Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Zmeya |
Подскажите пожалуйста, как можно регенерировать колонки для очистки ПЦР-продуктов перед секвенированием? Пишут много где, что их можно использовать много раз, а конкретно как и чем мыть найти не получается. Спасибо! |
dk Постоянный участник Россия |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
X34 Участник |
(Zmeya @ 09.04.2019 07:53) в совеццкие времена когда колонки были диковинкой заморской замачивали на ночь в 0.1 М солянке, утром пару раз кипятили в большом объеме дистиллята, сушили ночь на 60-ти градусях и радовались жизни раз 10 минимум. потом емкость начинает снижаться. и не слушайте местных мажоров, если и правда перед сиквенсом то пофиг на одноразовость, а этих если послушать то и на ВЭЖХ надо каждую пробу на новой колонке гнать Сообщение было отредактировано X34 - 10.04.2019 16:51 |
dk Постоянный участник Россия |
Сообщение было отредактировано dk - 10.04.2019 19:44 |
genseq Постоянный участник |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(X34 @ 10.04.2019 14:46) в совеццкие времена когда колонки были диковинкой заморской замачивали на ночь в 0.1 М солянке, утром пару раз кипятили в большом объеме дистиллята, сушили ночь на 60-ти градусях и радовались жизни раз 10 минимум. потом емкость начинает снижаться. и не слушайте местных мажоров, если и правда перед сиквенсом то пофиг на одноразовость, а этих если послушать то и на ВЭЖХ надо каждую пробу на новой колонке гнать Это какой-то позор! © Да, давайте ещё бумагу туалетную повторно использовать, вот будет экономия!
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Zmeya @ 09.04.2019 07:53) Здравствуйте! Подскажите пожалуйста, как можно регенерировать колонки для очистки ПЦР-продуктов перед секвенированием? Пишут много где, что их можно использовать много раз, а конкретно как и чем мыть найти не получается. Спасибо! А сколько надо? У меня их наделано... Могу штук 20-30 подарить. Пишите в личку. |
X34 Участник |
(Carbon Copy @ 10.04.2019 23:54) таки да, позор, вы правы. но времена были трудные, и диссер я защищал еще до вашей регистрации на молбиоле и сиквенс ставили с меткой, колонки отмывали по сто раз, полимеразу варили в лабе из конструктов вывезенных из бретании в трусах...выживали. а молодь что беды не знала сильна советы давать по поводу колонок.Сообщение было отредактировано X34 - 11.04.2019 15:45 |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
1. Классика - переосаждение спиртом (этанол или изопропанол). 2. Електрофорез и экстракция из геля. 3. Спин-колонки (или 96х спин плашки). 4. Магнитные сорбенты. 5. Обработка ферментами (ExoSAP-IT). Как всегда в реальной жизни возможна комбинация двух условий из трёх: цена/качество/время. С выбором перечисленных методов (коллеги добавят если что то забыл) можно варьировать в очень широких пределах. И таки да, можно слегка изменять протоколы и экономить. Например, можно разбавить ExoSAP-IT и увеличить время инкубации - работает на ура. Но, то что предлагается топикстартером и поддерживается Вами - безумный геморрой с непредсказуемыми результатами. В качестве офф-топика: не Вы один - эксперт по танцам с бубном. Ваш покорный слуга прошел путь от кипячения "желтых носиков" для повторного использования в российской лабе в 90-х до руководства GMP лабораторией в США, где любое отступление от ISO карается расстрелом. Поэтому поучайте лучше Ваших паучат, но за историю про трусы спасибо.
|
X34 Участник |
(Carbon Copy @ 11.04.2019 17:45) мы еще из-за вашего кардона в 90-х праймеры возили в носках через границу в загибающийся постсовок, кинированные, по 35-60 МБк за раз в одном носке, но в фольгу заворачивали. а если уж мериться хиршами, то вымочите колонку по вышеприведенному протоколу и попробуйте хоть намек на ампликон вытятянуть. да много всяких факторов, порой и деньги есть а сиквенс надо вчера, а так закупки-тендеры и проще и быстрее на коленке. я ж не призываю всех и вся перемывать сингл-юз пласти к и т. д. |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
|
R-J-Dio Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
За что расстреливать? |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(genseq @ 12.04.2019 06:21) Вообще-то методом Сангера секвенируются однонитевые продукты элонгации праймера в dideoxy терминальной реакции. Это не коим образом не ПЦР, равно как секвенируются никоим образом не ампликоны. Не ожидал, genseq, честно говоря от Вас подобной безграмотности. Топикстартер спросил(а) об очистке ПЦР перед секвенированием, то есть матрицы для dideoxy реакции, насколько я понял. С ампликонами в ПЦР лаборатории шутки плохи. И если использовать повторно расходники, загрязнённые продуктами ПЦР, рано или поздно проблем не миновать. К тому же, как уже указывалось, существует столько разных методов очистки ПЦР, что извращаться с регенерированием колонок - тупизна за гранью понимания. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
Consuelo Участник |
(Carbon Copy @ 11.04.2019 17:45) 5. Обработка ферментами (ExoSAP-IT). Как всегда в реальной жизни возможна комбинация двух условий из трёх: цена/качество/время. С выбором перечисленных методов (коллеги добавят если что то забыл) можно варьировать в очень широких пределах. И таки да, можно слегка изменять протоколы и экономить. Например, можно разбавить ExoSAP-IT и увеличить время инкубации - работает на ура. А можно поподробнее про exosap? MQ разбавляли? Какой протокол после этого? На exosap express ведь тоже сработает? И надо ли вообще менять время инкубации, если по умолчанию 2мкл экзосап + 5 мкл днк, а я планирую развести его вдвое и брать 2мкл разведенного + 2,5мкл днк? Сообщение было отредактировано Consuelo - 10.12.2021 12:41 |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |