Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Ингибирование ПЦР реактивами из выделенной ДНК
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 03.10.2019 11:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день, коллеги. У меня возникла ситуация, очень тормозящая работу.
Имеется выделенная из тканей животного ДНК наборами от компании Синтол. Сразу после выделения ставилась ПЦР на один ген. С обычным протоколом ген не шел, приходилось к стандартному буферу добавлять магний, но тогда отжигалась еще и неспицифика. После рестрикции, в принципе, результат был читабельный, что и было необходимо. На радостях я поставила сразу 40 проб. Итог-7 из 40 проб отожглись, остальные-тишина. Поставила второй ген-тишина. 3 недели пыталась выявить, что не работает. Поставила с мастер-миксами-то отжигалось, то нет. в итоге взяла 5 проб, выделенных из крови фенольным методом-отжигается... В связи с этим у меня вопрос: что может быть такого в Днк, что так тотально ингибирует реакцию? и В ДНК ли дело?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 12:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Ну во первых! Какое животный, какой ткань. Во вторых ссылка на конкретный набор, с которым выделяли. По тому что вы описываете похоже на ЭДТА, но это далеко не факт. И в третьих ну почему не начать со звонка синтолу. Пусть тот чей набор, сам и разбирается со своей продукцией.

А фенольный метод я люблю, очень.

Сообщение было отредактировано MMM - 03.10.2019 12:26
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 03.10.2019 12:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(MMM @ 03.10.2019 13:24)
Ссылка на исходное сообщение  Ну во первых! Какое животный, какой ткань. Во вторых ссылка на конкретный набор, с которым выделяли. По тому что вы описываете похоже на ЭДТА, но это далеко не факт. И в третьих ну почему не начать со звонка синтолу. Пусть тот чей набор, сам и разбирается со своей продукцией.

А фенольный метод я люблю, очень.


Животное-овцы, ткань-ушной выщип. Набор для выделения ДНК из тканей "Экстран-2". В Синтол я писала с просьбой указать хотя бы приблизительные компоненты набора и спросила о гарантии хранения ДНК после выделения в заморозке. Состав набора озвучить мне отказались мотивируя коммерческой тайной, о сроке хранения написали "Что некоторые пробы у нас хранятся по несколько лет вполне успешно". С нового года планирую перейти или на фенол или солевой экстракции.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 14:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(Настя14145 @ 03.10.2019 13:29)
Ссылка на исходное сообщение  Состав набора озвучить мне отказались мотивируя коммерческой тайной

Вы перед производителем набора совершенно не правильно ставите вопрос. Вам не про состав его надо спрашивать. Вам надо сказать что после фенола ПЦР идет и фрагмент накапливается, а после их набора нифига не идёт. Вопрос: что мне сделать с выделенной пробой, что бы все заработало.

Смотрите. У вас исходный материал содержит Хондроитин сульфат, который может ингибировать реакцию и при этом плохо отделяется от ДНК стандартными методами.
Это одна из возможных причин.

Второй вопрос вы ДНК на форезе перед ПЦР гоняет или ее там так мало, что на форезе ничего не видно. Это к чему вопрос у вас с фенолом выход ДНК выше или ниже в сравнении с синтольским протоколом?

В любом случае самый первый и простой ход, это просто разбавить пробу раз в 10- 25
Второй ход переосадить и промыть спиртом осадок ДНК после последнего буфера синтола. Синтольный же протокол он же на силикагеле построен. Я правильно понял? И ДНК смывается в буфер с сорбента на последней стадии. Вот из этого раствора и надо попробовать переосадить ДНК по классике, не забывая добавить соль ацетата перед добавлением спирта.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Настя14145
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 14:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(MMM @ 03.10.2019 12:05)
Ссылка на исходное сообщение  
У вас исходный материал содержит Хондроитин сульфат, который может ингибировать реакцию и при этом плохо отделяется от ДНК стандартными методами.

МММ, а можно вопросик, чтобы темы не плодить?
как по вашему, насколько будет загрязняться полисахаридами препарат РНК/ДНК дрожжей при ацетатном осаждении? и насколько сложно эти полисахариды отделить?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 15:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Некорректный вопрос. Как туда и в каком количестве и какие полисахариды попали?
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 03.10.2019 15:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(MMM @ 03.10.2019 15:05)
Ссылка на исходное сообщение  Вы перед производителем набора совершенно не правильно ставите вопрос. Вам не про состав его надо спрашивать. Вам надо сказать что после фенола ПЦР идет и фрагмент накапливается, а после их набора нифига не идёт. Вопрос: что мне сделать с выделенной пробой, что бы все заработало.

Смотрите. У вас исходный материал содержит Хондроитин сульфат, который может ингибировать реакцию и при этом плохо отделяется от ДНК стандартными методами.
Это одна из возможных причин.

Второй вопрос вы ДНК на форезе перед ПЦР гоняет или ее там так мало, что на форезе ничего не видно. Это к чему вопрос у вас с фенолом выход ДНК выше или ниже в сравнении с синтольским протоколом?

В любом случае самый первый и простой ход, это просто разбавить пробу раз в 10- 25
Второй ход переосадить и промыть спиртом осадок ДНК после последнего буфера синтола. Синтольный же протокол он же на силикагеле построен. Я правильно понял? И ДНК смывается в буфер с сорбента на последней стадии. Вот из этого раствора и надо попробовать переосадить ДНК по классике, не забывая добавить соль ацетата перед добавлением спирта.


Спасибо за советы. После выделения ДНК я обязательно прогоняю ее на форезе. Материал светился отлично, оно и логично. выделенные фенолом пробы светились тоже хорошо, но не так ярко. Такую концентрированную ДНК я обязательно разбавляю в 10. На ней вот первые несколько десятков шли отлично. После того, как идти перестало, я перепроверила ДНК-свечение было таким же хорошим, но внизу появился шмер 9я так понимаю, грязь). Вчероа мы переосадили заново пробы, хорошенько отмыли, разбавили снова. Сегодня прошли по 1 гену все пробы, по второму все равно не идет, но полагаю, проблема в концентрации магния, в прошлый раз таким образом решилась проблема. А так, да, я планирую перейти на другой метод выделения ДНК, пока думаю, какой- фенольный или солевой экстракции.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 16:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Ага! Материала много! Фенол ожидаемо дает меньший выход. Разводить есть куда.
Можно делать серию разведений матрицы, а заодно и магний подвинуть. Хотя по моим понятиям Mg двигать в вашем несчастье не правильно.
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 03.10.2019 16:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(MMM @ 03.10.2019 17:41)
Ссылка на исходное сообщение  Ага! Материала много! Фенол ожидаемо дает меньший выход. Разводить есть куда.
Можно делать серию разведений матрицы, а заодно и магний подвинуть. Хотя по моим понятиям Mg двигать в вашем несчастье не правильно.


К сожалению, магний двигать придется, потому что со стандартным буфером, в котором конечная конц. 1,5 mM эти праймеры не отжигаются. Поэтому вынуждена добавлять го, чтобы наработалось хоть что-то. Просто в итоге, неспецифика ожидаемо начинает лезть на повышенной концентрации, увы.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 19:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(MMM @ 03.10.2019 13:02)
Ссылка на исходное сообщение  Некорректный вопрос. Как туда и в каком количестве и какие полисахариды попали?

думаю, что из клеточной стенки после обработки зимолиазой.
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 23:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Настя14145 @ 03.10.2019 17:53)
Ссылка на исходное сообщение  К сожалению, магний двигать придется, потому что со стандартным буфером, в котором конечная конц. 1,5 mM эти праймеры не отжигаются. Поэтому вынуждена добавлять го, чтобы наработалось хоть что-то. Просто в итоге, неспецифика ожидаемо начинает лезть на повышенной концентрации, увы.

Может температуру отжига понизить? Хотя и так и так может вылезть неспецифика. Следующий шаг менять праймеры smile.gif
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.10.2019 23:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(vb @ 03.10.2019 20:20)
Ссылка на исходное сообщение  думаю, что из клеточной стенки после обработки зимолиазой.

Сильно не должно. Отделить трудно. Обычно используют CTAB, но не тот протокол, что на этом сайте.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.10.2019 00:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

А вот просто случайный вопрос , у нас тут студентка выделяет ДНК из Растений со [STAB]-протоколом и вот уже мне интересно зачем там ДНК в конце два раза переосаждают с разными солями ацетата. Первый раз с натрием а второй раз с аммонием.. Зачем такие сложности?

У нас просто нет ацетата аммония ... ну я сказал чтоб заказала и его ... черт его знает , эти танцы с бубном у костра. Вроде как протокол от приличных людей принесла.

И еще , там написано что надо использовать хлороформ с изоамиловым спиртом ... ну 24 к 1 .. А у нас нет этого спирта , других полно а этого вот нет. , только чистый хлороформ есть .. Нужен ли этот спирт там вообще? Чрто это за блажь такя с изоамиловым спиртом хлороформ мешать? Зачем?
Участник оффлайн! Настя14145




 прочитанное сообщение 04.10.2019 09:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(MMM @ 04.10.2019 00:14)
Ссылка на исходное сообщение  Может температуру отжига понизить? Хотя и так и так может вылезть неспецифика. Следующий шаг менять праймеры smile.gif


Праймеры итак уже поменяны, потому что предыдущие тоже то хочу отжигаться, то идите нафиг. Именно этот ген выеживается уже целый год. Насчет температуры я сегодня как раз буду пробовать, потому как не дело, конечно. Вчера поставила на этот ген-еле-еле отжигается даже с контрольными пробами, но магний шмерит безбожно просто.
Участник оффлайн! elektrikvasilij
Участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  08.10.2019 22:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

[

confused.gif
eek.gif confused.gif eek.gif confused.gif
Участник оффлайн! CDT




 прочитанное сообщение 11.10.2019 22:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(MMM @ 03.10.2019 13:24)
Ссылка на исходное сообщение  Ну во первых! Какое животный, какой ткань. Во вторых ссылка на конкретный набор, с которым выделяли. По тому что вы описываете похоже на ЭДТА, но это далеко не факт. И в третьих ну почему не начать со звонка синтолу. Пусть тот чей набор, сам и разбирается со своей продукцией.

А фенольный метод я люблю, очень.

ммм ты пробовал хоть раз выделить ДНК из сушеного гриба Чага wink.gif


Получается Черная ДНК которая нифига не пцрится
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.11.2021 10:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you
https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html
https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk
https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193
https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24
https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk
https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch
https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/
https://devpost.com/watcheshutuk
https://www.ted.com/profiles/26540630/about
https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing
https://ibb.co/hgfZwb0
https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb
https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch
https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/
https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  25.12.2022 10:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

https://ameblo.jp/omegawatches89/entry-12756646005.html
https://omegawatches89.bigcartel.com/produc...s-replica-rolex
https://penzu.com/p/d8b4c076
https://omegawatches89.gumroad.com/p/reason...-are-so-popular
https://omegawatches89.gumroad.com/p/tips-f...replica-watches
https://omegawatches89-95.webselfsite.net/a-propos
https://anotepad.com/notes/2w2d9wgq
https://www.myminifactory.com/stories/reaso...s-6331ca21647d6
https://omegawatches89.seesaa.net/article/490300837.html
https://blog.udn.com/omegawatches89/176226733
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/where...-watches-online
https://wakelet.com/wake/NSGeOdLxkniZ60lTSrkpM
https://telegra.ph/Replica-Watches-Find-Hig...ms-Online-08-03
https://omegawatches89.simplesite.com/452939025
Участник оффлайн! David2350
Участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  04.04.2023 11:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

We aim to decorate your body in a life changing manner - we have many years of experience in tattooing, due to this we are able to carry out any type of tattooing style as you please, to give you an understanding of all the differing tattoo styles Camden tattoo shop

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.04.24 21:29
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft