, я не поняла вашего вопроса. Что такое плавление и зонды? Как это на английском?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 02.02.2017 12:04     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

Зонды - probes (TaqMan....), плавление - melting (SybrGreen....)
Почитайте здесь, заодно русскую терминологию освоите:
http://molbiol.ru/protocol/12_07_03.html
А совершенствуйтесь на этом сайте:
http://www.gene-quantification.de/abi-rtpcr-pcr.pdf
http://www.gene-quantification.de/
А вообще в инете очень много веселых картинок про реал тайм PCR, надеюсь, найдете что по душе для самообразования.
По сути темы подумал... ведь у Вас праймеры (зонды)могут быт не супер специфичными и они могут давать перекрестную реакцию. Для начала можно повысить темп. отжига, а лучше выставите последовательности праймеров (зонда) сюда на форум для обсуждения. Возможно, праймеры Ваши из той статьи, что я давал выше.
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 02.02.2017 12:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

(-Ъ- @ 02.02.2017 13:04)
Ссылка на исходное сообщение По сути темы подумал... ведь у Вас праймеры (зонды)могут быт не супер специфичными и они могут давать перекрестную реакцию. Для начала можно повысить темп. отжига, а лучше выставите последовательности праймеров (зонда) сюда на форум для обсуждения. Возможно, праймеры Ваши из той статьи, что я давал выше.

Я использую HRM mix (как зонд).
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 02.02.2017 14:28     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

HRM это не зонд - High-resolution melting analysis - ПЦР метод для обнаружения различий (полиморфизмов) в ДНК.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19418555
Честно, устал вытягивать из Вас инфо. Нужны сиквенсы праймеров и протокол хотя бы краткий над чем Вы работаете. Можете выкладывать на инглиш, на идиш (иврит) не надо, я не полиплот. smile.gif
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 02.02.2017 16:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

(-Ъ- @ 02.02.2017 15:28)
Ссылка на исходное сообщение  HRM это не зонд - High-resolution melting analysis - ПЦР метод для обнаружения различий (полиморфизмов) в ДНК.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19418555
Честно, устал вытягивать из Вас инфо. Нужны сиквенсы праймеров и протокол хотя бы краткий над чем Вы работаете. Можете выкладывать на инглиш, на идиш (иврит) не надо, я не полиплот. smile.gif

А можно ваш мейл? Написала бы в нормальном формате. Тяжело искать по памяти русские буквы. И спасибо вам огромное за желание помочь.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 03.02.2017 16:45     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

(Liora @ 02.02.2017 17:20)
Ссылка на исходное сообщение  А можно ваш мейл? Написала бы в нормальном формате. Тяжело искать по памяти русские буквы. И спасибо вам огромное за желание помочь.

Отправил.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Liora
Участник оффлайн! Sardanapal




 прочитанное сообщение 04.02.2017 12:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

(Liora @ 01.02.2017 12:46)
Ссылка на исходное сообщение  Кровь В москитах не означает Кровь москитов


1. Убедиться в том, что исходный материал содержит кровь человека можно с помощью иммунохроматографических тестов http://www.ifi-test.com/rsidtm-blood/ (до лизиса) Реальная чувствительность тестов 50 nl крови. Если этой чувствительности недостаточно, можно использовать тесты на гемоглобин http://www.seratec.com/node/49. Они более чувствительны, но менее специфичны к человеку. На комарах в любом случае срабатывать не будут.

2. Добиться всегда чистых контролей при амплификации мтДНК на 35 циклах в обычной лаборатории практически невозможно. Это соответствует примерно 0.1 pg геномной ДНК выделенной из крови (т.е. 1/65 генома одной клетки). Для этого нужны "чистые помещения". Но скорее всего для Вашей работы в этом нет необходимости. "Позитивные" на кровь человека комары будут выходить значительно раньше. Какой объем человеческой крови Вы ожидаете в комаре? Какой требуется уровень детекции? 1 мкл крови содержит 30-60 нг ДНК. Если выставите cut off на 32 циклах, вы достоверно будете выявлять 1 nl крови.

Всего благодарностей: 3Поблагодарили (3): ksm, Liora, -Ъ-
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 05.02.2017 10:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

(Sardanapal @ 04.02.2017 13:22)
Ссылка на исходное сообщение  1. Убедиться в том, что исходный материал содержит кровь человека можно с помощью иммунохроматографических тестов http://www.ifi-test.com/rsidtm-blood/ (до лизиса)  Реальная чувствительность тестов 50 nl крови. Если этой чувствительности недостаточно, можно использовать тесты на гемоглобин http://www.seratec.com/node/49. Они более чувствительны, но менее специфичны к человеку. На комарах в любом случае срабатывать не будут.

2. Добиться всегда чистых контролей при амплификации мтДНК на 35 циклах в обычной лаборатории практически невозможно. Это соответствует примерно 0.1 pg геномной ДНК выделенной из крови (т.е. 1/65 генома одной клетки). Для этого нужны "чистые помещения". Но скорее всего для Вашей работы в этом нет необходимости. "Позитивные" на кровь человека комары будут выходить значительно раньше. Какой объем человеческой крови Вы ожидаете в комаре? Какой требуется уровень детекции? 1 мкл крови содержит 30-60 нг ДНК. Если выставите cut off на 32 циклах, вы достоверно будете выявлять 1 nl крови.

Огромное спасибо вам за совет, я тоже предполагаю,что "позитивные" на кровь человека комары должны выхотить на более ранних сайтах, с сожалению в данный момент нет возможности удостоверится. Я тоже думала о том, чтобы укоротить циличность пцр, но это очень уж просто. Мы не ищем простых путей smile.gif/ На самом деле есть образцы, которые поднимаются только на круге 34-35, хоть и не много таких.
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 05.02.2017 12:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

(Sardanapal @ 04.02.2017 13:22)
Ссылка на исходное сообщение  1. Убедиться в том, что исходный материал содержит кровь человека можно с помощью иммунохроматографических тестов http://www.ifi-test.com/rsidtm-blood/ (до лизиса)  Реальная чувствительность тестов 50 nl крови. Если этой чувствительности недостаточно, можно использовать тесты на гемоглобин http://www.seratec.com/node/49.


Скажите пожалуйста, может вы знаете о RSID-Blood подобной системе, только для проверки 96 образцов одновременно?
Участник оффлайн! Sardanapal




 прочитанное сообщение 05.02.2017 21:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

Наверное можно для 96 луночного формата что-то найти: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/produc...ng=en®ion=RU

Но можно просто раститровать 1 мкл свежей крови и поставить амплификацию в повторах. Тогда вам будет понятно, где заканчивается чувствительность Вашего метода и начинается контаминация.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Liora
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 06.02.2017 06:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

У меня возник вопрос к ТС не совсем относящийся к вопросу темы: кровь в москитах переваривается со всеми компонентами - имеется ли зависимость количества ДНК человека детектируемой Вами от степени "переваривания обеда"? Например как функция от времени "после обеда"? Мне просто любопытно. Я понимаю что Вы не отсчитывали с секундомером и не проводили опросов среди отловленных комаров, но на Ваше ощущение как?
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 06.02.2017 09:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

(borigv @ 06.02.2017 07:11)
Ссылка на исходное сообщение  У меня возник вопрос к ТС не совсем относящийся к вопросу темы: кровь в москитах переваривается со всеми компонентами - имеется ли зависимость количества ДНК человека детектируемой Вами от степени "переваривания обеда"? Например как функция от времени "после обеда"? Мне просто любопытно. Я понимаю что Вы не отсчитывали с секундомером и не проводили опросов среди отловленных комаров, но на Ваше ощущение как?

В точности не смогу ответить, но "обед" 2-3 летней давности точно поддается определению, при условии, что условия хранения были правильными
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 06.02.2017 09:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

(Sardanapal @ 05.02.2017 22:55)
Ссылка на исходное сообщение  

Но можно просто раститровать 1 мкл свежей крови и поставить амплификацию в повторах. Тогда вам будет понятно, где заканчивается чувствительность Вашего метода и начинается контаминация.

"Раститровать" - это разные объемы брать? Правильно я понимаю? Очень хорошая идея! Но как я пойму, что идет уже контаминация, а не реально позитивный результат? В эксперименте с пустой платой получила несколько положительных результатов.
Участник оффлайн! Panaev
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 06.02.2017 17:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(Liora @ 06.02.2017 10:32)
Ссылка на исходное сообщение  "Раститровать" - это разные объемы брать? Правильно я понимаю? Очень хорошая идея! Но как я пойму, что идет уже контаминация, а не реально позитивный результат? В эксперименте с пустой платой получила несколько положительных результатов.

Раститровать - это сделать последовательные разведения образца.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Sardanapal
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 08.02.2017 07:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

Уважаемая ТС не совсем поняла мой вопрос: меня интересовало не время сохранности ДНК в "зафиксированном" образце - об этом я имею некоторое представление. Меня интересовало сохранность ДНК при переваривании крови живым москитом, во времени. В течении какого времени кровь переваривается москитом до такой степени что ДНК человека с помощью ПЦР не улавливается? Ваши образцы поступают к Вам каким образом - отлов в "дикой природе" с неизвестным временем после "обеда"? Или "кормление" москитов в лаборатории?
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 08.02.2017 12:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

(borigv @ 08.02.2017 08:23)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемая ТС не совсем поняла мой вопрос: меня интересовало не время сохранности ДНК в "зафиксированном" образце - об этом я имею некоторое представление. Меня интересовало сохранность ДНК при переваривании крови живым москитом, во времени. В течении какого времени кровь переваривается москитом до такой степени что ДНК человека с помощью ПЦР не улавливается? Ваши образцы поступают к Вам каким образом - отлов в "дикой  природе" с неизвестным временем после "обеда"? Или "кормление" москитов в лаборатории?

Извините за неточный ответ. Менее недели и от крови нет и следа, уже формируются яйца. По этой причине в моих тестах участвуют только 100% положительные на наличие крови особи.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): borigv
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 08.02.2017 12:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

(ksm @ 07.02.2017 21:50)
Ссылка на исходное сообщение  "Но как я пойму, что идет уже контаминация, а не реально позитивный результат?" например, если под подозрением ваш 10-кратный ПЦР буфер, то вы его грубо говоря используете вместо матрицы. т.е. все пробы ставите как отрицательные контроли. достаете баночку, гарантированно не контаминированную с новым буфером, делаете смеси 1/9, 1/99, 1/999 (подозреваемый/новый). вносите в ПЦР как ни в чем не бывало... и дальше, если у вас Cq будет возрастать при разведении, то это оно.
теоретически, придется прогнать все реактивы.
практически же серийные разбавления не нужны, а достаточно по очереди исключить все.
пипетки тоже, кстати
пакет с пробирками тоже, кстати
еще я бы попросил на вашем месте еще кого-нибудь сделать все действия ровно как вы, а потом сравнить...
...и в другой лабе...
и так далее, пока юная мисс Марпл не исключит назойливого вредителя!
...в общем, мы всем форумом очень болеем за вас, не забывайте держать нас в курсе ваших похождений. не забывайте добавлять фотографии к вашим постам!

Ооооох. Буфер каждый раз новая пробирка открыавется, праймеры свежие сделала, вода, пробирки, платы и пипетки проходят очистку и УФ. Другие руки тоже делали - было намного хуже.
Насчет делаьь в другой лаборатории, с этим очень сложно, пытаюсь и этого добиться.
Пока пытаюсь играться с условиями ПЦР, но буду рада новым идеям, т.к. мои на исходе
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 08.02.2017 16:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

(ksm @ 08.02.2017 14:56)
Ссылка на исходное сообщение  "очистку?!"

Писала выше - Работаю , как в операционной, 2 пары перчаток, халат, первая пара перчаток обрабатывается хлоркой. Все коробочки, стенды, пробирки обрабатываютя хлоркой и проходять 20 мин УФ. Но все равно получаю контаминацию
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 08.02.2017 16:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

Изменение программы ПЦР тоже не помогло. Украчивала количество циклов с 40 до 35, поднимала температуту присоединения праймеров с 58 на 60.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.02.2017 01:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

(Liora @ 08.02.2017 14:03)
Ссылка на исходное сообщение  Писала выше - Работаю , как в операционной, 2 пары перчаток, халат, первая пара перчаток обрабатывается хлоркой. Все коробочки, стенды, пробирки обрабатываютя хлоркой и проходять 20 мин УФ. Но все равно получаю контаминацию

Вопервых не верю, что хлоркой. Гипохлорид кальция нынче непопулярен както.
вовторых, толку от нее никакого, если просто протереть перчатки, как и от уф.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.02.2017 01:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

(ksm @ 08.02.2017 23:06)
Ссылка на исходное сообщение  "вовторых, толку от нее никакого," - неправда ваша!
а как же душевное спокойствие и самоуверенность?!

Так если б было. Нет спокойствия, сами видите.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): ksm
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.02.2017 01:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

(ksm @ 08.02.2017 23:06)
Ссылка на исходное сообщение  "вовторых, толку от нее никакого," - неправда ваша!
а как же душевное спокойствие и самоуверенность?!
"Гипохлорид кальция " - он Натрия. Белизна - натриевая соль

В мое время под хлоркой понималось кальция
https://ru.m.wikipedia.org/wiki/%D0%A5%D0%B...%81%D1%82%D1%8C
Участник оффлайн! Liora




 прочитанное сообщение 09.02.2017 09:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

(ksm @ 08.02.2017 20:07)
Ссылка на исходное сообщение  погодите, вы перчатки одни на вторые одеваете?

Да, одеваю 2 пары перчаток, одни на другие. Первые еще и очищаю хлоркой

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 11:48
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft