Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
AmeliRain |
|
MMM Постоянный участник |
Если не травится(не остается следов от тризола), то можно просто пипетированием тризола клетки смыть, должны слезть чулком.(но мне почему-то кажется, что травится) Если травится, сделайте лизирующий раствор 10мМ ЭДТА и 4-5М ГТЦ или Гуанидинийхлорид(можно, но не обязательно, добавить 1/100V третьего раствора для выделения плазмид). Клетки слезут на раз. И прямо в этот буфер тризол. 3-4 части тризола на 1 ч раствора. На лунку наверное хватит 200-300мкл лизирующего раствора. А Можете, если не лень, снять клетки трипсин/версеном и отмыть в БСА(или средой) и PBS, потом фугануть на 600-1000g и в осадок долбануть тризол. Тризола в этом случае можно меньше брать 300-400мкл на лунку. Откручивать дебрис перед добавлением хлороформа не надо. Сообщение было отредактировано MMM - 12.05.2018 17:01
|
ASDF Постоянный участник |
2. Тризолом можно заливать монослой, только среду отберите по возможности. 3. на 1 лунку 6-ти луночного планшета достаточно 0,5 мл, но какой смысл экономить? Берите 1 мл. 4. Откручивать лизаты перед хлороформом совершенно не обязательно, просто крутаните - сбросить капли с крышек. 5. Это все написано в инструкции к любому тризолу. Почитайте, вреда не будет. |
ASDF Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано ASDF - 10.05.2018 23:05 |
MMM Постоянный участник |
|
ASDF Постоянный участник |
Прекрасно он компатибл. |
MMM Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано MMM - 11.05.2018 05:04
|
ASDF Постоянный участник |
|
MMM Постоянный участник |
|
ASDF Постоянный участник |
Но этим никто не заморачивается, итог - выход РНК в разы меньше, чем просто тризолом. А по поводу пластика, вам шашечки или ехать? Никаких проблем с выделением НК из монослоя при залитии его тризолом не наблюдается в принципе. |
MMM Постоянный участник |
(ASDF @ 12.05.2018 15:30) Есть один момент, который как то в стороне остается - что бы 100% (как тризолом) лизировать клетки ГТЦ их нужно с керамическими бусами перетрясти в гомогенизаторе. (например кайджин так и пишет об этом в инструкции мелкими буквами).Но этим никто не заморачивается, итог - выход РНК в разы меньше, чем просто тризолом. Вам видимо кто-то на мозоль наступил с ГТЦ. Замечу, кстати, мне не нравится как Тризол лизирует материал. РНК-реагент (предыдущая версия хомченского, предназначенная только для РНК) гораздо симпатичнее в этом смысле. И вы не внимательны. Никто не предлагал отказываться от Тризола в пользу ГТЦ. ГТЦ с ЭДТА предлагалось использовать только для снятия клеток с пластика(дабы избежать попадания пластика в материал), а затем лизис Тризолом, его никто не отменял. (ASDF @ 12.05.2018 15:30) А по поводу пластика, вам шашечки или ехать? Никаких проблем с выделением НК из монослоя при залитии его тризолом не наблюдается в принципе. Вы разве не поняли, что мне и ехать, и с шашечками. Не люблю когда в материал попадает инородная бесконтрольная полимерная чача. Насчет того что не наблюдается в принципе. Это по-моему художественная гипербола вашей внутренней уверености в этом. У меня нет оснований подвергать сомнению вашу внутреннюю убежденность, но принципы, согласно которым примесь полистирола в тризоле не влияет на выделение РНК мне неизвестны. |
ship Постоянный участник Moscow |
(MMM @ 12.05.2018 13:54) ГТЦ с ЭДТА предлагалось использовать только для снятия клеток с пластика(дабы избежать попадания пластика в материал), а затем лизис Тризолом, его никто не отменял. Это что за бред? снятие клеток ГТЦ? Что вообще тут развели про РНК в двух тема за ахинею. Все прекрасно выделяется и тризолом и ГТЦ, и выбор методов и подходов опрелделяется типом образцов, его количеством, нужной фракцией РНК, и тп. Выход в ГТЦ никак не на порядок меньше чем с тризолом. Откуда инфа про стеклянные бусы для лизиса? ГТЦ все прекрасно лизирует если и так, ну можно лизат через шприц прогнать. На дворе 21 век, а вы тут опять про самопалные буферы и методы на коленке. Выделять надо китами, если есть возможность. Если дорого или очень много образцов - то пожалуйств, можно тризолом или подобным реагентами. Евроген вон продает такой реагент, почитайте протокол как клетки лизировать. Можно прям в чашке. Если стремно - то трипсином снять и открутить. то же самое в китах qiagen, хотите Qiazol заливайте в чашку, хотите трипсинизируйте. |
MMM Постоянный участник |
(ship @ 12.05.2018 17:37) Почему бред? |
ASDF Постоянный участник |
Лично испытаны практически все киадженовские РНК киты, несколько Зиморесечей и т.д. Так вот самая эффективная по чистоте и выходу схема это лизис клеток тризолом, а затем водную фазу на колонку из RNeasy или любую другую (это кстати есть у них такой кит - для жирных тканей). Что бы убедиться в этом достаточно просто выделить РНК из двух одинаковых матрасов тризолом и просто китом и измерить РНК на Qubit. Судя по комментариям никто из участников темы этого не делал, а я делал и поэтому пишу с такой уверенностью. Возвращаясь к сути вопроса: ТС спросил можно ли ему заливать монослой тризолом, я ему рекомендую - не просто можно, а нужно )). |
ASDF Постоянный участник |
(ship @ 12.05.2018 17:37) Это что за бред? снятие клеток ГТЦ? Что вообще тут развели про РНК в двух тема за ахинею. Все прекрасно выделяется и тризолом и ГТЦ, и выбор методов и подходов опрелделяется типом образцов, его количеством, нужной фракцией РНК, и тп. Выход в ГТЦ никак не на порядок меньше чем с тризолом. Откуда инфа про стеклянные бусы для лизиса? ГТЦ все прекрасно лизирует если и так, ну можно лизат через шприц прогнать. На дворе 21 век, а вы тут опять про самопалные буферы и методы на коленке. Выделять надо китами, если есть возможность. Если дорого или очень много образцов - то пожалуйств, можно тризолом или подобным реагентами. Евроген вон продает такой реагент, почитайте протокол как клетки лизировать. Можно прям в чашке. Если стремно - то трипсином снять и открутить. то же самое в китах qiagen, хотите Qiazol заливайте в чашку, хотите трипсинизируйте. здесь речь как раз о самых фирменных китах и растворах. Про то, что для эффективного выделения РНК пробы нужно гомогенизировать, написано в инструкции RNeasy. Может быть с бусами я немного перебрал (я при любом таком случае использую TissueLyser ))), но дополнительный степ гомогенизирования в лизирующем буфере просто необходим и об этом написано в инструкции. Я только отметил, что на этот момент обычно забивают. |
MMM Постоянный участник |
|
ksm Постоянный участник |
лишние этапы промывок вредят РНК профилю, т.к. с течением времени вследствие стресса клетки, адаптируясь к стрессу (любому), бутут менять профиль РНК, что-то разрушат, что-то наситезируют заново. Время - 5-10 мин. |
MMM Постоянный участник |
(ksm @ 13.05.2018 15:16) МММ, объясните, пожалуйста, каким образом в присутствии фенола денатурированные им ферменты могут становиться "просто агрессивными"? Это вопрос не ко мне а к Еврогену. (ksm @ 13.05.2018 15:16) лишние этапы промывок вредят РНК профилю, т.к. с течением времени вследствие стресса клетки, адаптируясь к стрессу (любому), бутут менять профиль РНК, что-то разрушат, что-то наситезируют заново. Время - 5-10 мин. Это конечно вопрос философский. Начиная с того, а на сколько вообще культура клеток в чашке адекватна клеткам какого либо органа или организма. Но мое мнение такое: если вы гоняетесь за эффектами, которые нивелируются 3' обработкой в трипсин/версене, то такие эффекты достойны внимания в последнюю очередь. |
ksm Постоянный участник |
вопрос ни разу не философский. адекватна, если с ней адекватно работать. "Но мое мнение такое: если вы гоняетесь за эффектами, которые нивелируются 3' обработкой в трипсин/версене, то такие эффекты достойны внимания в последнюю очередь." ну вот человек вам про вирусную РНК пишет выше. "Это вопрос не ко мне а к Еврогену." - не нашел у Еврогена ничего об этом Сообщение было отредактировано ksm - 13.05.2018 17:05 |
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(ksm @ 13.05.2018 12:16) МММ, объясните, пожалуйста, каким образом в присутствии фенола денатурированные им ферменты могут становиться "просто агрессивными"? лишние этапы промывок вредят РНК профилю, т.к. с течением времени вследствие стресса клетки, адаптируясь к стрессу (любому), бутут менять профиль РНК, что-то разрушат, что-то наситезируют заново. Время - 5-10 мин. А Вы разве не на льду с РНКой работаете? |
ksm Постоянный участник |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(ksm @ 14.05.2018 15:20) Немного неверно поставил вопрос. Вы культуру не охлаждаете, чтобы остановить метаболизм РНК и замедлить деградацию РНКазами? |
ksm Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано ksm - 14.05.2018 22:10 |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |