Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Настя14145 |
Имеется выделенная из тканей животного ДНК наборами от компании Синтол. Сразу после выделения ставилась ПЦР на один ген. С обычным протоколом ген не шел, приходилось к стандартному буферу добавлять магний, но тогда отжигалась еще и неспицифика. После рестрикции, в принципе, результат был читабельный, что и было необходимо. На радостях я поставила сразу 40 проб. Итог-7 из 40 проб отожглись, остальные-тишина. Поставила второй ген-тишина. 3 недели пыталась выявить, что не работает. Поставила с мастер-миксами-то отжигалось, то нет. в итоге взяла 5 проб, выделенных из крови фенольным методом-отжигается... В связи с этим у меня вопрос: что может быть такого в Днк, что так тотально ингибирует реакцию? и В ДНК ли дело? |
MMM Постоянный участник |
А фенольный метод я люблю, очень. Сообщение было отредактировано MMM - 03.10.2019 12:26 |
Настя14145 |
(MMM @ 03.10.2019 13:24) Ну во первых! Какое животный, какой ткань. Во вторых ссылка на конкретный набор, с которым выделяли. По тому что вы описываете похоже на ЭДТА, но это далеко не факт. И в третьих ну почему не начать со звонка синтолу. Пусть тот чей набор, сам и разбирается со своей продукцией. А фенольный метод я люблю, очень. Животное-овцы, ткань-ушной выщип. Набор для выделения ДНК из тканей "Экстран-2". В Синтол я писала с просьбой указать хотя бы приблизительные компоненты набора и спросила о гарантии хранения ДНК после выделения в заморозке. Состав набора озвучить мне отказались мотивируя коммерческой тайной, о сроке хранения написали "Что некоторые пробы у нас хранятся по несколько лет вполне успешно". С нового года планирую перейти или на фенол или солевой экстракции. |
MMM Постоянный участник |
(Настя14145 @ 03.10.2019 13:29) Вы перед производителем набора совершенно не правильно ставите вопрос. Вам не про состав его надо спрашивать. Вам надо сказать что после фенола ПЦР идет и фрагмент накапливается, а после их набора нифига не идёт. Вопрос: что мне сделать с выделенной пробой, что бы все заработало. Смотрите. У вас исходный материал содержит Хондроитин сульфат, который может ингибировать реакцию и при этом плохо отделяется от ДНК стандартными методами. Это одна из возможных причин. Второй вопрос вы ДНК на форезе перед ПЦР гоняет или ее там так мало, что на форезе ничего не видно. Это к чему вопрос у вас с фенолом выход ДНК выше или ниже в сравнении с синтольским протоколом? В любом случае самый первый и простой ход, это просто разбавить пробу раз в 10- 25 Второй ход переосадить и промыть спиртом осадок ДНК после последнего буфера синтола. Синтольный же протокол он же на силикагеле построен. Я правильно понял? И ДНК смывается в буфер с сорбента на последней стадии. Вот из этого раствора и надо попробовать переосадить ДНК по классике, не забывая добавить соль ацетата перед добавлением спирта.
|
vb Постоянный участник |
(MMM @ 03.10.2019 12:05) У вас исходный материал содержит Хондроитин сульфат, который может ингибировать реакцию и при этом плохо отделяется от ДНК стандартными методами. МММ, а можно вопросик, чтобы темы не плодить? как по вашему, насколько будет загрязняться полисахаридами препарат РНК/ДНК дрожжей при ацетатном осаждении? и насколько сложно эти полисахариды отделить? |
MMM Постоянный участник |
|
Настя14145 |
(MMM @ 03.10.2019 15:05) Вы перед производителем набора совершенно не правильно ставите вопрос. Вам не про состав его надо спрашивать. Вам надо сказать что после фенола ПЦР идет и фрагмент накапливается, а после их набора нифига не идёт. Вопрос: что мне сделать с выделенной пробой, что бы все заработало. Смотрите. У вас исходный материал содержит Хондроитин сульфат, который может ингибировать реакцию и при этом плохо отделяется от ДНК стандартными методами. Это одна из возможных причин. Второй вопрос вы ДНК на форезе перед ПЦР гоняет или ее там так мало, что на форезе ничего не видно. Это к чему вопрос у вас с фенолом выход ДНК выше или ниже в сравнении с синтольским протоколом? В любом случае самый первый и простой ход, это просто разбавить пробу раз в 10- 25 Второй ход переосадить и промыть спиртом осадок ДНК после последнего буфера синтола. Синтольный же протокол он же на силикагеле построен. Я правильно понял? И ДНК смывается в буфер с сорбента на последней стадии. Вот из этого раствора и надо попробовать переосадить ДНК по классике, не забывая добавить соль ацетата перед добавлением спирта. Спасибо за советы. После выделения ДНК я обязательно прогоняю ее на форезе. Материал светился отлично, оно и логично. выделенные фенолом пробы светились тоже хорошо, но не так ярко. Такую концентрированную ДНК я обязательно разбавляю в 10. На ней вот первые несколько десятков шли отлично. После того, как идти перестало, я перепроверила ДНК-свечение было таким же хорошим, но внизу появился шмер 9я так понимаю, грязь). Вчероа мы переосадили заново пробы, хорошенько отмыли, разбавили снова. Сегодня прошли по 1 гену все пробы, по второму все равно не идет, но полагаю, проблема в концентрации магния, в прошлый раз таким образом решилась проблема. А так, да, я планирую перейти на другой метод выделения ДНК, пока думаю, какой- фенольный или солевой экстракции. |
MMM Постоянный участник |
Можно делать серию разведений матрицы, а заодно и магний подвинуть. Хотя по моим понятиям Mg двигать в вашем несчастье не правильно. |
Настя14145 |
(MMM @ 03.10.2019 17:41) Ага! Материала много! Фенол ожидаемо дает меньший выход. Разводить есть куда. Можно делать серию разведений матрицы, а заодно и магний подвинуть. Хотя по моим понятиям Mg двигать в вашем несчастье не правильно. К сожалению, магний двигать придется, потому что со стандартным буфером, в котором конечная конц. 1,5 mM эти праймеры не отжигаются. Поэтому вынуждена добавлять го, чтобы наработалось хоть что-то. Просто в итоге, неспецифика ожидаемо начинает лезть на повышенной концентрации, увы. |
vb Постоянный участник |
(MMM @ 03.10.2019 13:02) думаю, что из клеточной стенки после обработки зимолиазой. |
MMM Постоянный участник |
(Настя14145 @ 03.10.2019 17:53) К сожалению, магний двигать придется, потому что со стандартным буфером, в котором конечная конц. 1,5 mM эти праймеры не отжигаются. Поэтому вынуждена добавлять го, чтобы наработалось хоть что-то. Просто в итоге, неспецифика ожидаемо начинает лезть на повышенной концентрации, увы. Может температуру отжига понизить? Хотя и так и так может вылезть неспецифика. Следующий шаг менять праймеры |
MMM Постоянный участник |
(vb @ 03.10.2019 20:20) Сильно не должно. Отделить трудно. Обычно используют CTAB, но не тот протокол, что на этом сайте. |
Asterix Постоянный участник |
У нас просто нет ацетата аммония ... ну я сказал чтоб заказала и его ... черт его знает , эти танцы с бубном у костра. Вроде как протокол от приличных людей принесла. И еще , там написано что надо использовать хлороформ с изоамиловым спиртом ... ну 24 к 1 .. А у нас нет этого спирта , других полно а этого вот нет. , только чистый хлороформ есть .. Нужен ли этот спирт там вообще? Чрто это за блажь такя с изоамиловым спиртом хлороформ мешать? Зачем? |
Настя14145 |
(MMM @ 04.10.2019 00:14) Может температуру отжига понизить? Хотя и так и так может вылезть неспецифика. Следующий шаг менять праймеры Праймеры итак уже поменяны, потому что предыдущие тоже то хочу отжигаться, то идите нафиг. Именно этот ген выеживается уже целый год. Насчет температуры я сегодня как раз буду пробовать, потому как не дело, конечно. Вчера поставила на этот ген-еле-еле отжигается даже с контрольными пробами, но магний шмерит безбожно просто. |
elektrikvasilij Участник |
|
CDT |
(MMM @ 03.10.2019 13:24) Ну во первых! Какое животный, какой ткань. Во вторых ссылка на конкретный набор, с которым выделяли. По тому что вы описываете похоже на ЭДТА, но это далеко не факт. И в третьих ну почему не начать со звонка синтолу. Пусть тот чей набор, сам и разбирается со своей продукцией. А фенольный метод я люблю, очень. ммм ты пробовал хоть раз выделить ДНК из сушеного гриба Чага Получается Черная ДНК которая нифига не пцрится |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
David2350 Участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |