 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Хроматография на колонке -- хроматогр.белков --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
|
Guest IP-штамп: frdDdn48iQfZ2 гость  |
 18.10.2006 18:51
|
 Mac-1Постоянный участник оттуда |
18.10.2006 22:41
Тем, кто меня знает - "доказывать" мне ничего не нужно, а кто не знает - обойдутся и без этого. При необходимости, я всегда готов прислать все требуемое "приватно" любому ПОРЯДОЧНОМУ человеку. Однако, убедительная просьба не светить здесь никаких имен и фамилий. Я уже не говорю, что это является прямым нарушением правил форума (меня тут банили только за то, что я открыто написал одному "я вас знаю"). Вас, что жизнь не научила ничему? Вот возьмет, например, первый Том или Коля2 и стукнут "куда надо" что я здесь "евреев ругаю", пойдут мне комиссии, проверки, а оно мне надо? Напомню, что прецедент тут уже был, причем совсем недавно. ------------------------------- МД, Не обращайте внимания. "Детские вопросы" здесь вызывают "бурю воизмущения" только у таких, для которых форум - это единственный доступный им способ самоутверждения. Чуть перефразируя Уайльда, можно сказать: "Вопросы глупыми не бывают, ответы - бывают"  Вообще-то, не так уж и редко бывает, что "дешево" является следствием именно "качественно". Однако, если вы не хотите подбирать условия для одно-двух стадийного афинного выделения, то конечно, можете пробовать и подобрать комбинацию стандартных методов очистки. Использовать как колонку бюретки, делительные воронки итп вполне можно для большинства препаративных целей, кроме гель-фитрации, но еще удобнее делать колонки из корпусов от шприцев. Обычная вата в воде (буфере) разбухает и забьет колонку, поэтому ее нельзя использовать вместо стекловаты. Для колонок из шприцев и бюреток вместо стекловаты можно (и желательно) использовать несколько кружков (по диаметру шприца/бюретки) грубой ("быстрой") фильтровальной бумаги. Такой же кружок фильтровалки я бы вам порекомендовал положить на верх геля в колонке после ее упаковки. Адаптор для таких колонок вам не нужен, да его и вставить в воронку будет трудно. В этом случае, стекляная трубка отвода краника вполне его заменит (на выходе). Для "входа" возьмите резиновую пробку, подходящую по диаметру к верхнему концу вашей колонки и пробейте в ней небольшую сквозную дырку, через которую можно будет вставить трубочку для подачи буфера или даже просто носик от пипетки, к которому вы можете присоединить эту трубку. Заботится о том, вышел ли сульфат из образца при диализе, вам не стоит: после двух-трех смен по 2-3 часа, его там остается менее 0.1% первоначального количества (можете сами легко подсчитать сколько, исходя из соотношения обьемов и начальной концентрации). Минимальные количества сульфата аммония в образце на хроматографическое разрешение обычно не влияют. Если при диализе активность остается в образце, то либо ваши предположения, что ваш белок - около 10К неправильны, либо он образует комплекс с другими белками или олигомеризуется, т.к. большинство обычных диализных мешков свободно пропускают пептиды и белки до 12-14 Кда, а полностью удерживают только белки с МВ больше 25 кДа. Вы не сказали, какой "сефадекс" (да и вообще какой метод хроматографии) вы собираетесь использовать. Наносить просто "открученую культуральную жидкость" на колонку можно, НО - это зависит от того, какой метод вы собираетесь применить. На афинные сорбенты (вроде тех агароз с красителями, о которых я вам говорил) обычно можно наносить практически любые обьемы культуралки, для других методов есть большие ограничения по поводу количества белка, которое можно на них нанести. Для большинства "связывающих" носителей для "домашних колонок" (типа ионообменника) эфективное фракционирование смеси белков возможно только при 0.5-1 мг белка/мл сорбента, а лучше, еще меньше. Т.е. для фракционирования 500 мл культуралки с концентрацией белка в районе 1 мг/мл вам понадобится колонка не менее с 500 мл смолы. Если же у вас в культуралке содержится триптон (как я упоминал выше), то на 500 мл ионообменника вы сможете успешно фракционировать, скорее всего, не более 50 мл культуралки. Это ограничение действует и для вашего образца, после осаждения и диализа. Т.е. для поллитровой колонки ионообменника вам не стоит на нее наносить больше 500 мг образца (а лучше - не более 250 мг). При фракционировании гель-фильтрацией обьем наносимого образца не должен превышать 2-3% от обьема носителя, при этом вряд ли стоит наносить на поллитровую колонку больше 50 мг образца. Или, примерно 10-15 мл культуралки с триптоном. Вы не обижайтесь, пожалуйста, но вы действительно очень плохо подготовлены для такого типа проэкта, и похоже, сами не полностью это осознаете... И здешние советы вам вряд ли помогут. О "быстро", пожалуй, здесь речи быть не может: если ваш белок - не "счастливое исключение", то я бы сказал, учитывая ваш теперешний уровень подготовки по хроматографии, что работая в одиночку вы провозитесь с очисткой год-полтора (а возможно и дольше). Я бы порекомендавал вам, если это возможно, "завербовать" у вас в лабе, какого-нибудь помощника, имеющего практический опыт по очистке белков (но не рекомбинантных, по тагам).
|
|
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
18.10.2006 23:29
(Tom1 @ 18.10.2006 11:41)  К сожалению универсального способа борьбы с данным явлением в условиях нижкой експрессии целевого белка лично я не знаю наверное Мак-1 знает....Имхо попробовать рехром с с нанесением в 20мМ, если условия позволяют попробовать "повысить" експрессию , опять же если это возможно ( как с рефолдингом???) провести хроматографию в не нативных условиян, однажды мне помогла ( надеюсь что Мак-1 не видит) хроматография на ДЕ после метал-хелата...... Да еще зависит от штамма колей если РеКА - с точечной мутацией т.е. Рек А есть но не активен он как зараза липнет на Никель... Том1, Не знаю я  Увы, у меня нет вообще никакого опыта выделения белков по тагам. Свои белки, (в том числе и рекомбинатные), я всегда выделяю своими моноклонами или рецепторами к ним. Раньше - выделял "на красках" (но не из "лакокрасочного завода" - на триазиновых красителях, которые в Совке, сколько знаю, вроде никогда не выпускались и не применялись) или любым другим методом, кроме "тага". Продолжайте, продолжайте - вы сейчас интересно рассказываете, совсем не так, как когда дело не касается "тага" - уверенно, компетентно, с полным знанием дела! Нет ни - "смотри в Гугле", ни фраз о своем большом "экспиренсe" (да и зачем здесь - сразу видно опыт!), ни ЦУ, вроде "бросить 5 мл смолы в бочку с культуралкой" - одно удовольствие вас слушать! Я и слушаю вас с удовольствием.  И учусь - вовсе не исключаю, что мне в будующем могут и таги понадобится. Вот об этой мутации "РекА" (не ошибся?) - я вообще никогда не слыхал! Теперь знать буду, благодаря вам! И иметь в виду буду!Спасибо! |
|
Spectrometrist Участник |
18.10.2006 23:53
(Mac-1 @ 18.10.2006 00:33) Дорогой Spektrometrist,Я не совсем понял, почему вы выделили слово "опубликованные". Понимаете, давать кому-либо НЕОПУБЛИКОВАННЫЕ данные я не имею права. Так уж ведется в науке, когда выростите и окончите университет - поймете...Моя статья сейчас в печати, я дам вам ссылку на нее немедленно, как появится онлайн (думаю в пределах менее месяца), но может вам в вашу "коллекцию" другие статьи пойдут? Хотите еще? Мало? До чего редкий случай... Невозможно найти ни одной работы... До чего же вы старательно "искали" - действительно "ничего нет"... Извините, все же надоело как-то, нерадивым школьникам искать... Знаете, дорогой Spektrofotometrist, я вам (а также примкнувшему к вашей просьбе первому Тому) окажу услугу, за которую вы мне по гроб жизни будете благодарны! Вы, (а также первый Том) явно не подозреваете, что есть специальный инструмент для поиска статей по интересующим вас вопросам. Называется он "ПабМед" и находится по адресу: Искать тут нужно не по-русски, запаситесь "Промтом"! Переводите, что хотите им на английкий и копируете в поисковую строчку, например "protein complex SDS resistant" , затем "тыц!": Затем можете менять слова, например, вместо "complex" ввести "complexes" (по-английски такое окончание чаще всего обозначает множественное число) итд А свои впечатления от этого можете обсудить на топике (внимание, запаситесь "Промтом" форум английский!): Удачи вам в сдаче выпускных экзаменов! Советую поступать после окончания школы на первый курс биофака! Главное, помните - когда окончите биофак и приступите к работе, то нужно читать учебники и научные журналы, а не мануалы к китам! Большое вам спасибо! Белковая химия действительно не моя область и я искал неправильно. Некоторые ссылки действительно интересны (особенно SNARE complex), многие нет, т.к. использовали x-linking. Буду читать в деталях Мой вопрос был не праздный, так как в последнее время через мои руки прошло несколько проектов (я работаю в аналитической лаборатории), где заказчики настаивали на SDS-resistant complexes или heterodimers и уверенно указывали на диффузные полосы в геле. Но масс спек показал что это обычная лаб грязь - либо примеси белков о которых и не думали, неправильный контроль, антитела и т.д. В доказательства Вестерном, как и в полосы едва ушедшие со старта, мы не верим давно - жизнь, занете, отучила. Отсюда мой скептицизм. P.S. Не хотел, ну да ладно: Хамство и shit-throwing меня не трогают, за время работы в сервисной лаборатории повидал всякого. Но вам должно быть неудобно за такой развязный тон. Своим вопросом я, кажется, не давал вам повода
|
|
Mac-1 Постоянный участник оттуда |
19.10.2006 07:00
(Spectrometrist @ 18.10.2006 16:53) Большое вам спасибо!Белковая химия действительно не моя область и я искал неправильно. Некоторые ссылки действительно интересны (особенно SNARE complex), многие нет, т.к. использовали x-linking. Буду читать в деталях Мой вопрос был не праздный, так как в последнее время через мои руки прошло несколько проектов (я работаю в аналитической лаборатории), где заказчики настаивали на SDS-resistant complexes или heterodimers и уверенно указывали на диффузные полосы в геле. Но масс спек показал что это обычная лаб грязь - либо примеси белков о которых и не думали, неправильный контроль, антитела и т.д. В доказательства Вестерном, как и в полосы едва ушедшие со старта, мы не верим давно - жизнь, занете, отучила. Отсюда мой скептицизм. P.S. Не хотел, ну да ладно: Хамство и shit-throwing меня не трогают, за время работы в сервисной лаборатории повидал всякого. Но вам должно быть неудобно за такой развязный тон. Своим вопросом я, кажется, не давал вам повода Дорогой Спектрометрист, Вам бы не стоило проявлять свой скептицизм так демонстративно, тем более, если по вашим словам белковая химия - не ваша область = у вас не хватает необходимых знаний. Уж во всяком случае, вы просто должны знать еще один из подобных примеров устойчивости белковых комплексов к денатурации (в т.ч. и СДС) - это комплексы авидина с биотиноподобными структурами. И, честное слово, я просто не представляю, как можно искать "неправильно" - достаточно ведь просто набрать то, что вы ищите в Гугле или в ПабМеде... Вообще-то, эффект повышеной стабилизации белковой структуры (=устойчивости к денатурации) очень хорошо известен для комплексов рецептор-лиганд, фермент-субстрат, комплексов многих адгезивных белков итп. Т.е. частично денатурируя окружение активного центра адгезивной молекулы СДС "стабилизирует его" и не дает этому комплексу распастся: "SDS with its detergent ability removes adsorbed protein but, being at the same time a strong denaturing agent, it is able to transform adsorbed molecules into an irreversibly bound nonelutable form." Образование СДС-устойчивых комплексов и/или олигомеров еще не значит, что эти комплексы являются также одновременно СДС- И ТЕРМОустойчивыми (я вам дал ссылки примерно на 3-4 статьи, где это подробно обсуждается). Комбинация СДС + 100оС намного сильнее денатурирует белок чем СДС при комнатной температуре. В очень грубом приближении можно сказать, что сам СДС не денатурирует белок, а только снижает температуру его тепловой денатурации и повышает энергию "ту-стэйт перехода" (в случае мочевины это высказывание полностью справедливо, с СДС - несколько сложнее). Так что, если вы, приготовляя образцы для заказчиков (или сами заказчики, приготовляя образцы для вас) их КАК ОБЫЧНО кипятили, то в геле СДС-устойчивые комплексы могут и не присутствовать. Что вовсе не означает, что их нет, или они не образуются. Об этом я, кстати, упоминал в своем постинге выше. Если вы хотите искать в геле СДС-устойчивые комплексы вы не должны подвергать свои образцы нагреву. Образцы можно готовить инкубируя с СДС 5 мин при 100оС или 10 мин при 56оС или 3-4 часа при 37оС или ночь при комнатной т. При исследовании таких комплексов стоит проверять ВСЕ эти температуры. Кстати, есть не только комплексы, но и просто индивидуальные белки, которые нельзя полностью денатурировать только одним СДС в абсолютно любой канцентрации - это белки с большим числом внутримолекулярных дисульфидных связей в отсутсвии ДТТ или меркаптоэтанола. Скажем, невосстановленый фибриноген в присутствии только СДС даст вам "диффузную полосу, едва отошедшую от старта". Диффузность обусловлена неполным и поэтому неоднородным присоединением СДС к полуденатурированной молекуле. На практике, подобные невосстановаленные белки разгоняют в комбинации 5% СДС + 6М мочевина в образце + 6М мочевина в САМОМ геле. Так что, обнаружив такие полосы в вашем геле всегда есть смысл проверить будут ли они присутствовать и в 6М мочевине. ----- Ваш пост, написаный в достаточно агрессивном стиле, с подчеркиванием "опубликованным", "подмигиваниями" и подначками (а что вы ДЕЙСТВИТЕЛЬНО не в состоянии "найти информацию, по вышеприведенным причинам я понял именно, как "подначку") я расценил именно как "Хамство и shit-throwing". Причем не я один. Наш друг Том1 понял его точно также, за что вас и поблагодарил, если вы это не заметили. Поэтому я вам и ответил в соответвующем стиле. Однако, если это было просто недоразумение, и вы, набирая тот текст, совершенно не имели в виду того, как его можно истолковать и понять, я искренне прошу у вас прощения за весь этот свой стеб. И буду рад, если смог чем-то вам помочь! Желаю вам удачи!
|
|
Spectrometrist Участник |
19.10.2006 16:10
(Mac-1 @ 19.10.2006 08:00) Дорогой Спектрометрист,Вам бы не стоило проявлять свой скептицизм так демонстративно, тем более, если по вашим словам белковая химия - не ваша область = у вас не хватает необходимых знаний. ----- Ваш пост, написаный в достаточно агрессивном стиле, с подчеркиванием "опубликованным", "подмигиваниями" и подначками (а что вы ДЕЙСТВИТЕЛЬНО не в состоянии "найти информацию, по вышеприведенным причинам я понял именно, как "подначку") я расценил именно как "Хамство и shit-throwing". Причем не я один. Наш друг Том1 понял его точно также, за что вас и поблагодарил, если вы это не заметили. Поэтому я вам и ответил в соответвующем стиле. Однако, если это было просто недоразумение, и вы, набирая тот текст, совершенно не имели в виду того, как его можно истолковать и понять, я искренне прошу у вас прощения за весь этот свой стеб. И буду рад, если смог чем-то вам помочь! Желаю вам удачи! Еще раз большое спасибо! Меня как раз интересовало бы не иметь таких комплексов, поэтому я всегда рекоммендую стандартный Лэммли с кипячением - кроме случаев, когда антитела "текут" с колонки, а нужно разбиратся с низкомолекулярной областью в 20-40 кДа. Тогда дешевле их держать невосстановленными и "убить" высокомолекуларную область > 150 кДа В поиске я не искал key word "complexes" и смотрел в основном протеомные журналы, так как ясно что в каких либо условиях комплексы могут существовать, но меня интересовало видят ли люди их массово в, например, 2D gels - и похоже что нет. Я внимательно прочитаю рекомендованные Вами ссылки, м.б. увижу "знакомые" белки и тогда мы посмотрим в LC MS/MS runs подробнее - а вернее, полуколичественно. Низкомолекулярные белки часто видны и в высоких массах (хвостят'с), но мы можем поглядеть, вдруг сигнал их пептидов "внезапно" возрос. Кстати, в постингах я никогда не использую смайлис или другие "подмигивания" и я некого не знаю на molbiol.ru, ни лично, ни виртуально. Я подчеркнул "опубликованные" данные в оригинальном постинге только потому что хотел прочитать Материалы и Методы с деталями эксперимента и посмотреть картинки гелей, больше ничего. Еше раз спасибо за помощь и я рад что недоразумение разрешилось.
|
|
Guest IP-штамп: frdDdn48iQfZ2 гость |
20.10.2006 03:15
Аля в пробирке качаете и даете время связаться или еще как? |
|
Guest IP-штамп: frdDdn48iQfZ2 гость |
20.10.2006 03:16
Спасибо. |
|
guest: Oleg IP-штамп: frFNQ1Yb4qZoo гость |
20.10.2006 22:16
(Guest @ 18.10.2006 02:39) Уважаемые Господа-Товарищи, те которые выделяли белки прямо с рождения и еще раньше..Помогите,пожалуйста... У меня вопрос почему в методе по поводу выделения гистидиновых белков на Ni-NTA в качестве буфера указан PBS и что случится если я заменю его на Tris? Чаще всего все нормально. Хотя был случай, когда белок, не садящийся на колонку в трисе, сел с фосфатным буфером. разумеется, элюировался он в низкой концентрации имидазола с кучей грязи. |
|
malms |
06.06.2014 10:04
Огромная кладовая книг по хроматографии |
|
watchesbiz Постоянный участник |
 27.11.2021 15:47
|
|
watchesonline89 Постоянный участник |
28.12.2022 10:34
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.