molbiol.ru -> X-gal+ITPG

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* X-gal+ITPG

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

zelensky
Постоянный участник
Ukraine - Israel - Canada -> ???

25.07.2002 10:12

URL #1

Засеяла чaшки Петри с вышеуказанными делами своей бактерией. После суток инкубирования 37C бактерия в силу подлости

и, кайется, крайне низкой конц-ии <img src="graemlins/weep.gif" border="0" alt="[рев в 3 ручья]" /> , не выросла. Чашка чистая. Можно ли ее засеять ече раз (я имею в виду - соxранили ли X-gal+ITPG свои св-ва?
<img src="graemlins/teapot.gif" border="0" alt="[чайник]" />

K-2
Постоянный участник

25.07.2002 10:54

URL #2

IMHO можно, но правильнее (и полезнее) сделать новую, так как при повторном засеве старой чашки вероятность зароста будет выше и будете гадать, почему не красятся.
[ 25-07-2002: Сообщение отредактировано: K^2 ]

Grunt
Постоянный участник

25.07.2002 14:43

URL #3

Эээ не ясно. Она все же не выросла или просто не покрасилась?
Если не растет дело может быть в токсичности экспрессируемого продукта (смотря что у вас там заклонировано). Сделайте контроль без ИПТГ.
Если не красятся, поинкубируйте еще. Например на 25 град С, чтоб не переростали.

zelensky
Постоянный участник
Ukraine - Israel - Canada -> ???

25.07.2002 14:58

URL #4

Спасибо. Просто у меня дикая непруха с этой тварью. Ее хранили в йидкой среде с 21.10 прошлого года и теперь хотят, чтоби я из нее плазмиду виделяла. Мол.биол. я начинаючи, что есть, то есть, но микробиологию то я знаю не понаслышке. Мне кайется, что питаться извлечь из ни в чем неповинной бактерии после такой йизни какой-то реzультат - негуманно как по отношению к ней, так и ко мне.
[Текст переведён с транслита]

petr
Постоянный участник

25.07.2002 15:33

URL #5

А можно поподробнее, как хранили, и что эта за плазмида?

Grunt
Постоянный участник

25.07.2002 15:39

URL #6

25.7.2002-21.10.2001 это 9 месяцев. Без шансов.

25.07.2002 15:41

URL #7

Попробуйте сначала разогнать ее в жидкой среде. Если будет расти - высевать на чашку. Если сдохла - ...
K^2

petr
Постоянный участник

25.07.2002 15:45

URL #8

А то я в свое время примерно так же накололся, это даже наверное для веселой странички подойдет. На заре дипломничества, дала мне одна ... задание: протрансформировать клетки тем, что она там налигировала, нарастить, выделить плазмиду, вырезать вставку. Все как положено. Если не получится, то взять "вон те клетки и выделить из них плазмиду", и т.д. Ну, конечно провозился я с этой лигазной смесью, трансформировал там, плазмиду выделял (она сволочь все никак не хотела выделяться), Наконец выделил - а она без вставки (весь газон - без вставки). Взял "вон те клетки", которые стояли на +4 (уж там-то точно она должна быть! подумал я), опять - проблемы с выделением плазмиды, опять без вставки.
Почему? Узнал только потом. Дело в том, что плазмида - pBluescript, хорошая конечно, но если хранить, то она рекомбинирует и вставку выплевывает. Вот так

zelensky
Постоянный участник
Ukraine - Israel - Canada -> ???

25.07.2002 16:15

URL #9

Я ее как раз вчера с горя на жидкую среду (5 мл ЛБ) посадила, чего-то выросло, сегодня выделила плазмиду - ее там 0.08 мкг/мкл, я ее поставила резаться до завтра.

K-2
Постоянный участник

26.07.2002 12:44

URL #10

А кто стер мой вчерашний мессадж??? Не понравился, что ли? Так и быть, повторю азы:
Бак. культуру после любого хранения следует сначала подращивать в жидкой среде, потом рассевать на чашке, отбирать несколько колоний, наращивать их, выделять плазмиды, проверять и после этого работать с ними.
С полудохлыми бактериями лучше не работать, так как при неправильном хранении даже простые плазмиды могут менять сиквенс (немножечко или частично, но достаточно, чтобы загубить Вашу работу), терять сайты и выбрасывать вставку.
Поэтому, если есть возможность, для работы лучше брать культуру из музея (хоть кто-нибудь в институте ведь хранит ее правильно?), а не то, что кто-то когда-то забыл в холодильнике.
Кажется, у Вас назревают такие выводы...

zelensky
Постоянный участник
Ukraine - Israel - Canada -> ???

26.07.2002 12:50

URL #11

Я полностью согласна. Хочу уточнить ече раз - возможно - наука без моего ведома продвинулась - мне предстоит обьясняться с боссом - ведь в жидкой среде НЕЛьЗЯ хранить бактерию???

K-2
Постоянный участник

26.07.2002 12:58

URL #12

Нет, можно, но {с глицерином или DMSO} и {на -70С или в азоте} (см., кажется, в Маниатисе, это такой же стандарт, как посев уколом в агаровые столбики).
Кстати, м.б., плазмида просто очень низкокопийная?
[ 26-07-2002: Сообщение отредактировано: K^2 ]

zelensky
Постоянный участник
Ukraine - Israel - Canada -> ???

26.07.2002 13:00

URL #13

Да фиг ее знает. Это вообче не я делала, а моя предшественница, шеф мне показал бактерию, велел добыть плазмиду, порезать и приготовить пробу. Я и промучалась неделю...Хуже нет - за кем-то доделывать...

[Текст переведён с транслита]

K-2
Постоянный участник

26.07.2002 13:06

URL #14

Ну, хоть на каком векторе? И какой размер вставки? С экспрессией или нет? В каких клетках?

kglebov
Постоянный участник
Германия Гёттинген

26.07.2002 13:25

URL #15

Может еще раз попробовать с хлорамфениколом, если действительно плазмида низкокопийная......

Veshka
Постоянный участник
Москва

26.07.2002 14:14

URL #16

Это почему это без шансов? Надо часть клеток охреначить горячим фенолом с SDS-ом при 65 градусах, затем аккуратненько крутануть от дебриса, ещё пофенолить, осадить и положить на электропорацию с хорошими (>10x9) клетками. И высеять на несколько разных антибиотиков (по одной четвёртой получится, если основные) Если после этого не вырастет - это точно опаньки. А ИПТГ - ни-ни, ни в какую. Аллах знает, что там в плазмиде и как оно на индукцию из дохлых клеток реагирует...

Veshka
Постоянный участник
Москва

26.07.2002 14:16

URL #17

2Petr -Это Вы откуда взяли панаму о выплёвывании Блюскриптом вставок? Я на нём уже почти десять лет работаю и чтобы он хоть что-то выплюнул...

Stepa

26.07.2002 14:25

URL #18

Вешка правильно советует, я так космиды оживлял в большом количестве
[Текст переведён с транслита]

petr
Постоянный участник

26.07.2002 14:48

URL #19

to Veshka: Я тоже с ней работаю уже вот года 4 (правда не так часто, по необходимости), вот у меня она взяла и выплюнула. Дело было давно. Клетки хранились долго в холодильнике на +4, при этом меня уверяли, что вставка там изначально была (это я сейчас научился верить в основном собственному опыту, а когда был маленький, то верил всем, и очень жалко, что вот такого сайта, как этот, года этак 4 назад не было:-(((). Конечно, сейчас, я думаю, что "а был ли мальчик?", но в голове отложилось, что блюскрипт может выплюнуть вставку, и я сейчас стараюсь как можно скорее выделять плазмиду, и хранить уже только ДНКу (а клетки всегда можно ретрансформировать). И больше я с такими делами не сталкиваюсь. Вот :-))

petr
Постоянный участник

26.07.2002 14:51

URL #20

то zelensky:
А IPTG c XGAL^ом сразу не надо (или ставьте контроль), а то и правда мож какое г.. там у вас сидит, и ничего не вырастет, да и сине-булая селекция - это конечно хорошо, но... может большую падлу подкинуть. Уж лучше PCR бактерий.

K-2
Постоянный участник

26.07.2002 17:13

URL #21

Ну, вроде, тянуть плазмиду из старого стока логичнее, чем разгонять культуру... Если он не сильно сдох... А если сильно сдох - разгонять... или сразу выбросить...

zelensky
Постоянный участник
Ukraine - Israel - Canada -> ???

26.07.2002 18:24

URL #22

2 всем
Огромное спасибо - надо переварить инфу и сообразить = что луче.
А мойет - проче по-новой трансформировать?
[Текст переведён с транслита]

Veshka
Постоянный участник
Москва

26.07.2002 18:51

URL #23

2zelensky. А есть из чего? Тогда вообще оБ чём спич?
2petr. Это Вас уверяли... Блюскрипт ничем от других стандартных высококопийных плазмид в этом плане не отличается. Единственное его преимущество - большой процент суперкойла, что приятно. А так общий принцип работы с подозрительными вставками такой - выкидываете из плазмиды ВСЁ по Pvu II (это проходит со многими вариантами ПУКоподобных плазхмид

, клонируете вашего уродца втупую, а потом только разбираетесь...

petr
Постоянный участник

26.07.2002 20:20

URL #24

to zelensky: блин, коли есть нормальная (известная, а не непойми что) плазмида, КОНЕЧНО(!) я б по новой затрансформировал (тем более, что это уже небось наработанная плазмида, а не лигазная смесь)!
то Veshka: Сгласен с Вами полностью, но только если одна-две плазмиды, а если много непойми чего, то все же лучше (быстрее) PCR бактерий. Кстати, инверсный PCR у меня прекрасно получился с первого раза, и вот только что загибридизовал его, покрасилось то что надо. Так что СПАСИБО Вам большое за советы. Правда конечно еще дооптимизировать надо будет (ненавижу), и на мой взгляд, весьма важно засамолигировать правильно.

Veshka
Постоянный участник
Москва

26.07.2002 21:20

URL #25

Не за что. PCR для детекции не пойми чего действительно как правило наиболее удобная вещь, но я же говорю не о детекции а о работе с противными

вставками, которые в конечном итоге всё-равно надо куда-то клонировать...

can be worse
Участник

26.07.2002 22:57

URL #26

ну вы даете господа!!!! если сдохла - так сдохла. А ксли кто-то живой - тряхони да посей. И чего это вдруг плазмиде сиквенс-то менять при хранении - дубу что ли вы дались? а?

tamm
Постоянный участник

27.07.2002 01:11

URL #27

Господа!Прошу прощения - PCR бактерий - это как?Можно чуть подробнее.Спасибо.
tamm

petr
Постоянный участник

27.07.2002 13:58

URL #28

To Tamm: Очень просто. У Вас есть газон после трансформации (ну или не очень газон:-))). Есть сиквенс плазмиды, куда Вы зашивали вставку. В MCS этой плазмиды есть сайты для праймеров Reverse (универсальный), M13(-20), Т3, Т7 и не только (от плазмиды зависит). Далее Вы раскапываете master mix c нужными праймерами (только чтоб между ними вставка Ваша заклонированная была), раскапываете его по пробиркам. Далее зубочистками (или носами, как удобнее), скалываете колонии и тычете их в ПЦР-смесь (можно по 10 мкл для экономии). После все писиарите, не забыв про контроль (плазмиду без вставки, ну и воду конечно). разгоняете и смотрите, где у Вас вставка есть.

zelensky
Постоянный участник
Ukraine - Israel - Canada -> ???

28.07.2002 11:47

URL #29

Огромное спасибо за массу информации, у меня ече вопрос - почему колонии скалывают зубочистками или ече чем? А чем плоха классическая бак.петля???

Grunt
Постоянный участник

28.07.2002 12:38

URL #30

конечно, виртуоз и топором колонию сколет. Не только петлей.

Veshka
Постоянный участник
Москва

28.07.2002 13:27

URL #31

А долго прожигать. Или петли одноразовые нужны отдельно. Лучше всего носиком - дёшево и сердито. При этом необязательно его на работающий сэмплер надевать, можно и на старый - лишь бы сбрасыватель был. Зато старый можно всё время держать стерильным.

28.07.2002 23:52

URL #32

Вот это хороший совет. А то когда-то в оч-чень известном институте изобретали электропетлю, даже патент получили... Я потом такую сам сварганил из ЛАТРа, нихрома и двух пипеток - просто орудие пытки получилось! Ну и работали ей, пока не надоело... А насчет зубочисток (и спичек) уже писано - не годятся из-за пропитки.

28.07.2002 23:59

URL #33

2 can be worse
Говорят, что при перерастании активно растущей бактерии из-за недостатка пит. в-в, кислорода и избытка метаболитов в искусственых многокопийных плазмидах могут накапливаться ошибки репликации.

Ivolga
Постоянный участник
HK

29.07.2002 07:22

URL #34

Гм, а у нас принято картоночку порезать на длинные полоски, в стаканчик, автоклавирование, а потом перекалываешь сколько влезет, использованное можно выбросить, а можно и по второму разу автоклавировать. Картоночки от бывших перфокарт само то получаются. У картоночки, кстати есть одно неоспоримое достоинство, если ее поширше делаешь, то имеет она два угла стерильных, перевернул и еще одну колонию перенес, то есть в два раза меньше возни со сменой.

petr
Постоянный участник

29.07.2002 15:54

URL #35

Ну, на мой вкус - ничего лучше носов нету, и с пипетки отстреливать легко в помойку :-))))

f1dark
Постоянный участник
Lahore, Punjab, Pakistan

01.10.2022 14:51

URL #36

Ufa1688
Постоянный участник

07.10.2022 20:55

URL #37

In that case the ufabet เข้า สู่ระบบ shooter was said ทางเข้าufa1688 to have erupted after an argument aff 1688 with another soldier over ufa1688 a land-selling commission UFA1688 fee. In this case, the motive ราคาบอล is unclear but after terrorizing สล็อตออนไลน์ the childcare center, Panya Kamrab ลิงค์รับทรัพย์ a 34-year-old former policeman drove แฮนดิแคป home and shot his wife and child บอลสเต็บ before taking his own life.

guest: 123vega
IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ
гость

12.11.2022 12:38

URL #38

A long, beautiful stretch SUPERSLOT เครดิตฟรี of sand in Australia's สล็อต โร มา เว็บตรง tropical far north, Wangetti Beach, was Toyah ทดลองเล่นสล็อตโรม่า Cordingley's favourite beach. It is also where she died, in what ROMA SLOT has been called a "frenzied and brutal and sadistic" attack. SLOT JOKER The 24-year-old had gone to the SLOTXO beach to walk her dog on 21 October 2018, as she เครดิต ฟรี กด รับ เอง 50 บาท had done countless times before, but never came home. The PG SLOT ซื้อฟรีสปิน next morning her father found her "messed up" body half buried in sand dunes. Her JOKER ROMA เว็บตรง beloved dog was tied up nearby, unharmed. Four PG SLOT ทางเข้า years on, Australian authorities are appealing for the public's help in an international hunt to find the man they believe killed Toyah - Rajwinder Singh.

Ufa1688
Постоянный участник

14.03.2023 08:08

URL #39

David Carrick ทาง เข้า ufabet a serial sex offender ufabet vip served in one of Britain’s ทาง เข้า ufabet มือ ถือ most elite armed police units แฮนดิแคป คือ for years. He is now behind bars 123goal but his ability to evade justice nigoal123 has only fueled a growing distrust app aff1688 and anger toward police ปั่นสล็อต in the United Kingdom. CNN has เกมสล็อต investigated how failures may have prevented สูตรสล็อต Carrick from being stopped sooner.

Abu Road Escorts
IP-штамп: frQrtJ1xVpdzY
гость

16.03.2023 07:27

URL #40

Ufa1688
Постоянный участник

07.06.2023 21:13

URL #41

Chair umpire ปั่นสล็อต Alexandre Juge issued เกมสล็อต a code violation before grand สูตรสล็อต slam supervisor Wayne ทาง เข้า ufabet McKewen and tournament referee Remy ufabet vip Azemar appeared on Court 14. After ทาง เข้า ufabet มือ ถือ discussions between แฮนดิแคป คือ the officials and the 123goal players, it was announced nigoal123 Kato and Sutjiadi had been app aff1688 defaulted.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.