Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Центрифужные колонки -- Повторное использование --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Zmeya




 прочитанное сообщение 09.04.2019 06:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте!

Подскажите пожалуйста, как можно регенерировать колонки для очистки ПЦР-продуктов перед секвенированием?
Пишут много где, что их можно использовать много раз, а конкретно как и чем мыть найти не получается.
Спасибо!
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 09.04.2019 16:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Зачем "регенерировать" одноразовые (!) колонки? Хотите найти проблемы на ровном месте? В них и смысл, что они - одноразовые, чтоб уж точно никакой контаминации не произошло. Ладно ещё если у Вас каждый раз разные продукты - ну, загадите неспецификой (плохо, но не смертельно). Так-то в этих колонках обычный сорбент, как и для выделения ДНКи, т.е. макромолекулы можно смыть горячей водой (+65) в большом объёме. Но проще всё же не искать себе геморроя - переосаждайте ацетатом со спиртом: дешевле не найдёте и качество отличное! Ну, только что руки приложить надо.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 09.04.2019 18:20     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Zmeya, существует столько разных методов очистки ПЦР продуктов перед секвенированием, что задавать подобные вопросы в обществе молбиологов просто неприлично, позорно и возмутительно.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): dk
Участник оффлайн! X34
Участник



 прочитанное сообщение 10.04.2019 16:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(Zmeya @ 09.04.2019 07:53)
Ссылка на исходное сообщение как можно регенерировать колонки для очистки ПЦР-продуктов перед секвенированием?

в совеццкие времена когда колонки были диковинкой заморской замачивали на ночь в 0.1 М солянке, утром пару раз кипятили в большом объеме дистиллята, сушили ночь на 60-ти градусях и радовались жизни раз 10 минимум. потом емкость начинает
снижаться. и не слушайте местных мажоров, если и правда перед сиквенсом то пофиг на одноразовость, а этих если послушать то и на ВЭЖХ надо каждую пробу на новой колонке гнать

Сообщение было отредактировано X34 - 10.04.2019 16:51
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 10.04.2019 19:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Не, ну я тоже застал времена когда и "жёлтые носики" по десять раз промывали и автоклавировали. И сорбент на колонках можно регенерировать. Вот только зачем? Карбоныч совершенно прав - есть множество методов очистки ПЦР-продукта без этих "танцев с бубном". Это сейчас - для сиквенсов, а потом они так же начнут "очищать" вставку для клонирования. В общем, коли нету денег на нормальную молекулярку - нефиг ей и заниматься, чем потом разгрeбать "открытия" после неспецифики. Не надо создавать проблемы на пустом месте, ИМХО.

Сообщение было отредактировано dk - 10.04.2019 19:44
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.04.2019 19:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Если денег нет совсем, то dk прав - действительно, нефиг. Если деньги есть, но мало, то можно и колонки регенерировать, и спиртом осаждать с ПААГ, и дешёвые магносорбенты использовать. Вариантов масса. Успехов! beer.gif
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 10.04.2019 22:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(X34 @ 10.04.2019 14:46)
  в совеццкие времена когда колонки были диковинкой заморской замачивали на ночь в 0.1 М солянке, утром пару раз кипятили в большом объеме дистиллята, сушили ночь на 60-ти градусях и радовались жизни раз 10 минимум. потом емкость начинает
снижаться. и не слушайте местных мажоров, если и правда перед сиквенсом то пофиг на одноразовость, а этих если послушать то и на ВЭЖХ надо каждую пробу на новой колонке гнать

Это какой-то позор! © Да, давайте ещё бумагу туалетную повторно использовать, вот будет экономия!

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): X34
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 11.04.2019 11:34     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Zmeya @ 09.04.2019 07:53)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!

Подскажите пожалуйста, как можно регенерировать колонки для очистки ПЦР-продуктов перед секвенированием?
Пишут много где, что их можно использовать много раз, а конкретно как и чем мыть найти не получается.
Спасибо!

А сколько надо? У меня их наделано... Могу штук 20-30 подарить.
Пишите в личку.
Участник оффлайн! X34
Участник



 прочитанное сообщение 11.04.2019 15:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(Carbon Copy @ 10.04.2019 23:54)
Ссылка на исходное сообщение  Это какой-то позор! ©
таки да, позор, вы правы. но времена были трудные, и диссер я защищал еще до вашей регистрации на молбиоле и сиквенс ставили с меткой, колонки отмывали по сто раз, полимеразу варили в лабе из конструктов вывезенных из бретании в трусах...выживали. а молодь что беды не знала сильна советы давать по поводу колонок.

Сообщение было отредактировано X34 - 11.04.2019 15:45
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 11.04.2019 16:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Уважаемый! Кто когда и где диссер защищал, замуж выходил, и другие вопросы личной жизни давайте не будем обсуждать. Лучше сфокусируемся на теме топика. На вскидку список методов очистки ПЦР перед секвенированием:
1. Классика - переосаждение спиртом (этанол или изопропанол).
2. Електрофорез и экстракция из геля.
3. Спин-колонки (или 96х спин плашки).
4. Магнитные сорбенты.
5. Обработка ферментами (ExoSAP-IT).
Как всегда в реальной жизни возможна комбинация двух условий из трёх: цена/качество/время. С выбором перечисленных методов (коллеги добавят если что то забыл) можно варьировать в очень широких пределах. И таки да, можно слегка изменять протоколы и экономить. Например, можно разбавить ExoSAP-IT и увеличить время инкубации - работает на ура. Но, то что предлагается топикстартером и поддерживается Вами - безумный геморрой с непредсказуемыми результатами. В качестве офф-топика: не Вы один - эксперт по танцам с бубном. Ваш покорный слуга прошел путь от кипячения "желтых носиков" для повторного использования в российской лабе в 90-х до руководства GMP лабораторией в США, где любое отступление от ISO карается расстрелом. Поэтому поучайте лучше Ваших паучат, но за историю про трусы спасибо. smile.gif

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): X34
Участник оффлайн! X34
Участник



 прочитанное сообщение 11.04.2019 17:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Carbon Copy @ 11.04.2019 17:45)
Ссылка на исходное сообщение  а историю про трусы спасибо. smile.gif

мы еще из-за вашего кардона в 90-х праймеры возили в носках через границу в загибающийся постсовок, кинированные, по 35-60 МБк за раз в одном носке, но в фольгу заворачивали. а если уж мериться хиршами, то вымочите колонку по вышеприведенному протоколу и попробуйте хоть намек на ампликон вытятянуть. да много всяких факторов, порой и деньги есть а сиквенс надо вчера, а так закупки-тендеры и проще и быстрее на коленке. я ж не призываю всех и вся перемывать сингл-юз пласти к и т. д.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 11.04.2019 17:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Закон номер один в любой молекулярной лаборатории - по умолчанию - любые расходники после реакций с ДНК подлежат утилизации! Однократное засирание лабы продуктами амплификации навсегда отобьёт у Вас охоту любых экспериментов по повторному использованию того, что для этого не предназначено. Если Вы - научник, ковыряющийся в своих козявках, никто Вашего прокола возможно не заметит. А если лаба - коммерческое предприятие, работающее в три смены с трёхзначным числом образцов в день, меньшее что с Вами могут сделать - моментально уволить нахер.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.04.2019 23:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

я бы расстрелял. а то уволишь, он в другое место устроится, и снова здорово.... Сорную траву с поля вон!
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.04.2019 08:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Вообще-то, речь шла не о ПЦР, а об очистке ампликонов перед секвенированием.
За что расстреливать?
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.04.2019 08:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

за методологическую гниль. Сегодня сиквенс, завтра ПЦР, если в голове такое, то только декапитация. Вот, вполне себе альтернатиыа расстрелу.
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 12.04.2019 16:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(genseq @ 12.04.2019 06:21)
Ссылка на исходное сообщение  Вообще-то, речь шла не о ПЦР, а об очистке ампликонов перед секвенированием.
За что расстреливать?

Вообще-то методом Сангера секвенируются однонитевые продукты элонгации праймера в dideoxy терминальной реакции. Это не коим образом не ПЦР, равно как секвенируются никоим образом не ампликоны. Не ожидал, genseq, честно говоря от Вас подобной безграмотности. Топикстартер спросил(а) об очистке ПЦР перед секвенированием, то есть матрицы для dideoxy реакции, насколько я понял. С ампликонами в ПЦР лаборатории шутки плохи. И если использовать повторно расходники, загрязнённые продуктами ПЦР, рано или поздно проблем не миновать. К тому же, как уже указывалось, существует столько разных методов очистки ПЦР, что извращаться с регенерированием колонок - тупизна за гранью понимания.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.04.2019 18:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

честно говоря, в 21 веке про это говорить даже не странно, а очень странно. Последний раз задумывался о такой хрени в 92-ом... ТОгда хоть ПЦР толком не было, и типсы, и колонки, как полиэтиленовые пакеты, мыли все, у кого они были. А щас... Далее нецензурно
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  11.11.2021 16:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you
https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html
https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk
https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193
https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24
https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk
https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch
https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/
https://devpost.com/watcheshutuk
https://www.ted.com/profiles/26540630/about
https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing
https://ibb.co/hgfZwb0
https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb
https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch
https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/
https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl
Участник оффлайн! Consuelo
Участник



 прочитанное сообщение 10.12.2021 12:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(Carbon Copy @ 11.04.2019 17:45)
Ссылка на исходное сообщение  
5. Обработка ферментами (ExoSAP-IT).
Как всегда в реальной жизни возможна комбинация двух условий из трёх: цена/качество/время. С выбором перечисленных методов (коллеги добавят если что то забыл) можно варьировать в очень широких пределах. И таки да, можно слегка изменять протоколы и экономить. Например, можно разбавить ExoSAP-IT и увеличить время инкубации - работает на ура.


А можно поподробнее про exosap? MQ разбавляли? Какой протокол после этого? На exosap express ведь тоже сработает? И надо ли вообще менять время инкубации, если по умолчанию 2мкл экзосап + 5 мкл днк, а я планирую развести его вдвое и брать 2мкл разведенного + 2,5мкл днк?

Сообщение было отредактировано Consuelo - 10.12.2021 12:41

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 21:48
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft