Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Результаты поиска -- Найденные сообщения --

страницы (15):  1 2 3 > » 

интерпретация SNP
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 18.07.2019 16:57  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1761580  |  Ответов: 11  |  Просмотров: 1 967
Можно начать с https://www.snpedia.com/index.php/Rs1393350
Оттуда идти по ссылкам, и самостоятельно оценить, что вам подходит.

Как купить за границей что-то замороженное и его привезти, чтобы оно выжило
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 27.05.2019 16:25  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1755082  |  Ответов: 24  |  Просмотров: 1 078
Если уже размороженное, то можно так: посеять во флакон; заполнить флакон средой до верху; положить в чемодан, в тряпки, чтобы не замерзло.

как найти источник легионеллы?
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 21.05.2019 07:23  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1754285  |  Ответов: 3  |  Просмотров: 536
Легионеллы не передаются от человека к человеку.
Надо искать кондиционер, фонтан или какой-либо похожий источник, где образуются капельки воды, которые можно вдохнуть.

Как определить положение мутации в гене?
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 17.05.2019 10:30  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1753858  |  Ответов: 24  |  Просмотров: 12 727
Отсутствие id значит, что такого варианта нет в dbSNP build 142, судя по тем строкам, которые id имеют.
Нет ли вероятности, что это строки без id соответствуют каким-то артефактам секвенирования? Что значит последний столбец? Почему цифры более низкие?

Как долго живут клетки крови
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 16.05.2019 15:19  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1753774  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 842
(che14 @ 16.05.2019 11:01)
Ссылка на исходное сообщение  Давайте я уточню. Я физик, у меня в лаборатории нет ни ламинара, ни CO2-инкубатора, ни даже термостата и центрифуги. Зато у меня есть микроскоп. И я хочу посмотреть на живые клетки в микроскоп. Я спрашиваю у биологов, не могли бы они дать мне клетки. Биологи говорят: мы тебе их дадим, но ты ведь не сможешь с ними работать! Без CO2 они сразу умрут. В комнатной температуре они сразу умрут. Без среды они сразу умрут. Когда я спрашиваю сколько минут длиться "сразу" - мне не отвечают. Так поясните, чтобы работать с лейкоциты и тромбоцитами крови человека нужны все эти поразительные устройства или нет?

Кровь можно добывать из своего пальца. Капните свою кровь и чуток гепарина на стекло и смотрите себе на здоровье, пока капля не подсохнет.
Картина будет такой:
https://www.youtube.com/watch?v=YMmSbKM2egk

Как долго живут клетки крови
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 15.05.2019 12:51  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1753629  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 842
(error09 @ 15.05.2019 13:21)
Ссылка на исходное сообщение  а как трансформировать епштейн баром в долгосрочную не пробовали

Зачем? если цель хромосомные препараты?

Как долго живут клетки крови
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 14.05.2019 17:45  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1753459  |  Ответов: 16  |  Просмотров: 842
(che14 @ 14.05.2019 12:25)
Ссылка на исходное сообщение  ... В первую очередь интересуют лейкоциты и тромбоциты. ...

Из периферической крови, стоявшей в пробирках с гепарином 2 дня при комнатной температуре, неоднократно получали жизнеспособную краткосрочную культуру лимфоцитов для получения препаратов метафазных хромосом. Результаты были лучше, если кровь не хранили в холодильнике.

Коррекция параметров ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 18.04.2019 14:53  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1750673  |  Ответов: 20  |  Просмотров: 1 933
(Настя14145 @ 18.04.2019 12:25)
Ссылка на исходное сообщение  Да, развела праймеры, снизила концентрацию магния и ДНК взяла в разведении и снизила количество Taq. Также попробовала снизить температуру отжига до 52 и 48, и убрала градиент. При 52 проявились еле заметные бэнды на нужной длине, на 48, к сожалению, ничего.

Ну значит, вы на правильном пути.
Поднимите температуру до 58, как выше советуют.
Шмер-то исчез? Или вы после здешней ругани нам картинок больше не предъявите?

Как пишутся названия генов и белков?
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 18.04.2019 11:21  |  Научный языкНаучный язык  |  link: #1750641  |  Ответов: 145  |  Просмотров: 25 036
Не туда нажала . Тут давно резвятся спамеры...

Коррекция параметров ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 18.04.2019 11:19  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1750640  |  Ответов: 20  |  Просмотров: 1 933
(Настя14145 @ 18.04.2019 12:05)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день. Хорошо, попробую, спасибо за совет!

А что-нибудь уже пробовали из множества советов бывалых?

Третий уровень компактизации хроматина
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 18.04.2019 09:15  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1750631  |  Ответов: 3  |  Просмотров: 1 356
Хе-хе, насколько я понимаю, однозначное согласие в научном сообществе есть только по поводу 10 нм структуры хроматина, а уже далее, начиная с 30 нм фибриллы, - споры, ругань, разброд и шатание.

Наверное, нужно запомнить ключевые цифры:
2нм - ДНК,
10 нм - намотано на нуклеосомы,
следующий уровень укладки, видимый (далеко не всегда) в интерфазном ядре при помощи электронный микроскопии - 30 нм,
конечный уровень - примерно 1400 нм в метафазной хромосоме.
Отдельные зоркие индивидуумы в каких-то конкретных объектах видят промежуточный "хромомерный" уровень.


Лично мне нравятся статьи про конденсины и их роль в компактизации митотической хромосомы.
Например, https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(16)30047-2

Вторая картинка у вас из "Молекулярной биологии клетки" Альбертса. Она есть на русском языке: http://chembaby.com/wp-content/uploads/2015/12/MBK1.pdf (это большой pdf-файл.)

Ну и еще: жизнь хроматина в интерфазном ядре и организация митотической хромосомы - это два разных научных направления .

Коррекция параметров ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 16.04.2019 14:36  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1750389  |  Ответов: 20  |  Просмотров: 1 933
(kakakaka @ 16.04.2019 15:32)
Ссылка на исходное сообщение  знакычь ттото я акуеваю что праймеры на гин7ом коровы ни лажатся  eek.gif  confused.gif

Зато на козу легло, как влитое.

Коррекция параметров ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 16.04.2019 13:23  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1750371  |  Ответов: 20  |  Просмотров: 1 933
(Настя14145 @ 16.04.2019 12:29)
Ссылка на исходное сообщение  ....Длина продукта 422 bp.

Не знаю, как вам удаётся что-то генотипировать, если ваши праймеры залипают в двух местах и дают продукт одинаковой длины? Это ведь у вас коза?

Да, и замечание про качество ДНК дельное. Чем выделяете ДНК?

Коррекция параметров ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 15.04.2019 23:56  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1750306  |  Ответов: 20  |  Просмотров: 1 933
Праймеров слишком много, IMHO.
Если я не ошиблась в прикидках, то чуть ли не 10 раз больше, чем нужно.
И про Mg проверьте, не ли его в буфере.

Температуру отжига снизьте до 60 оС.

Маркер длин нужен при электрофорезе.

Праймеры у вас в двух местах отжигаются у козы, кстати; дают одинаковый продукт по длине. Дупликация там, что ли?

Что запускает деление прокариот?
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 05.04.2019 15:19  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1749140  |  Ответов: 2  |  Просмотров: 986
Возможно, эта статья будет полезной:
Robert L. Size sensors in bacteria, cell cycle control, and size control //Frontiers in microbiology. – 2015. – Т. 6. – С. 515.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4448035/

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 11.03.2019 19:57  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1746579  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
Я не особенный мастер по РНК. Мне кажется, что в ваш бюджет вписывается тризол и его аналоги, с доочисткой на колонках при помощи ДНКазы

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 10.03.2019 17:22  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1746499  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
(Мар00242 @ 07.03.2019 22:23)
...
А по существу вот что, праймеры сами на себя отжигаются, но на мелтинге то пики не от димеров праймеров, то есть, если взять другой набор для выделения, то эти праймеры можно попробовать использовать или это бессмысленно все равно?

IMHO, эти праймеры вам поднимают что-то с геномной ДНК.
IMHO, праймеры плохие и неспецифичные.
Да и по вашим результатам это видно.

Дизайнить праймеры можно и при помощи Primer-Blast, при этом удобно воспользоваться функцией "Pick Primers" в NCBI/Nucleotide, установив длину праймеров до 240 пн.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_017008.4
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_017286

Синтез праймеров стоит 19-20 рублей за букву. Длина олига для ПЦР -- 20-26 букв. То есть, пара праймеров обходится примерно в 1000 рублей (~15$).

Вам еще нужен подходящий маркер длин. Также нужен кит для выделения РНК, в котором предусмотрено удаление геномной ДНК, так как, судя по всему, GAPDH имеет несколько псевдогенов в геноме крысы.

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 07.03.2019 10:29  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1746245  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
Странный дизайн праймеров. И для GAPDH, и для целевого гена.
Почему такой? Почему не задизайнить со 100% идентичностью?
В чём фишка?
Ещё и обратные праймеры для целевого гена и для GAPDH сами на себя неплохо отжигается...
Откуда дровишки?

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 06.03.2019 12:15  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1746152  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
Электрофорез неудачный.
1. По форезу нельзя уверенно сказать, ваши реакции генерируют ампликон одинаковой длины. - вроде бы, да, но, может быть, нет.
2. Нельзя определить его длину. Может он быть длиной 170 букв? Может быть, да; может быть, нет.
3. Нельзя увидеть наличие-отсутствие коротких ампликонов, так как форез "убежал".

Вообще-то, вам нужно прежде всего добиться хорошей обратной транскрипции. То есть получить кДНК, с которой в обычном ПЦР с праймерами на GAPDH вы получите хорошую внятную полосу на геле за 25 циклов.
Решите эту задачу, приступайте к следующей - отладке qPCR. А то у вас война на несколько фронтов.

Еще вопрос по праймерам для qPCR: они идут через интрон ? через стык экзонов? Можно ли ими поднять геномку? Что у них на 3' конце?

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 05.03.2019 10:38  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1746023  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
(Мар00242 @ 04.03.2019 16:22)
Ссылка на исходное сообщение  ....Но с РНК на том же уровне выходят 90 п.н.

А сколько должно быть?

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 02.03.2019 13:56  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1745864  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
Zubr - это не может не радовать smile.gif
Форез в 2,3-2,5% геле, если у вас короткие фрагменты 80-150.

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 02.03.2019 12:25  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1745846  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
(Мар00242 @ 01.03.2019 23:12)
Гель прогнать не успела  shuffle.gif

Прогоните, пожалуйста, электрофорез. Возможно, все эти непонятки генерирует неспецифика, для которой свойственна нестабильность в проявлении.

Общее правило отладки методики - максимально визуализировать происходящее в пробирках на всех возможных этапах.
Выделили РНК - прогнали электрофорез, померяли концентрацию, посмотрели на качество на спектрофотометре.
Прошла ПЦР - прогнали электрофорез, оценили длину продукта, примерное количество ПЦР-продукта, наличие неспецифики.
Все документировать правильно, а не на глазок.

Да, ещё вспомнила. Судя по отчёту, ваш прибор максимально подкручивает чувствительность при чтении сигнала (стоит параметр 10). SYBR вы добавляете при этом в два раза меньше, чем нужно, если я не ошиблась в прикидках. Это, конечно, не источник ваших проблем, но лучше всё же скорректировать

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 02.03.2019 12:12  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1745843  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
(Мар00242 @ 01.03.2019 23:18)
Ссылка на исходное сообщение  А меркаптоэтанол в качестве антиРНКазного средства можно в смесь для обратной транскрипции добавлять?

Нет. Меркаптоэтанол портит ферменты, влияя на дисульфидные связи. Думаю, что обратная траскриптаза тоже попортится.

RNasin не строго обязателен. В принципе вы можете добиться успеха и без него, но иногда будете терять РНК, хотя вроде бы делаете всё, как и в прошлый (успешный) раз.

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 01.03.2019 17:00  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1745798  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
(Мар00242 @ 01.03.2019 16:30)
Ссылка на исходное сообщение  "Как правило, примесь геномной ДНК не влияет на качество синтеза кДНК с использованием олиго (ЭТ)- содержащего праймера" Ребриков Д.В. Применение современных молекулярно-биологических методов для поиска и клонирования полноразмерных нуклеотидных последовательностей кДНК М: 2011. Отсюда и олиго dT.

Пластик был "RNAse-free". Ингибитор РНКаз не использовался confused.gif  из ингибиторов у нас только меркаптоэтанол.

Тоже отвечу цитатой:
"Oligo-dT primers should only be used with intact RNA. Even then the cDNA molecules may be truncated, since the RT enzyme cannot proceed efficiently through highly structured regions. Accordingly, oligo-dT-primed assays should be targeted towards the 3' end of the transcript." Nolan T., Hands R. E., Bustin S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR //Nature protocols. – 2006. – Т. 1. – №. 3. – С. 1559.

Вы уверены, что ваши праймеры отжигаются достаточно близко к polyA-хвосту?

кривая флуоресценции
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 01.03.2019 15:13  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1745788  |  Ответов: 79  |  Просмотров: 2 417
(Мар00242 @ 01.03.2019 16:01)
....
Поэтому получается, что слабое место это выделение РНК (загрязнение ДНК).

Не только загрязнение геномной ДНК.
Еще можно потерять РНК из-за РНКаз. Пластик нужно использовать "RNAse-free". В реакции обратной транскрипции использовать RNasin или другой ингибитор РНКаз.

Повторюсь ещё, что мне кажется неоптимальным использовать oligo_dT. Насколько близки ваши праймеры к полиА-хвосту?
страницы (15):  1 2 3 > »  

Новые сообщения  Есть новые сообщения
Нет новых сообщений  Нет новых сообщений
Нет новых сообщений*  Тема с вашим участием
Горячая тема - новые сообщения  Горячая тема (есть новые сообщений)
Горячая тема - нет новых сообщений  Горячая тема (нет новых сообщений)
Важно - нет новых сообщений  Важная тема
Опрос - есть новые голоса  Опрос — есть новые голоса
Опрос - нет новых голосов  Опрос — нет новых голосов
Опрос -нет новых голосов  Опрос с вашим участием
Объявление  Объявление
Тема закрыта  Закрытая тема
Тема перемещена  Перемещённая тема


Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 23.07.19 09:32
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft