molbiol.ru -> XChIP - ошибка метода

> All forums > Subject forums > Molecular and cellular biology

Molbiol.ru \| Project \| Protocols \| Programs \| Literature Web \| Companies \| Marketplace \| Labor exchange Rules FAQ* Search* Members* Calendar* Закладки* Selected forums* Today's active topics [ Log In* \| Register* ] Forum:

* XChIP - ошибка метода

Topic related to: ChIP
Topic Curators:* Sergey S
Options: I want to be curator* · Track this topic* · Email this topic · Print this topic*
Topic view:* Outline · [ Standard ] · Linear+

Lyubov

19.08.2004 19:28

URL #1

Уважаемые коллеги!
Ставлю XChIP (хроматин-иммунопреципитацию) и вижу, что результаты нескольких одинаковых экспериментов с одними и теми же антителами довольно сильно отличаются друг от друга (в 2-4 раза). Это нормально? И как добиться воспроизводимости?
Недавно читала статью, где люди делали хроматин-иммунопрециптацию. Ошибка у них получалась в некоторых случаях около 30%.
Количество ДНК оценивается real-time PCR в процентах от Input.
Спасибо.

Sergey S
Member
Москва

20.08.2004 00:29

URL #2

Вы простой ChIP делаете? С формальдегидной фиксацией?
Тогда вопрос для начала - у Вас всё стандартизовано? И имею в виду время фиксации, условия озвучивания, соотношение количество антител/количество хроматина. И что Вы, если не секрет, смотрите: распределение связывания Вашего белка по району или просто связывается - не связывается? И как оцениваете количество ДНК после чипа и концентрацию ДНК в инпуте?

Sergey S
Member
Москва

20.08.2004 00:32

URL #3

Да, ещё один вопрос: как Вы получаете хроматин? Просто фиксация, лизис, озвучивание и сразу чип? Или же у Вас там какие-то дополнительные шаги есть?

Lyubov

20.08.2004 12:10

URL #4

Да, я делаю ChIP с формальдегидной фиксацией.
Время фиксации, условия озвучивания и соотношение кол. антител/кол. хроматина одинаковы во всех экспериментах.
Цель эксперимента - определить количество данного белка, связавшегося с данным участком ДНК путем определения количества ДНК, которое этот белок вытягивает в IP-эксперименте. Т.е. в данном случае связывается-не связывается. Количество ДНК после IP и в Input определяю при помощи real-time PCR, Input (ДНК из такого же объема "озвученного" хроматина, что берется и на IP) при этом разводится в 10 раз и в PCR берется тот же объем, что и ДНК из IP.
Хроматин получаю по стандартной схеме: фиксация, лизис, озвучивание, преклин, а потом IP.

Sergey S
Member
Москва

20.08.2004 14:24

URL #5

ОК, тогда другой вопрос: как Вы считаете обогащение? Простое соотношение IP/input для одного участка. Или амплифицируете ещё какой-то референсный (скажем так) участок? И учитываете ли Вы контроль без антител (нормальную сыворотку)?

Lyubov

20.08.2004 15:18

URL #6

Да, в качестве контроля используется IP без антител.
Относительно этого контроля как раз и определяется обогащение. А отношение ДНК IP/Input используется для того, чтобы можно было сравнивать данные, полученные, например, для клеток до и после теплового шока для одного и того же белка. И чтобы снять естественные различия в количестве клеток, используемых для IP от эксперимента к эксперименту.

Sergey S
Member
Москва

20.08.2004 16:03

URL #7

Определять обогащение относительно -Ab - по моему, не лучшая система. Как показывает практика, уровень "мусора", который Вы получаете в этом контроле может варьировать в разных экспериментах. Не так уж и важно, что он не очень высок. Например, в условных еденицах: в опыте Вы получаете 40 таргетных молекул ДНК, а в -Ab от 2х до 4х. НО: 40/2=20, а 40/4=10. Вот Вам и два раза разницы

Что бы я делал:
1. Важнейший момент, как мне кажется, найти "референсную" последовательность. Я имею в виду какой-либо участок ДНК, где Ваш белок точно НЕ связывается. В таком случае Вы считаете обогащение как IPтаргет/IPреференс, т.е. отношение количества "таргетной" последовательности (которую Вы исследуете) к количеству "референсной" в Вашем IP.
2. То же самое Вы делаете для Input. Это нужно для того, чтобы понять, каково должно быть данное соотношение в норме (тут учитывается и реальное соотношение и эффективность ПЦР для каждой пары праймеров).
3. Амплифицируете эти фрагменты в -Ab контроле. Думается мне, что их соотношение считать не стоит (оно должно быть такое же как и в Input), но перед расчётом соотношения для Вашего чипа из концетрации таргетной последовательности в чипе отнимаете её же концентрацию в -Ab. То же самое для "референсной" последовательности.
Думаю, что уже довольно сильно Вас загрузил

В следующем посте см. расчёт для примера.

Sergey S
Member
Москва

20.08.2004 16:17

URL #8

Итак, после риал-тайма Вы получаете:
таргет референс
Input 100 80
Ip 40 13
-Ab 5 3

Следовательно, для инпута: 100/80=1.25
Для IP: (40 - 5)/(13-3)=3.5
Обогащение: 3.5/1.25=2.8
Естественн, для риал-тайма это нужно как-то адаптировать для дельта Ст, но это не кажется мне особо сложным

Могу сказать, что некоторые продвинутые люди разбавляют Input точно до концетрации ДНК в IP (тотальной ДНК, естественно). Но для этого нужно: очень чувствительный краситель - даже не SYBR Green, а Pico Green (тот же Molecular Probes); PlateReader (хотя можно и по другому как-то, наверное).
И ещё хочу заметить, что если у Вас разница в количестве клеток между опытами достаточно велика, то это уже не означает, что условия стандартизованы

Удачи. Если ещё чего - спрашивайте.

Lyubov

23.08.2004 11:39

URL #9

Спасибо.

Sergey S
Member
Москва

23.08.2004 15:50

URL #10

Пожалуйста. Обращайтесь

a11
moderator
Лондон, UK

23.08.2004 20:33

URL #11

>Но для этого нужно: очень чувствительный краситель - даже не >SYBR Green, а Pico Green (тот же Molecular Probes).

мне всегда казалось, что это одно и то же

но мб, я не прав.

а ко всему остальному полностью присоединяюсь: если позволяет експеримент, лучше стандартизовать не только по input, но и какой-нибудь контрольной последовательности.
А если нормализуете только по input, то очень точно мерить концентрацию.

кстати, в скольких повторностях Вы проводите real-time PCR? я бы посоветовал не менее двух на той же плашке.

[Текст переведён с транслита]

Sergey S
Member
Москва

24.08.2004 00:57

URL #12

2 а11:
Мне почему-то запало в память, что между этими двумя красителями есть какая-то разница в чувствительности. Но вполне возможно, что это был пико грин и какой-то ещё краситель

Nameless
Advanced Member
CA

06.06.2008 00:25

URL #13

Есть еще масса технических мелочей, которые могут повлиять на чистоту и воспроизводимость.

1. В некоторых случаях после обработки жизнеспособность клеток, например, падает и при одинаковых условиях трансфекции и инкубирования в разных пробах количество материала будет отличаться. Это нужно учитывать при соницировании, так как лизаты разной плотности порубятся немного по-разному (что, в общем-то, будет видно на форезе). Я обычно меряю OD600 и развожу лизаты лизис-буфером до примерно одной плотности перед соницированием. Это может немного улучшить вариации в input.

2. Очень важно выровнять количествого вносимого в IP лизата в разных пробах. Я выравниваю по OD280, потом еще обычно гоню PAAG и проверяю уровень белка, за который буду тащить.

3. Не добавляйте к разным пробам антитело из разных аликвот, они могли раскапываться, храниться и использоваться другими людьми совершенно по-разному, даже если стоят в одной коробке и подписаны одинаково! Если нужно - смешайте несколько аликвот отдельно, всё должно быть максимально одинаково для каждой пробы. То же справедливо и для разных аликвот сефарозы, буферов и всех остальных реагентов.

4. Можно купить уже забитые BSA и salmon DNA бидсы, поверьте, большая цена оправдывается воспроизводимостью. Так намного надежнее, чем каждый раз готовить их самим.

5. Растворённые в лизис-буфере сефарозные бидсы начинают формировать осадок уже после нескольких секунд если их оставить на льду, таким образом если их не перемешивать перед каждым внесением, вы внесете разное их количество в пробы. Достаточно перед каждым добавлением перевернуть пробирку с растворенными бидсами пару раз. Не забываем отрезать кончики носиков и смочить носик перед раскапыванием чтобы избежать ошибки в первом внесении.

6. Удобно отсасывать супернатант при промывках шприцом, промывая его каждый раз водой - экономится масса носиков. Я использую один и тот же шприц несколько раз, после каждого эксперимента промываю несколько раз водой и спиртом.

7. При отборе супернатанта (стадия промывки) очень легко захватить часть бидсов, и эта часть естественно будет разной в разных пробах, что приведет к искажению данных. Я обычно не отсасываю супернатант до конца, оставляю около 40-50 мкл чтобы мениск жидкости был немного, но заметно выше уровня осадка, полностью отбираю только после последней промывки.

8. Eще маленький хинт. Скажем, у вас 20 проб, вы их открутили, берете по одной, отсасываете супернатант и добавляете следующий промывочный буфер. Пока вы дойдете до 20 пробы, бидсы там немного диффундируют, так как осадок неплотный, и их отберётся вместе с супернатантом немного больше, чем из первой пробы. Соответственно если пробы стоят вперемешку и первая - IP с антителом А, лизат из необработанных клеток, в ней останется чуть больше связанного материала, чем в пробе 20 - IP с тем же антителом, лизат из обработанных клеток. Поэтому я группирую пробы по антителам чтобы стояли в центрифуге рядом и таким образом временной промежуток внутри бетча был небольшим.

9. Помните, что input, который вы обрабатываете параллельно с остальными пробами, содержит в сотни раз больше целевой DNA и им очень легко контаминировать IP-шные пробы. Микрокапельки могут попасть в соседние открытые пробирки во время открывания эппендорфа и добавления буферов. Обрабатывайте эти пробы отдельно от IP-шных, ставьте во время всех манипуляций подальше, лучше - вообще в разные штативы, меняйте или протирайте перчатки. Так же будьте осторожны в самом конце, если используете колоночные киты для очистки PCR, так как колонки у некоторых из них без крышек.

10. Я бы всё же советовал использовать не осаждение спиртом, а колоночные киты для очистки PCR. Обычно перед тем как вносить пробы центрифугирую колонки с небольшим количеством ТЕ (или H2O, в чем там у вас будет растворена DNA на последнем этапе) для равномерного смачивания.

11. Заказал себе по небольшой банке воды и всех солей для буферов ultrapure и nuclease-free, держу отдельно, использую только для CHIP, плюс использую только nuclease-free носики с фильтрами. Чего и Вам советую.

Естественно, всё вышесказанное - исключительно IMHO, мои наблюдения и умозаключения, на правильность, полноту и критичность всех приведенных моментов ни в коей мере не претендую. Может такие осторожности уже граничат с паранойей, но лично я думаю, что работая с таким трудоёмким и многостадийным, а главное - очень чувствительным и капризным методом, лучше дуть на воду не один раз, а десять. По-моему каждая из этих мелочей может дать незначительную погрешность, но в сумме - значительную ошибку интерпретации данных.

Надеюсь, кому-нибудь это сможет пригодиться.

#
Думал, попадет в "методы", а не в форум, ну да ладно.

This post has been edited by Nameless: 06.06.2008 00:35

mrotzek
Advanced Member

06.06.2008 08:52

URL #14

http://www.superarray.com/chipqpcr_product...001C(-)01A.html

mrotzek
Advanced Member

06.06.2008 09:40

URL #15

формальдегид не очень специфичный кросслинкер так как хорошо
пришивает белок к белку . Может "замаскировать" ваш белок другим или
пришить ваш белок через другой который реалъно сидит на ДНК.
http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender...36&blobtype=pdf

Guest1
Advanced Member

11.06.2008 09:16

URL #16

(Lyubov @ 19.08.2004 19:28)

Уважаемые коллеги!
Ставлю ХЧИП (хроматин-иммунопреципитацию) и вижу, что результаты нескольких одинаковых экспериментов с одними и теми же антителами довольно сильно отличаются друг от друга (в 2-4 раза). Это нормально? И как добиться воспроизводимости?
Недавно читала статью, где люди делали хроматин-иммунопрециптацию. Ошибка у них получалась в некоторых случаях около 30%.
Количество ДНК оценивается реал-тиме ПЦР в процентах от Инпут.
Спасибо.

Добавляя к живым клеткам формалин на 15-30 минут !!!!!!!!
человек , как минимум , должен находится в здравом уме

Nameless
Advanced Member
CA

14.06.2008 10:48

URL #17

Есть ещё одна параноидальная идея.

Для двух одинаковых проб 1 и 2 должно быть верно:
F1=F2
F1=signal1=E_probe1/E(1/100)_probe1
F2=signal2=E_probe2/E(1/100)_probe2
E - сигнал на выделенной ДНК
E(1/100) - сигнал на контрольной фракции

Далее:
E(сигнал на выделенной ДНК)=w*D(кол-во связанной ДНК)
D(кол-во связанной ДНК)=x*P(кол-во связанного целевого белка)
P(кол-во связанного целевого белка)=y*A(кол-во связанного антитела)
A(кол-во связанного антитела)=z*S(кол-во бидсов в пробе)
w,x,y,z-experimental constants.

E=w*x*y*z*S

При прочих равных условиях w,x,y,z-const
и для двух одинаковых проб E1/E2=S1/S2

То есть величина сигнала в двух одинаковых пробах после всех этапов CHIP зависит от кол-ва оставшихся в каждой пробе бидсов. На самом деле, конечно, есть ещё масса других факторов, но по-моему этот нужно учитывать как обязательную экспериментальную ошибку, которая тем более никем обычно не учитывается. Потери бидсов, похоже, избежать практически невозможно, особенно при отборе супернатанта после последней промывки. Если вы случайно отберёте из одной пробы супернатант так, что там останется на 10% меньше бидсов, вы получите соответствующую ошибку. Конечно, при повторах эксперимента ситуация прояснится, но зачем изначально работать в условиях, дающих разбросы при повторах, если есть ещё много всего что может повлиять на результат? Можно так же дуплицировать пробы, но это очень дорогое удовольствие, особенно если используется много условий и антител.

Я предлагаю делать контроль на оставшееся после всех промывок кол-во бидсов в пробах, исходя из того, что количество связанной ДНК прямо пропорционально. Так думаю, что после crosslink resolving и перед добавлением протеазы можно взять по 10-20 мкл каждой пробы, кинуть на блот и обработать вторичными к использованному антителу. Думаю, они поднимут и первичное, и белок с бидсов. Продукт можно квантифицировать и использовать для нормализации вариаций сигнала для разных проб, вызванной вариацией условий эксперимента.

Что думаете?

Собираюсь на днях попробовать, если получится - повешу картинку.

Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest

16.06.2008 14:45

URL #18

(Nameless @ 14.06.2008 09:48)

Есть ещё одна параноидальная идея.

Для двух одинаковых проб 1 и 2 должно быть верно:
Ф1=Ф2
Ф1=сигнал1=Е_пробе1Е(1/100)_пробе1
Ф2=сигнал2=Е_пробе2Е(1/100)_пробе2
Е - сигнал на выделенной ДНК
Е(1/100) - сигнал на контрольной фракции

Далее:
Е(сигнал на выделенной ДНК)=щ*Д(кол-во связанной ДНК)
Д(кол-во связанной ДНК)=х*П(кол-во связанного целевого белка)
П(кол-во связанного целевого белка)=ы*А(кол-во связанного антитела)
А(кол-во связанного антитела)=з*С(кол-во бидсов в пробе)
щ,х,ы,з-ехпериментал цонстантс.

Е=щ*х*ы*з*С

При прочих равных условиях щ,х,ы,з-цонст
и для двух одинаковых проб Е1Е2=С1/С2

То есть величина сигнала в двух одинаковых пробах после всех этапов ЧИП зависит от кол-ва оставшихся в каждой пробе бидсов. На самом деле, конечно, есть ещё масса других факторов, но по-моему этот нужно учитывать как обязательную экспериментальную ошибку, которая тем более никем обычно не учитывается. Потери бидсов, похоже, избежать практически невозможно, особенно при отборе супернатанта после последней промывки. Если вы случайно отберёте из одной пробы супернатант так, что там останется на 10% меньше бидсов, вы получите соответствующую ошибку. Конечно, при повторах эксперимента ситуация прояснится, но зачем изначально работать в условиях, дающих разбросы при повторах, если есть ещё много всего что может повлиять на результат? Можно так же дуплицировать пробы, но это очень дорогое удовольствие, особенно если используется много условий и антител.

Я предлагаю делать контроль на оставшееся после всех промывок кол-во бидсов в пробах, исходя из того, что количество связанной ДНК прямо пропорционально. Так думаю, что после цросслинк ресолвинг и перед добавлением протеазы можно взять по 10-20 мкл каждой пробы, кинуть на блот и обработать вторичными к использованному антителу. Думаю, они поднимут и первичное, и белок с бидсов. Продукт можно квантифицировать и использовать для нормализации вариаций сигнала для разных проб, вызванной вариацией условий эксперимента.

Что думаете?

Собираюсь на днях попробовать, если получится - повешу картинку.

Думаю сделать чипсек и послать чип-реалтайм-пцр нафиг

1: Science. 2007 Jun 8;316(5830):1497-502.

Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.
Johnson DS, Mortazavi A, Myers RM, Wold B.

Department of Genetics, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, 94305-5120, USA.

In vivo protein-DNA interactions connect each transcription factor with its direct targets to form a gene network scaffold. To map these protein-DNA interactions comprehensively across entire mammalian genomes, we developed a large-scale chromatin immunoprecipitation assay (ChIPSeq) based on direct ultrahigh-throughput DNA sequencing. This sequence census method was then used to map in vivo binding of the neuron-restrictive silencer factor (NRSF; also known as REST, for repressor element-1 silencing transcription factor) to 1946 locations in the human genome. The data display sharp resolution of binding position [+/-50 base pairs (bp)], which facilitated our finding motifs and allowed us to identify noncanonical NRSF-binding motifs. These ChIPSeq data also have high sensitivity and specificity [ROC (receiver operator characteristic) area >/= 0.96] and statistical confidence (P <10(-4)), properties that were important for inferring new candidate interactions. These include key transcription factors in the gene network that regulates pancreatic islet cell development.

Nameless
Advanced Member
CA

16.06.2008 21:01

URL #19

Ну там ведь пишут про вариант chip-chip a не chip, с его помощью решаются другие задачи.

This post has been edited by Nameless: 16.06.2008 21:07

Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest

17.06.2008 08:03

URL #20

(Nameless @ 16.06.2008 20:01)

Ну там ведь пишут про вариант чип-чип а не чип, с его помощью решаются другие задачи.

Там пишут не про вариант чип-чип , который нафиг никому не нужен ,
а про чип-библиотека из 20 миллионов "клонов" и сиквенс этой библиотеки
Иллуминой-Солексой

http://seq.molbiol.ru/

Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest

17.06.2008 08:08

URL #21

(Nameless @ 16.06.2008 20:01)

Ну там ведь пишут про вариант чип-чип а не чип, с его помощью решаются другие задачи.

Чип-чипам наступил полный, окончательный и бесповоротный КАБЗЕЦ

Nameless
Advanced Member
CA

18.06.2008 08:21

URL #22

Не, я лучше буду чип-чипить по старинке. По-моему, эрреям всех видов нужно доверять с большой опаской.
Да и всё равно, это ведь не количественный метод. Если, скажем, нужно определить, как изменяется связывание транскрипционного фактора с ДНК при разных условиях, сделать это более-менее количественно можно только с помощью стандартного чип. Так что от чип-реалтайм-пцр не уйдешь

Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest

18.06.2008 08:43

URL #23

(Nameless @ 18.06.2008 07:21)

"Чип-чипить" (ChIP-on-chip) - это как раз с применением тиллинг чипов от Нимблгена (Роша) или
Аффи. Сиквенс кДНК библиотек - САГЕ - "золотой количественный стандарт" в
отличие от реал-тайм ПЦР . Насколько "количествен" реал-тайм ПЦР - "бабка надвое
сказала"

Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest

18.06.2008 09:03

URL #24

(Nameless @ 18.06.2008 07:21)

: Methods Mol Biol. 2007;406:365-86.Links
Reaping the Benefits of SAGE.
Robinson SJ, Guenther JD, Lewis CT, Links MG, Parkin IA.

Serial analysis of gene expression (SAGE) is a powerful technique which yields a digital measure of gene expression through the sequencing of libraries of specific mRNA-derived fragments, namely SAGE tags. This chapter introduces the methods and software tools that are available for researchers to analyze gene expression through SAGE analysis. A detailed examination of SAGE analysis in Arabidopsis thaliana using the publicly available analysis tool, SaskSAGE, is provided. The use of this software allows the user to maximize the information gained from SAGE experiments in a model system with a fully sequenced genome.

Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest

18.06.2008 09:12

URL #25

(Nameless @ 18.06.2008 07:21)

Ну канечно - берем в качестве "негативного" контроля реалтайм участок без байндинг
сайта и имеем офигенный сигнал

итак 10-20 "негативных" контролей

Guest
IP-stamp: frDQwa9k7riYg
guest

15.07.2008 13:52

URL #26

скажите пожалуста где можно в москве заказать микрочипы на геном человека?

Guest
IP-stamp: fr45uHVgO7WZ2
guest

15.07.2008 14:21

URL #27

(Гость @ 15.07.2008 12:52)

скажите пожалуста где можно в москве заказать микрочипы на геном человека?

IP-штамп: frDQwa9k7riYg
гость

прочитанное сообщение 18.07.2005 13:56 Сообщение для модератора Сообщение для куратора темы
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей URL #1 множественное цитирование
картинка: biotech_27970.gifКомпания Хеликон является производителем и дистрибьютором оборудования, рективов и расходных материалов для молекулярной биологии и клинической
диагностики. Хеликон представляет в России продукцию такие компаний,
как
Eppendorf, Bio-Rad, Labconco, BioSan
Fermentas, Amresco, Invitrogen
SSI, Bioplastics, Omnitip, Unitip
/ Фирмы, #27970 /
119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, дом 1, строение 40
Тел.: +7 495 933 2736
Факс: +7 495 930 00 84
E-mail: mail@helicon.ru
Веб-адрес: http://www.helicon.ru
Специализация: Весы, Электроды, pH-метры, Кондуктометры, Обор. для Электрофореза, Источники тока, ПЦР и Реал-тайм ПЦР машины, Анализ Изображений, Видео, Фотографическая техника, Обор. для детекции Флуоресценции и Люминесценции, Спектрофотометры, Спектрометры, Другое измерительное оборудование, Автоматические пипетки, Диспенсеры, Центрифуги, Холодильники, Морозильники, Оборудование для хранения, Обор. для Очистки воды, Тяги, Ламинары, Чистые помещения, Водянные бани, Инкубаторы для Бактерий и Клеток, Шейкеры, Гибридиз. камеры, Термостаты, Мешалки, Трансиллюминаторы, Кросслинкеры, Источники УФ, Электропораторы, Упариватели, Вакуумное оборудование, Насосы, Другое НЕизмерительное оборудование, Хим. реактивы, Ферменты и Киты для мол. биологии, Реактивы для работ с Культурами Клеток, Среды (Клеточные, Бактериальные и др.), Маркеры (ДНК, РНК, белки), Пластик, Пробирки, Пипетки, Другие расходные материалы
География деятельности: Россия

Сообщение было отредактировано Helicon - 30.07.2007 15:52

Guest
IP-stamp: frDQwa9k7riYg
guest

27.10.2008 16:45

URL #28

>>>добавить "блокированную" БСА протеин-А-сефарозу

подскажите пожалуйста как делать эту блокировку?
либо ссылку на протокол

chatter
Member

27.10.2008 18:54

URL #29

(Гость @ 27.10.2008 16:45)

заливаете биды пятикратным объемом буфера и на мешалку овернайт +4С с 5% БСА, утром отмыть тем же буфером 3-5 раз (в зависимости от лени)

This post has been edited by chatter: 27.10.2008 18:55